Name: Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin yüksek çözünürlüklü solunum ölçümüyle mitokondrial oksijen tüketimini değerlendirmeyi. Bu hassas yöntem, bütün veya geçirgen hücrelerde mitokondrial disfonksiyonu araştırmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (Grant nº 32003B_127619) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür, insan hepatomu HepG2 hücreleri 6 cm 25 bir inkübatör (% 5 CO, 37 ° C &#39;de,% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren Dulbecco Değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içinde 2 hücre kültürü şişeleri 2,% 95 hava) (ekim yoğunluğu: 1 x 10 6 hücre başına 25 cm 2 hücre kültürü şişesi, 37 ° C inkübatör inkübasyon süresi: 48 saat, confluency hücre yoğunluğu: 25 cm başına 4-5 x 10 6 hücre 2 hücre kültürü şişesi). </li><li> Hücreler% 90,% 95 konfluent olduğunda deneyleri. </li></ol> Polarografik Oksijen Sensörleri 2. Yüksek çözünürlüklü Solunum Kalibrasyon <ol><li> Pipet 2.1 bir Oksigraf odası içine solunum ml tampon sürekli kararlı bir oksijen akışının sinyaline kadar 1 saat süre ile 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak tampon karışmayapolarografik oksijen sensörü elde edilir. NOT: Her Oksigraf odası ölçü oksijen konsantrasyonu içinde Polarografik oksijen elektrotları ve her odasının içinde oksijen tüketimini (akı) hesaplayın. oksijen konsantrasyonu ve oksijen tüketim oranları (akı) veri toplama ve analiz yazılımı kullanarak bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterilir. </li><li> Üreticinin protokollerine 14&#39;e göre polarografik oksijen sensörünün bir hava kalibrasyonunu gerçekleştirin. Not: hava doygunluğu deney sıcaklığında ortam solunum ortam ve oksijen konsantrasyonunda polarografik oksijen sensörlerinin kalibrasyonu yalnızca günde bir kez sabah gerçekleştirilir. Daha sonra ortam odası ve yeni bir solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline hücrelerden çıkarılabilir bir Oksigraf bölmeye ilave edilir ve solunum hızları ölçülür. İlk deneyin ardından, oda yıkanabilir ve deneyler ilave serisi t gerçekleştirilebilirDaha fazla kalibrasyon olmadan aynı bölme. </li></ol> Yapışık hücreler, Sayma Hücreleri 3. trypsinization <ol><li> Deney gününde, 25 cm 2 hücre kültür şişesi DMEM aspire. </li><li> fosfat tamponlu tuzlu su, 5 ml (PBS) ile kültür şişelerinde hücre kültürü tek tabaka durulayın. </li><li> Pipet 0.5 kültür şişelerinde hücre tek içine (37 ° C su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye önceden ısıtılmış) Tripsin çözeltisi 25 mg / ml ile yıkanır ve bir inkübatör (% 5 CO2 içinde 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe % 95 hava). </li><li> DMEM hücre kültür şişesi içinde müstakil hücreler içine,% 10 FBS ihtiva eden ve pipetleme hücrelerin süspansiyonu Pipet 5 mi. </li><li> Aktarım, oda sıcaklığında 350 xg 5 dakika boyunca 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj hücreler yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve süpernatantı süzün. </li><li> Solunum tamponu 13 (t mümkün 1) 1 ml hücre pelletini. </li><l<html> i&gt; hücre sayacı kullanılarak hücre sayımı, 1 x 10 6 hücre / ml&#39;lik bir son yoğunluğa solunum tampon bunları tekrar süspansiyon. hücresel solunum oranları hücre sayısı normalize olacağından, doğru ve kesin hücre sayacı ile hücreleri saymak. </li></ol> 4. Yüksek çözünürlüklü Solunum <ol><li> Hava kalibrasyon (sadece günde bir kez uygulandı, 2.1-2.2 adım) eklendikten sonra, Oksigraf bir bölmeden solunum orta aspire ve odanın adım 3,7 hücre süspansiyonu (1 x 10 6 hücre / ml) 2.1 ml. </li><li> durdurucunun sokulmasıyla Oksigraf odası kapatın. </li><li> Sürekli 37 ° C &#39;de hazne (700 rpm) içinde mevcut bir manyetik karıştırma çubuğu kullanılarak hücreler ilave edin ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: oksijen konsantrasyonu ve oksijen akı sinyal veri toplama ve analizi için yazılım kullanan bir bilgisayarda çevrimiçi gerçek zamanlı gösterildis = &quot;xref&quot;&gt; 14. </li><li> Daha sonra, aşağıdaki protokollerini kullanarak stoper titanyum enjeksiyon portu üzerinden mitokondriyal solunum için alt tabakaların ve inhibitörlerin enjekte edin. </li></ol> Respirometrik tarafından sağlam hücrelerde 5. Digitonin Titrasyon <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> bir şırınga kullanılarak odası stoper titanyum enjeksiyon portu aracılığıyla hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilene kadar 5-10 dakika hücresel solunum kayıt . NOT: Aşağıdaki adımlarda tüm enjeksiyonlar şırıngalar kullanılarak stoper titanyum enjeksiyon portları aracılığıyla yapılmaktadır. rotenone eklenmesi isteğe bağlıdır (ters elektron akışı engeller) ve digitonin titrasyon deneyleri için göz ardı edilebilir, bakınız6.3 adım. </li><li> Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Oksigraf odasına 2 mM digitonin (2 uM) 2 ul enjekte edilir ve istikrarlı bir oksijen sinyali elde edilene kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Yine Digitonin Oksigraf odası içine 2 mm kadar 2 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen sinyali elde edilinceye kadar 2-5 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: hücrelerine digitonin Basamakları eklenmesi hücresel oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır. </li><li> odasına 2 mM digitonin kademeli (2-4 uM her adımı) 2-4 ul enjekte devam edin. Her adımdan sonra, 2-5 m hücresel solunum kayıtistikrarlı bir oksijen akı sinyali elde edilinceye kadar içinde. NOT: Oksijen akı sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve digitonin daha enjeksiyonları solunum oranını artırmak olmadığında digitonin enjekte durdurun. okuyucular adım 6.2 ve deneyler için aşağıdaki protokollerden 7.2 kendi reaktifleri ve kullanım elde edilen optimal digitonin konsantrasyonu kullanılarak kendi laboratuarlarında optimal digitonin konsantrasyonunu belirlemek gerekir. </li></ol> Mitokondriyal Dış Zar Bütünlüğü 6. Değerlendirme: Sitokrom C <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> Hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) ihtiva eden Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği. </li><li> Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte edilir ve hücresel Respirat kayıtsabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca iyon. </li><li> Oksigraf odası içine 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. NOT: hücrelerine ADP eklenmesi karmaşık I teşvik ve oksijen tüketiminde artışa neden ve oksijen akı sinyali artırmak ve stabilize edecek olacaktır. </li><li> Oksigraf odası içine 4 mM sitokrom c (10 uM) ve 5 ul enjekte edilir ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar, 5-10 dakika boyunca hücresel solunum kaydedin. </li><li> Son olarak, 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekte etmek ve sabit bir oksijen akışı sinyali elde edilinceye kadar hücresel solunum kaydedin. </li></ol> 7. Maksimal ADP ile uyarılmış Solunum permeabilize HepG2 Hücrelerinin (Eyalet 3) <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın.</li><li> Hücre süspansiyonu içeren Oksigraf odası içine 8 mM digitonin (8 uM) 2 ul enjekte edilir ve 5 dakika süreyle hücre geçirgenliği. </li><li> malat 0.8 M (5 mM), 12.5 ul Oksigraf odası içine glutamat 2 M (10 mM), 10 ul enjekte edilir. istikrarlı bir oksijen akı sinyaline kadar rekor hücresel solunum elde edilir. </li><li> Oksigraf odasına 0.5 M ADP (2.5 mM) 10 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. NOT: hücrelerine ADP eklenmesi oksijen tüketiminde bir artış ve artacak oksijen akı sinyalini neden olacaktır. </li><li> Oksigraf odasına 0.2 mM rotenone (0.2 uM) &#39;DİKKAT&#39; 2 ul enjekte edilir ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Daha sonra, Oksigraf odası içine 1M süksinat (10 mM) 20 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal artışları kadar hücresel solunum kayıtve sabitler. </li><li> Ardından, Oksigraf odasına A (5 mcM) &#39;DİKKAT&#39; antimycin 5 mM 2 ul enjekte ve oksijen akı sinyal azalır kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Daha sonra 0.8 mM askorbat (1 mM) 2.5 ul enjekte etmek ve hemen ardından Oksigraf odası içine 0.2 mM TMPD (0.25 mM) 2.5 ul enjekte oksijen akı sinyali artışları kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. </li><li> Son olarak Oksigraf odası içine 1 M sodyum azit (5 mM), &quot;Dikkat&quot; 10 ul enjekte etmek ve oksijen akışının sinyal düşene kadar hücresel solunum kayıt ve stabilize eder. </li></ol> Bozulmamış Hücre 8. Oksijen Tüketimi <ol><li> Adımları protokol 4.3&#39;e 4.1 tarif edilen prosedür izlenerek, bir Oksigraf odası ihtiva eden bir hücre süspansiyonu (1 x 10 6 / ml) hazırlayın. </li><li> Oksigraf odası içeren hücre süspansiyonu içine 4 mg / ml oligomycin (2 ug / ml) 1 ul enjekteistikrarlı bir oksijen akı sinyali gelene kadar d rekor hücresel solunum elde edilir. </li><li> Daha sonra Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.1 uM) &#39;DİKKAT&#39; 1 ul enjekte ve oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Oksigraf odasına FCCP 0.2 mM (0.4 uM) 3 ul enjekte edilir ve daha fazla oksijen akı sinyal artar kadar hücresel solunum kayıt ve dengeler. </li><li> Oksijen akı sinyali daha sonra maksimal seviyeleri ve hiçbir daha da artar ve ulaşıncaya kadar Oksigraf odasına (odasında 0,1-2 uM son konsantrasyon) 0,2 1 mM FCCP için 1-3 ul enjekte edilerek 0.1 mM 0.3 adımlarla FCCP titre azalan başlar. NOT: Oksijen sinyali maksimum seviyeye ulaşır ve azalan başladığında FCCP enjekte durdurun. </li><li> Daha sonra, 0.2 mM rotenone (0.2 uM) ve hazneye A (5 um) antimycin 5 mM 2 ul 2 ul enjekte edilir. Kayıt solunum t kadaro oksijen akı sinyali azalır ve dengeler. </li></ol>

