Yüksek çözünürlüklü Solunum permeabilize ve bozulmamış Hücreleri Mitokondrial fonksiyonu değerlendirmek için

Bu prosedürün genel amacı, mitokondriyal oksijen tüketimini belirlemek için yüksek çözünürlüklü respirometri kullanmaktır. Bu yöntem, mitokondriyal disfonksiyon ile ilişkili sendromlar ve hastalıklardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; sepsis, çeşitli nörolojik hastalıklar ve yaşa bağlı bozukluklar. Bu tekniğin temel avantajları, daha yüksek hassasiyete sahip olması ve bozulmamış veya geçirgen hücreler gibi az sayıda biyolojik numune ile birleştirilmiş inhibitör titrasyon deneyleri üzerinde substrat gerçekleştirme yeteneğine sahip olmasıdır.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Sandra Nansoz olacak. Prosedüre başlamadan önce, polarografik oksijen sensörlerini hava ile kalibre edin, daha sonra solunum tamponundaki hücreleri mililitre konsantrasyonunda bir kere on ila altıncı hücreye yeniden süspanse edin ve oksigrafın bir odasındaki solunum ortamını 2.1 mililitre hücre süspansiyonu ile değiştirin. Hazneyi durdurucu ile kapatın ve haznedeki manyetik karıştırma çubuğunu dakikada 700 dönüşe ayarlayın.

Ardından, kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu 5 ila 10 dakika boyunca kaydedin. Daha sonra, titanyum enjeksiyon portundan oksigraf odasına iki mikrolitre Rotenone enjekte etmek için bir şırınga kullanın ve hücresel solunumu 5 ila 10 dakika daha kaydedin. Kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edildiğinde, 20 mikrolitre bir molar süksinat ve ardından 10 mikrolitre 0.5 molar ADP enjekte edin.

Daha sonra iki mikrolitre iki milimolar digitonin iki hacim enjekte edin ve her enjeksiyondan sonra iki ila beş dakika boyunca hücresel solunumu kaydedin, ardından oksijen akısı sinyali maksimum seviyeye ulaşana kadar iki ila dört mikrolitre iki milimolar digitoninin kademeli enjeksiyonu yapın ve daha fazla digitonin enjeksiyonu solunum hızını artırmaz. Mitokondriyal dış zar bütünlüğünün değerlendirilmesi için, az önce gösterildiği gibi bir oksigraf odası hazırlayın ve hücrelere nüfuz etmek için iki mikrolitre sekiz milimolar digitonin enjekte edin. Beş dakika sonra, 20 mikrolitre bir molar süksinat enjekte edin ve kararlı bir oksijen akısı sinyali elde edilene kadar hücresel solunumu 5 ila 10 dakika boyunca kaydedin.

Daha sonra, kompleks ikiyi uyarmak ve oksijen tüketimini artırmak için 10 mikrolitre 0.5 molar ADP enjekte edin. Kararlı bir akı sinyali elde edildiğinde, beş mikrolitre dört milimolar sitokrom c enjekte edin ve ardından mililitre ligamisin başına dört miligramlık bir mikrolitre enjekte edin. Karaciğer hepatosellüler karsinom hücrelerinin ADP ile uyarılan solunumunu ölçmek için, az önce gösterildiği gibi bir istiridye odası hazırlayın ve hücreleri beş dakika boyunca geçirgen hale getirmek için oksijen odasına iki mikrolitre sekiz milimolar digitonin enjekte edin, ardından 12.5 mikrolitre 0.8 molar mallade ve 10 mikrolitre iki molar glutamat enjeksiyonu.

Stabil bir oksijen akışı elde edildiğinde, oksijen tüketimini artırmak için 10 mikrolitre 0.5 molar ADP enjekte edin, ardından iki mikrolitre 0.2 milimolar rotenon ve 20 mikrolitre bir molar süksinat enjekte edin. Daha sonra, iki mikrolitre beş milimolar antimisin enjekte edin ve hücresel solunumu kaydedin. Sinyal azaldığında ve stabilize olduğunda, 2.5 mikrolitre 0.8 milimolar eskorbat enjekte edin, ardından 2.5 mikrolitre 0.2 milimolar TMPD'nin hemen enjeksiyonunu yapın, oksijen akısı sinyali artana ve stabilize olana kadar hücresel solunumu kaydedin.

