Hücre içi Komşu maruz kalan hücreler, apoptotik hücre ölümü ile etkileşim yoluyla canlı hücreler İndüklenen sinyal olaylarının tanımlanması

Bu prosedürün genel amacı, yakındaki ölü hücrelerle fiziksel etkileşimlerini takiben sinyal olaylarının neden olduğu ve canlı yanıt veren hücreleri tanımlamaktır. Bu yöntem, hücre biyolojisi, patoloji ve fizyoloji alanlarında, ölü veya ölmekte olan hücrelerin canlı komşuları üzerindeki etkisi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, basit ve ucuz olması ve apoptoz geçiren komşu hücrelerle etkileşimlerini takiben canlı hücrelerde indüklenen biyolojik etkileri incelemek için uygulanabilmesidir.

Tekniği gösteren, laboratuvarımda bir teknisyen olan Lanfei Feng olacak. BUNPT hücrelerini 100 milimetre vakumlu gaz plazma ile muamele edilmiş doku kültürü kaplarına geçirdikten sonra bu işleme başlamak için, bunları A kültür ortamında birleşene kadar büyütün ve 37 santigrat derecede nemlendirilmiş %5 karbondioksit atmosferinde büyütün. Bundan sonra, yapışan hücre tek tabakasını kültür ortamı B ile üç kez durulayın.Ardından, hücreleri, seçici olmayan bir protein kinaz inhibitörü olan staurosporin içeren kültür ortamı B'de 37 santigrat derecede 3 saat inkübe ederek apoptozu indükleyin.

3 saat sonra, tek tabakadan ayrılmış yüzen apoptotik hücreleri içeren ortamı toplayın. Daha sonra, bu ortamı 500 kez G'de on dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı atın, peleti yapışkan hücrelere geri eklemeden önce kültür ortamı B ile üç kez yıkayın. Bu yıkama adımını takiben, 1X kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'ye 5 milimolar EDTA ekleyerek kalan yapışık hücreleri ayırın.

Ayrılmış apoptotik hücreleri içeren ortamı toplayın ve yüzen apoptotik hücrelerle birlikte ayrılmış hücreleri steril bir 15 mililitre polistiren santrifüj tüpüne koyun. Daha sonra apoptotik hücreleri 500 x G'de on dakika santrifüjleme ile üç kez yıkayın, ardından yıkama başına on mililitre 1X kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden süspansiyon yapın. Son yıkamadan sonra, apoptotik hücreleri, yanıt veren hücreleri uyarmak için kullanmadan önce, mililitre başına 5x10 ^ 6 hücrede taze kültür ortamı B'de askıya alın.

Alternatif olarak, yıkanmış apoptotik hücreleri 30 dakika boyunca 1X DPBS'de 0.4 paraformaldehit içinde sabitleyin, daha sonra kültür ortamı B ile üç kez yıkayın ve yanıt veren hücreleri uyarmak için kullanmadan önce mililitre başına 5x10 ^ 6 hücrede askıya alın. BUNPT hücrelerini 100 milimetre çapında steril polistiren vakumlu gaz plazma ile muamele edilmiş doku kültürü kaplarına geçirdikten sonra, izin verilen koşullar altında birleşecek ve nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferine kadar büyütün. Daha sonra yapışkan hücre tek tabakasını, durulama başına 10 mL kültür ortamı B ile üç kez durulayın.

Daha sonra, 1X kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'ye 5 mM EDTA ekleyerek hücreleri ayırın. Ayrılan hücreleri EDTA içeren ortamdan toplayın ve hücre süspansiyonunu steril bir 15 mL polistiren santrifüj tüpüne ekleyin. Daha sonra, hücreleri 500 kez G'de on dakika santrifüjleme ve yıkama başına 10 mL kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS'de yeniden süspansiyon yoluyla üç kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, hücreleri mililitre başına 5x10 ^ 6 hücrede taze kültür ortamı B'de askıya alın. Bunu takiben, hücreleri bir su banyosunda 45 dakika boyunca 70 santigrat dereceye ısıtarak nekrozu indükleyin ve bu hücre süspansiyonunu her on dakikada bir hafifçe girdaplayın. Nekrozun indüksiyonundan sonra, hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde iki saat inkübe edin ve hücre süspansiyonunu her 15 dakikada bir hafifçe girdap