<ol><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Mendez, G., Eberl, T., Margreiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+mitochondrial+and+cellular+respiration+by+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Vuda, M., Takala, J., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+remifentanil+on+mitochondrial+oxygen+consumption+of+cultured+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of remifentanil on mitochondrial oxygen consumption of cultured human hepatocytes.</a> PLoS One. 7 (9), e45195(2012).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binding+to+enzymes+and+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binding to enzymes and membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 346 (3-4), 261-310 (1974).</li>
<li>Cortese, J. D., Voglino, A. L., Hackenbrock, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+conformations+of+physiological+membrane-bound+cytochrome+c%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple conformations of physiological membrane-bound cytochrome c.</a> Biochemistry. 37 (18), 6402-6409 (1998).</li>
<li>Gorbenko, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+cytochrome+c+complexes+with+phospholipids+as+revealed+by+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure of cytochrome c complexes with phospholipids as revealed by resonance energy transfer.</a> Biochim Biophys Acta. 1420 (1-2), 1-13 (1999).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondr+Physiol+Network+17.18%22">Mitochondr Physiol Network 17.18</a>. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. 64 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Mevcut protokolün amacı mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri &#39;(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron taşıma sistemi kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü ölçmek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanımı idi. Mevcut protokolde içinde bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, selüler oksijen tüketim oranları genellikle hücrelerin sayısı normalize edilir (pmol / [hücre sn x sayıda]). Bu nedenle, hücre oksijen tüketimini takip etmeden önce, hücre sayısının d...