Daha sonra oksigraf odasına 10 mikrolitre bir molar sodyum azit enjekte edin ve oksijen akısı sinyali azalana ve stabilize olana kadar hücresel aspirasyonu kaydedin. Bozulmamış hücre oksijen tüketimini ölçmek için, gösterildiği gibi bir oksigraf odası hazırlayın ve mililitre aligimicyn başına 1 mikrolitre dört miligram enjekte edin, ardından bir ve üç mikrolitre 0.2 milimolar FCCP enjeksiyonu yapın. Daha sonra, oksijen akısı sinyali daha fazla artış olmadan maksimum seviyesine ulaşana ve ardından azalmaya başlayana kadar bir ila üç mikrolitre 0.2 ila bir milimolar FCCP enjekte ederek FCCP'yi 0.1 ila 0.3 mikromolar adımlarla titre edin.

Daha sonra, iki mikrolitre 0.2 milimolar rotenon ve iki mikrolitre beş milimolar antimisin A enjekte edin ve oksijen akısı sinyali azalana ve stabilize olana kadar solunumu kaydedin. Digitonin yokluğunda, hücresel solunum çok düşüktür ve sağlam, geçirgen olmayan hücrelerin solunumu mitokondriyal substrat ve ADP varlığında uyarılmaz. Bununla birlikte, digitoninin kademeli olarak eklenmesi üzerine, hücresel plazma zarı geçirgen hale gelir ve mitokondriyal solunum, tam geçirgenliğe kadar artar, bu sırada süksinat ve ADP hücrelere girer.

Bununla birlikte, aşırı miktarda digitonin kullanılırsa, mitokondriyal dış zar bütünlüğü tehlikeye girebilir ve bu da kompleksten bağımlı duruma üç solunumda bir azalmaya neden olabilir. Sitokrom c, digitonin ile tedavi edilen hücrelerde kompleksten bağımlı duruma üç solunumu geliştirmez, bu da mitokondriyal dış zardan sitokrom c kaybı olmadığını ve sitokrom c'nin çok yüksek dozlarda digitonin ile tedavi edilen hücrelerin solunumunu artırabilmesine rağmen mitokondriyal bütünlüğün korunduğunu gösterir. Digitonin permeablizasyonu sonrası mitokondriyal kompleks aktivitenin eksojen substratlarının eklenmesi, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri bir, iki ve dört maksimal solunum hızında bir artışa neden olur.

Azalmış solunum seviyelerinin oluşması, oksigraf odalarının önceki deneyden mitokondriyal inhibitörlerle kirlenmesine bağlı olabilir. Aligimisin varlığında ve FCCP'nin sıralı ilavesinde, hücrelerin maksimum ayrılmamış solunum hızı gözlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniklerden herhangi biri uygun şekilde yapılırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, her deneyden sonra yıkama oksigraf odalarını ve tıpalarını kapsamlı bir şekilde hatırlamak çok önemlidir. Bu prosedürü takiben, solunum hızlarındaki değişikliklerin mitokondriyal substrat eksikliğinden mi yoksa azalmış ATP sitat aktivitesinden mi kaynaklandığı gibi ek soruları yanıtlamak için hücresel ATP içeriğinin ölçümleri, her biri simatik aktivitede mevcut, mitokondriyal substrat seviyeleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, biyogegetics alanındaki araştırmacıların, edinilmiş ve genetik mitokondriyal hastalıklar, oksidatif stres, cilt perfüzyon hasarı ve sağlam veya geçirgen hücrelerde veya liflerde yaşlanma ve izole mitokondri gibi alanlarda mitokondriyal fonksiyonu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanarak geçirgen ve sağlam hücrelerde mitokondri işlevine nasıl yardımcı olacağınızı iyi anlamış olmalısınız. Antimisin a, rotenon, sodyum iozid, FCCP ve arikomisin ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.