Bu prosedürde, BUNPT hücrelerini, yaklaşık% 85 birleşme elde edene kadar, izin verilen koşullar altında steril 100 milimetre doku kültürü kaplarında büyütün. Daha sonra, kültür ortamı A'yı aspire edin ve hücreleri durulama başına 10 mL kültür ortamı B ile üç kez durulayın. Daha sonra serum, sessizliği indüklemek için hücreleri, izin verilmeyen koşullar altında nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde 18 ila 24 saat boyunca kültür ortamı B'de aç bırakın.

Bir sonraki prosedür için altı deneysel koşul için birleşik BUNPT hücrelerinin ayrı bir doku kültürü kabını etiketleyin. Şimdi, hareketsiz BUNPT yanıtlayıcı hücrelerinin önceden etiketlenmiş tabaklarından kültür ortamı B'yi aspire edin. 100 milimetrelik tabakları farklı koşullarda hazırlamak için, hücresiz kültür ortamı B'den iki mL, kültür ortamı B'de mililitre başına 5X10^6 hücrede apoptotik hücre süspansiyonu veya kültür ortamında mL başına 5X10^6 hücrede nekrotik hücre süspansiyonu ekleyin. 10X10 ^ 6 hücre içeren birleşik 100 milimetre çanak.

Bulaşıkları yavaşça döndürün. Daha sonra nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede inkübe edin. 30 dakika sonra, kültür kabının ön etiketlemesine göre, yanıt hücrelerini araç veya 15 nMOL EGF ile uyarın.

Hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit atmosferinde 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, beş milimetre buz gibi soğuk DPBS ekleyerek ölü hücreleri yıkayın. Çanağı döndürün ve yıkama sıvısını aspire edin.

Yıkamayı üç kez tekrarlayın. Ardından, daha sonraki işlemler için yanıtlayıcı hücre kaplarını hemen buzun üzerine yerleştirin. Bu şekil, hareketsiz BUNPT yanıtlayıcılarının 30 dakika boyunca apoptotik hücrelere maruz kalmasının GSK3 alfa beta'nın bazal fosforilasyonunu güçlü bir şekilde inhibe ettiğini göstermektedir.

BUNPT yanıtlayıcıları ve apoptotik hücreler arasındaki fiziksel etkileşimi önlemek için, BUNPT yanıtlayıcıları geçirgen bir destek sistemi içinde büyütüldü ve apoptotik hedeflerden 0.4 mikron polikarbonat membran ile ayrıldı. BUNPT yanıtlayıcıları ve apoptotik hücreler arasındaki fiziksel etkileşimin önlenmesi, apoptotik hedeflerin GSK3 alfa beta'nın fosforilasyonunu inhibe etme yeteneğini ortadan kaldırdı. Fagositozun rolünü değerlendirmek için, ölü hücrelerin fagositik alımını önlemek için hücre iskeleti inhibitörü Cytochalasin D kullanıldı.

Apoptotik hücrelere yanıt olarak GSK3 alfa beta'nın fosforilasyonunun inhibisyonu, fagositoz yokluğunda meydana geldi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, jel elektroforezi ve immünoblotlama için gereken süre hariç, uygun şekilde yapılırsa 4-6 saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bir uyaran olarak çözünür bir ligandın aksine hücresel bir süspansiyonun kullanılmasının birkaç doğal ve büyük ölçüde kaçınılmaz deneysel engel oluşturduğunu hatırlamak önemlidir.

Aynı prosedürü kullanarak, yakındaki ölü hücrelerle etkileşimlerini takiben canlı yanıt veren hücrelerde indüklenen sinyal olaylarının işlevsel sonuçlarını belirlemek için hayatta kalma veya proliferasyon veya hücre büyümesi gibi diğer hücre işlevleri incelenebilir. Bu videoyu izledikten sonra, yakındaki ölü hücrelerle fiziksel etkileşimlerini takiben canlı yanıt veren hücrelerde indüklenen belirli sinyal olaylarının nasıl tanımlanacağını iyi anlamış olmalısınız.