Mitokondri, özellikle adenosin trifosfat (ATP) üretilmesi için oksijen ile, hücresel enerji metabolizmasında önemli rolleri üstlenirler. Bu hücre ölümü ve çeşitli insan hastalıklarında implike edilmiştir. Mitokondrial oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) oksijen tüketimi ve ATP sentezi ile elektron taşıma zinciri boyunca elektron taşıma birleştirir. Mitokondriyal trikarboksilik asit (TCA) döngüsü nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) ve flavin adenin dinükleotit enerji bakımından zengin bileşimler (FADH 2) içine protein, karbonhidrat ve yağ arasında dönüşüm yer almaktadır. NADH ve FADH 2 elektronlar solunum elektron taşıma zinciri protein kompleksleri aktarılır (I IV), iç mitokondriyal zarın yer. Buna ek olarak, diğer iki redoks yolları ulaşım zinciri elektron elektron aktarabilirsiniz: i) mitokondriyal elektron-transfer flavoprotein (ETF), iç mito matris yüzünde yer almaktadıryağ asidi β-oksidasyon chondrial membran ve malzemeleri elektronlar; ve ii) dihidroksiaseton fosfat gliserofosfat oksitlenir ve mitokondriyal elektron taşıma zinciri elektronları besleyen mitokondriyal gliserofosfat dehidrojenaz. Kompleks IV (elektron kabul eden) su, iki molekül oksijen dönüştürülmesi, tek bir oksijen molekülüne transfer eder. I&#39;den IV&#39;e kadar solunum elektron taşıma zinciri kompleksi elektron taşıma mitokondriyal iç membran boyunca bir elektrokimyasal gradyanı oluşturur arası boşluğa mitokondriyal matris proton akışı ile birleştirilir. Daha sonra, mitokondriyal kompleks V (ATP sentaz) geri mitokondrial matriks içine hidrojen iyonlarını mekik ve ATP molekülleri sentezler. OXPHOS fonksiyonu elde edilebilir çeşitli teknikler ve çeşitli mitokondriyal solunum durumları kullanılarak in vivo ve in vitro olarak değerlendirilebilir. İzole mitokondri aşağıdaki respirato içindeRy Devletler ölçülebilir: i) taban mitokondriyal solunum (durum 1) mitokondriyal solunum zinciri kompleksi, belirli alt-tabakaların ilave edildikten sonra, ii) oksijen tüketimi (durum 2), III) maksimal mitokondriyal oksijen tüketimi doyurucu konsantrasyonlarının ilave edildikten sonra adenozin difosfat (ADP) (devlet 3) ve ATP dönüştürülür ADP tüketimi (sonra iv) istirahat solunum) (devlet 4). sağlam hücrelerde takiben solunum durumları ölçülebilir: i) taban hücresel oksijen tüketimi endojen substratları ve ADP mevcudiyetinde, ii) oligomycin varlığında bazal hücre oksijen tüketimi (oligomycin hassas olmayan solunum) ve oligomycin duyarlı solunum (ATP kaybı) antimisin ve rotenone ilave edilmesinden sonra, iii) FCCP bağlanmamış solunum, ve iv) olmayan mitokondriyal solunum. permeabilize hücrelerde, elektron taşıma zinciri kompleksleri ve ADP özel substratlar eklendi ve maksimal kompleks bağımlı solunum hızları ler olabiliruch gibi karmaşık I-, II- ve IV-bağımlı solunum oranları ölçülebilir. Hücresel solunum ölçümleri kompleksleri I-IV, mitokondriyal bütünlüğü ve enerji metabolizması 1, 2, 3 özel mitokondriyal solunum kapasitesi önemli bilgiler sağlamaktadır. Yüksek doğruluk, çözünürlük ve hassasiyet ile mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri sağlayacak cihazlardan biri yüksek çözünürlüklü Oksigraf 4&#39;tür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf cihaz enjeksiyon portu ile iki bölmeyi içerir ve her bölme bir polarografik oksijen sensörü ile donatılmıştır. Hücresel ya da izole mitokondriyal süspansiyonlar respirometredeki sürekli karıştırılır. mitokondriyal kompleks aktivitesi için mitokondriyal fonksiyon, alt tabakaların ve inhibitörlerin değerlendirmek için standart protokoller izlenerek eklenebilir. Alt tabakaların ve inhibitörlerin enjeksiyon int ile titre edilebilirOksigraf odaları ve oksijen tüketimi oranları o yazılımı kullanılarak hesaplanır ve hücrelerin sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilmiştir. Yüksek çözünürlüklü Solunum artan hassasiyet ve sağlam veya permeabilize hücrelerin biyolojik numunelerin az sayıda çalışma yeteneği de dahil olmak üzere, geleneksel ve konvansiyonel polarografik oksijen elektrod cihazlar fazla birkaç avantaj sunar. Buna ek olarak, her bir cihaz iki odayı içeriyor ve solunum hızları, oksijen konsantrasyonlarının karşılaştırmalar için eş zamanlı olarak kaydedilebilir. yüksek çözünürlüklü Oksigraf geleneksel polarografik oksijen elektrod cihazlara kıyasla aygıt odalardan oksijen azalma sızıntı avantajı vardır. Son zamanlarda hücresel oksijen tüketimini ölçmek için geliştirilen başka bir aygıt 96-iyi hücre dışı akı analiz 5&#39;tir. Hücre dışı akı analizörü yerine polarografik sensörler floresan ile donatılmıştır. hücre dışı avantajlarıyüksek çözünürlüklü Oksigraf I olan) bu ii) 24 ve yüksek verimli tarama için 96-yuvalı plakalar içinde oksijen tüketimini ölçmek mümkündür, büyük ölçüde otomatik bir cihaz ile karşılaştırıldığında akış Analiz Cihazı, Bu nedenle, biyolojik numunelerin düşük miktarda gerektiren ve iii) hücresel glikolitik akı ilave ölçüm mümkündür. yüksek çözünürlüklü Oksigraf kıyasla dışı akı analizörü dezavantajları) cihazın ve olmayan tekrar kullanılabilir floresan plakalar gibi sarf yüksek maliyetler i, ve ii) tahlil başına sadece dört bileşikler / kuyu enjektabl vardır için, sistem Alt tabaka uncoupler inhibitörü titrasyon protokolleri için uygun değildir. Bu çalışmada, biz mitokondriyal solunum belirlemek için yüksek çözünürlüklü Solunum kullanın. Hücresel oksijen tüketimi deneyler için hücreler complexe elektronları beslenmesi için eksojen ADP ve okside mitokondriyal substratların girişine izin permeabilizeSolunum sistemi s. Bu yaklaşım, (çok yüzeye hücre geçirgenliği olmayan olan) olduğu gibi hücrelere kıyasla belirgin bir avantajı bireysel mitokondriyal kompleksleri solunum kapasitelerinin diseksiyon sağlar. Ancak, hücre zarı permeabilization dışı ortam ile dengelenir sitozol ve hücre dışı alan ve orta (sitozolik çözünenlerin dışarı yıkama) ve hücre içi alan kompozisyonu arasındaki engeli bozacak. sağlam hücreler üzerinde permeabilize hücrelerin dezavantajlarından biri, deterjan aşırı miktarda hücre geçirgenliği esnasında kullanılan halinde mitokondriyal dış membran hasar olabilir. sağlam hücrelerde bazal, sağlam hücreler birleştirildi ve bağlanmamış solunum ölçülebilir. Bu yöntem, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen ve aynı zamanda maksimal mitokondriyal elektron transpo hakkında bilgi veren, eksojen substratları ve ADP ilavesi olmadan sağlam hücrelerin oksijen tüketimini değerlendirirrt kapasitesi 6, 7. permeabilize hücrelerin içinde sağlam hücreler avantajlarından biri, hücre ortamında bozulmaz ve mitokondri hücrelerin bütün bileşenleri ile temas halinde olmasıdır. Hücresel plazma membran geçirgenliği için, bu tür digitonin deterjanlar 8 kullanılmıştır. digitonin aşırı miktarda kullanıldığında Ancak, mitokondriyal dış membran bütünlüğünü tehlikeye girebilir. permeabilize hücrelerin bozulmamış olduğunu mitokondriyal dış membran bütünlüğünü doğrulamak için digitonin titrasyon hücre geçirgenliği için optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için hücreler solunum ortam içinde yeniden süspansiyon haline getirildi ve digitonin konsantrasyonu ölçülür mitokondriyal substratları ve ADP ve solunum oranları varlığında Respirometrik titre edilir. sağlam olmayan permeabilize hücrelerin solunum mitocho mevcudiyetinde stimule değildirndrial yüzeyler ve ADP. Bununla birlikte, daha sonra adım adım digitonin titrasyonu plazma zarlarının kademeli geçirgenliği üretebilecektir ve optimal digitonin konsantrasyonu elde edilir. Bu, tam permeabilization solunum up artış gösterilmiştir. Mitokondriyal kalite ve dış membran bütünlüğü eksojen sitokrom c 2, 9 eklenerek kontrol edilebilir. Sitokrom c mitokondrial elektron taşıma zinciri 10, 11, 12, 12 kDa elektron taşıyan proteindir. Bu mitokondriyal arası boşluğa lokalize olur, ve kompleks IV karmaşık III elektron taşıyan, oksijen tüketimi yer almaktadır. mitokondrial dış membran zarar görmüşse, sitokrom-c serbest bırakılır ve mitokondriyal oksijen tüketimi azalır. Eksojen sitokrom c eklenmesi üzerine, mitokondriyal solunum herhangi büyütme bir göstergesidirmitokondriyal dış membran bozulur. Permeabilize hücreler, yüzeyler ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri çeşitli protokolleri 3, 9, aşağıdaki eklendi edilir. mitokondriyal kompleks tahrik solunum oranları araştırmak amacıyla, örneğin, aşağıdaki protokol kullanılabilir. hücre geçirgenleştirmeden sonra birinci kompleks I solunum zinciri için alt-tabaka olarak NADH üretir ve sonra ADP ATP (durum 3, aktif bir dönüşüm için ilave kompleks I&#39;in aktivasyonunu tahrik substratlar malat ve glutamat ile uyarılır kompleks I-bağımlı solunum). Bir sabit sinyal ulaşıldıktan sonra, rotenon (mitokondriyal kompleks I inhibitörü) Rotenone FADH 2 süksinat ardından kompleks I. inhibe ettiği ve kompleks II (State 3, aktif bir kompleks II bağımlı solunum) aktif hale getirmek için tatbik edilmektedir. Karmaşık IV-bağımlı solunum, ilk kompleks III ölçmek içinbağımlı solunum antimisin (mitokondriyal kompleks III inhibitörü) eklenerek engellendi. Daha sonra kompleks IV bağlı solunum askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) uygulanması ile uyarılır. TMPD dolayısıyla maksimal kompleksi IV bağımlı solunum hızı (Durum 3) önce ve sodyum azid, mitokondriyal kompleks IV inhibitörünün eklenmesinden sonra solunum oranları çıkarılmasıyla hesaplanır, solunum tamponu otomatik oksitleyebilir. solunum deneyleri, bir kontrol (uyarılmamış hücreler) olarak hizmet eden paralel birinde Oksigraf iki odası, diğer ihtiva eden uyarılmış hücrelerde gerçekleştirilebilir. Bunların oksijen tüketimi Oksigraf odası içinde ölçülmeden önce Açıkçası, hücreler, mitokondriyal fonksiyonlarını etkileyen ilaçlarla, örneğin, çeşitli şekillerde, önceden işleme tabi tutulabilir. Bu protokol, bireysel mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri fonksiyonel muayene izin verir. Buna ek olarak, tek bir maksimum ADP-uyarımlı ölçebilirsolunum palmitat şeklinde eksojen yağ asit kullanılarak permeabilize hücrelerin (devlet 3). (: 1 mol oranında palmitat: BSA 6) Bu protokol, sodyum palmitat konsantre edildi stokları derece yağlı asit içermeyen sığır serumu albümini (BSA) ile konjüge edilir. Bundan sonra birinci Digitonin ve mitokondriyal solunum ile permeabilize hücrelerin karnitin eklenmesi ile değerlendirilir ve ADP (durum 3, maksimum solunum) ilave edildi palmitat. Ardından, oligomycin durumu 4 (devlet 4o) ve solunum kontrol oranı (RCR değeri) taklit ilave edilir devlet 3 / devlet 4o olarak hesaplanmıştır. β-oksidasyon elektron transfer flavoprotein ve β-hidroksiaçil-KoA dehidrogenaz tarafından elektron taşıma zinciri geçirilen elektronlar olan FADH 2 ve NADH, bir (TCA döngüsünde girer) asetil CoA üretimini ve üretimi teşvik. Mitokondri palmitat-BSA protokolü yağ inceleyerek araştırmacılar tarafından kullanılabilir yağlı asit metabolizmasının merkezinde ve tarif edilenty asit oksidasyonu. Sağlam hücreler, aktivatörleri ve mitokondriyal karmaşık aktivite inhibitörleri farklı bir protokole 6, 9, aşağıdaki ilave edilir. Bu deneyler için, eksojen alt-tabakaların yokluğunda olmayan permeabilize hücrelerin birinci oksijen tüketimi (solunum oranı fosforile) ile ölçülür. Daha sonra, sigara fosforile solunum hızı mitokondriyal ATP sentazının bir inhibitörü olan oligomycin eklenmesi sonra ölçülür. Daha sonra, protonophore karbonil siyanür p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) çeşitli konsantrasyonlarda yönetilmektedir ve maksimal mitokondriyal uncoupled solunum hızı ölçülür. Böyle FCCP olarak Protonophores kemiosmotik degrade dağıtmak için protonların pasif hareket etmesine izin verir iç zarı proton geçirgenliğinin bir büyütme neden olabilir. Proton geçirgenlik artışı oksidatif solunum (ATP üretimi) birbirinden ayrılacak ve o da bir artışa neden olurxygen tüketimi. Daha sonra, rotenon ve antimisin mitokondriyal solunum inhibe etmek için ilave edilir ve olmayan mitokondriyal solunum diğer solunum hızları çıkarılır. Oksijen tüketim oranları (kapalı oksijen odasında) hacim özel oksijen akı bölünmesiyle hesaplanır IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre] (milyon hücre başına oksijen akışı), JV, O şeklinde ifade edilebilir 2 [pmol X sn-1 X mi -1] hücre konsantrasyonu hücre odası içinde (hacim başına hücre sayısı [10 6 hücre ∙ mi 1]) 15. Hücre başına kütle bölü hücre-kütle özel oksijen akı, JO 2 [pmol x saniye -1 x mg -1], hücre başına akışı, IO 2 [pmol x saniye -1 x 10 -6 hücre], [mg ∙ 10 6 hücre]; veya hacim özgü akı, JV, O 2 [pmol x saniye -1 x ml -1], vol başına kütle bölüume [mg ∙ mi 1]. JO 2 hücre proteininin, kuru ağırlık veya hücre hacmi başına oksijen akıdır. yüksek çözünürlüklü Solunum kullanarak bu çalışmada, biz, iii) mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri eksojen sitokrom c kullanarak) I tam hücresel plazma zarı geçirgenliği için optimum digitonin konsantrasyonu (digitonin titrasyon deneyi), ii) mitokondrial dış membran bütünlüğü i belirlemek için protokoller tarif eksojen ADP ve mitokondriyal solunum zinciri alt tabakalar ve mevcudiyetinde Digitonin permeabilize HepG2 hücrelerinde II ve IV maksimum solunum oranları IV) bazal, eksojen alt-tabakaların eklenmeden bağlı olan ve sağlam hücreler maksimum bağlanmamış solunumu (maksimum elektron taşıma kapasitesi) ve ADP, entegre hücrede solunum fonksiyon üreyen.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Antimisin A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözünür</td></tr><tr><td>Askorbat</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td>Kimyasal, etanol içinde çözünür</td></tr><tr><td>Kontes otomatik hücre sayacı ve nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Otomatik hücre sayma cihazı</td></tr><tr><td>Sitokrom c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Kimyasal, DMSO</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td>Orta</td></tr><tr><td>içinde çözün EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26010-074</td><td>Orta bileşen</td></tr><tr><td>Glutamat</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>KH2PO 4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>K-laktobiyonat</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>MgCl 2 </td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>O2k-Çekirdek: Oksigraf-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Yüksek çözünürlüklü respirometri cihazı</td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Kimyasal, etanolde çözün</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Sodyum azid</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Kimyasal, etanol</td></tr> <tr><td>içinde çözünSüksinat</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Tripsin</td><td>Sigma</td><td>T 4674</td><td>Kimyasal</td></tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü solunum permeabilize ve bozulmamış hücreleri mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

Yüksek çözünürlüklü oksigraf, biyolojik örneklerde (bozulmamış ve geçirgen hücreler, dokular veya izole mitokondri) çok yüksek çözünürlük ve hassasiyete sahip kapalı odacıklı bir sistemde hücresel oksijen tüketimini ölçmek için kullanılan bir cihazdır. Yüksek çözünürlüklü oksigraf cihazı iki hazne ile donatılmıştır ve oksijen konsantrasyonunu ölçmek ve her haznedeki oksijen tüketimini hesaplamak için polarografik oksijen sensörleri kullanır. Oksijen tüketim oranları yazılım kullanılarak hesaplanır ve hücre sayısı başına saniyede pikomol olarak ifade edilir. Her yüksek çözünürlüklü oksigraf odası, plazma membran geçirgenliği için etkili ve optimum konsantrasyonları belirlemek için substrat-birleştirici-inhibitör titrasyonları veya deterjan titrasyon protokolleri için ideal hale getiren enjeksiyon portlarına sahip bir durdurucu içerir. Teknik, çok çeşitli hücre tiplerinde solunumu ölçmek için uygulanabilir ve ayrıca mitokondriyal kalite ve bütünlük ve maksimum mitokondriyal solunum elektron taşıma sistemi kapasitesi hakkında bilgi sağlar.

Digitonin Titrasyon Deney: Hücresel permeabilization için Optimum Digitonin Konsantrasyon belirlenmesi Digitonin titrasyonu HepG2 hücrelerinin nüfuziyet kabiliyeti optimal konsantrasyonunu belirlemek için gerçekleştirilir. Bu deneyler için, digitonin rotenone, süksinat (mitokondriyal kompleks II alt-tabaka) ve ADP bir doyma bir miktarının varlığında sağlam hücrelerde titre edilir, ve solunum başlangıçta ve her sonra ölçülür (karm...

Yüksek çözünürlüklü Solunum mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için kullanılır. Bu mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri &#39;(I-IV) solunum hızları, maksimum mitokondriyal elektron transport sistem kapasitesi ve mitokondriyal dış membran bütünlüğü belirlemek için basit bir tekniktir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Bu prosedürün genel amacı, mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için yüksek çözünürlüklü respirometri kullanmaktır. Bu yöntem, mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili sendromlar ve hastalıklardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; sepsis, çeşitli nörolojik hastalıklar ve yaşa bağlı bozukluklar. Bu tekniğin temel avantajları, daha yüksek hassasiyete sahip olması ve bozulmamış veya geçirgen hücreler gibi az sayıda biyolojik numune ile birleştirilmiş inhibitör titrasyon deneyleri üzerinde substrat gerçekleştirme yeteneğine sahip olmasıdır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Sandra Nansoz olacak. Prosedüre başlamadan önce, polarografik oksijen sensörlerini hava ile kalibre edin, daha sonra solunum tamponundaki hücreleri mililitre konsantrasyonunda bir kere on ila altıncı hücreye yeniden süspanse edin ve oksigrafın bir odasındaki solunum ortamını 2.1 mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. Hazneyi durdurucu ile kapatın ve haznedeki manyetik karıştırma çubuğunu dakikada 700 dönüşe ayarlayın.Ardından, kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu 5 ila 10 dakika boyunca kaydedin. Daha sonra, titanyum enjeksiyon port

high-resolution-respirometry-to-assess-mitochondrial-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mitokondri izole fare kalbinde mitokondriyal permeabilite geçiş gözenek açılması ölçümü için bir spektrofluorometrik protokolü sunulmuştur. Tahlil mitokondri Ca eşzamanlı ölçüm...

Mitokondri İzole Fare Heart Geçirgenliği Geçiş Gözenek Açma Multi-parametre ölçümü

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Bu iletişim kuralı bozulmadan 832/13 beta yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri kullanarak hücreleri glikoz-aracılı değişiklikler doğal bileşikler huzurunda mitokondrial solunum etkisini ölçmek için hedeftir.

Doğal bileşikler varlığında olduğu gibi Beta hücrelerinin mitokondriyal işlev ölçmek için yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri

Yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak oksidatif fosforilasyonun değerlendirilmesi, mitokondri ve hücresel enerji metabolizmasının fonksiyonel analizinin ayrılmaz bir parçası haline gelmiştir. Burada, oda ve mikroplaka tabanlı yüksek çözünürlüklü respirometreler kullanılarak hücresel enerji metabolizmasının analizi için protokoller sunuyoruz ve her cihazın temel faydalarını tartışıyoruz.

Oda ve Plaka Tabanlı Respirometreler Kullanarak Hücrelerdeki ve Dokulardaki Biyoenerjetik Değerleri Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Floresan sensörlerine bağlı yüksek çözünürlüklü respirometri, mitokondriyal oksijen tüketimini ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu belirler. Bu protokol, geçirgenleştirilmiş siyatik sinirde mitokondriyal solunum hızlarını ve ROS üretimini değerlendirmek için bir teknik tanımlamaktadır.

Siyatik Sinirde Mitokondriyal Fonksiyonun Yüksek Rezolüsyonlu Respirometri ile Değerlendirilmesi

Atlar olağanüstü bir aerobik egzersiz kapasitesine sahiptir, bu da at iskelet kasını hem at egzersiz fizyolojisi hem de memeli mitokondriyal fizyolojisi çalışmaları için önemli bir doku haline getirir. Bu makalede, at iskelet kasında mitokondriyal fonksiyonun kapsamlı değerlendirilmesi için teknikler açıklanmaktadır.

At İskelet Kasının Yüksek Çözünürlüklü Floro-Respirometrisi

Sperm mitokondriyal fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü respirometri ile analizi, kapalı bir oda sisteminde serbestçe hareket eden spermatozoanın oksijen tüketiminin ölçülmesine izin verir. Teknik, sperm mitokondriyal özellikleri ve bütünlüğü hakkında bilgi sağlayan insan spermatozoasında solunumu ölçmek için uygulanabilir.

İnsan Spermatozoasında Mitokondriyal Fonksiyonu Değerlendirmek için Yüksek Çözünürlüklü Respirometri

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Bağışıklık hücrelerinde fizyolojik olarak ilgili substrat konsantrasyonları altında mitokondriyal biyoenerjetik çalışma yöntemleri sınırlıdır. İnsan T hücrelerinde, monositlerde ve periferik mononükleer hücrelerde mitokondriyal membran potansiyelinin enerji talebine tepkisindeki değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri kullanan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan bağışıklık hücrelerinde mitokondriyal membran potansiyelindeki dinamik değişiklikleri değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü florespirometri

Burada, yüksek çözünürlüklü respirometri için 0.5 mL odacığın, uygun enstrümantal O2 arka plan düzeltmesi uygulandığında 2.0 mL oda ile tutarlı sonuçlar gösterdiğini gösteriyoruz. Daha az numune gerektirir, bu da sınırlı kullanılabilirlik veya düşük solunum kapasitesi olan çalışmalar için avantajlıdır.

Küçük hacimli bir odada yüksek çözünürlüklü respirometri

Rezonans Raman Spektroskopisi (RRS) kullanarak mitokondriyal sağlığı izlemek için invaziv olmayan, gerçek zamanlı bir yöntem sunuyoruz. Mitokondriyal redoks durumlarını nicelendirmek için RRS kullandık ve mitokondriyal sağlık için bir metrik geliştirdik; Rezonans Raman azaltılmış mitokondriyal oranı (3RMR), bu ölçüm oksijenlenme değişikliklerine geleneksel kan gazı analitlerinden daha hızlı yanıt verdiğini gösteriyor.

Rezonans Raman Spektroskopisi Kullanarak Mitokondriyal Fonksiyonun Gerçek Zamanlı, İnvaziv Olmayan Değerlendirmesi

Öğrenin yüksek çözünürlüklü solunum ölçümüyle mitokondrial oksijen tüketimini değerlendirmeyi. Bu hassas yöntem, bütün veya geçirgen hücrelerde mitokondrial disfonksiyonu araştırmak için kullanılır.

Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet