2.13: 1D İnce Tabaka Kromatografisinin Yapılması

1. TLC Plakaları

1. TLC için yaygın adsorbanlar silika jel, alümina ve selülozdur. TLC plakaları, çeşitli özelliklere sahip ticari olarak temin edilebilir. Bir TLC plakası seçin ve uygun bir boyuta kadar kesin (çoğu uygulama için yaklaşık 5 cm x 5 cm yeterlidir). Cam destekli TLC plakaları için, bir cetvel ve bir cam kesici kullanarak camı çizin, ardından çizgi boyunca dikkatlice kırın.

2. Lekelenme

1. Yaklaşık% 1'lik bir çözelti elde etmek için numuneyi uygun bir çözücü içinde çözün. Mümkünse, çözücü polar olmamalıdır. Kolon kromatografisi fraksiyonları ve diğer seyreltik çözeltiler, çözünen madde %0.2 ile %2.0 arasında bir konsantrasyonda mevcutsa seyreltme olmadan kullanılabilir.
2. Taban çizgisini, plakanın altından yaklaşık 1.0 cm uzakta bir kalemle işaretleyin. Lekeleri plakanın kenarından en az 1.0 cm uzağa yerleştirin ve uygun şekilde etiketleyin.
3. Lekeler bir cam kılcal damar kullanılarak uygulanabilir. TLC plakasını tespit etmek için, az miktarda sıvı çekmek için kılcal damarı çözeltiye batırın. Ucu TLC plakası üzerinde istediğiniz yere nazikçe dokundurun ve hemen çıkarın.
4. Alternatif olarak, her uygulama için yaklaşık 1 μL çözelti vererek mikrolitrelik bir şırınga ile lekeleri uygulayın.
5. Spotlar, adsorbanın yüzeyini gözcü ile rahatsız etmemeye dikkat ederek her yerde art arda uygulanabilir. Uygulamalar arasında solventin kurumasını bekleyin.

3. Gelişmekte Olan Bir Çözücü Seçmek

1. İyi bir ayırma için mümkün olan en az polar çözücünün kullanılması tercih edilir. TLC için yaygın çözücüler arasında heksan, etil asetat, diklorometan ve metanol bulunur (Tablo 1).
2. Uygun bir mobil faz bulmanın uygun bir yolu, TLC plakasını bir numune ile tespit etmektir. 1-2 cm çapında bir çözücü çemberi oluşturmak için yeterli miktarda çözücüyü doğrudan noktaya uygulayın. Dairenin çevresini işaretleyin. Görselleştirme üzerine, uygun bir çözücü, en dıştaki halka, merkezden çözücü cephesine olan mesafenin yaklaşık% 50'si ile iyi ayrılmış halkalar gösterecektir.
3. İki karışabilir çözücü seçerek ve bunları değişen oranlarda test ederek mobil fazın polaritesini ayarlamak gerekebilir. Yaygın karışımlara örnek olarak, etil asetat içeren hekzanlar ve metanol içeren diklorometan verilebilir.

4. Geliştirme

1. Benekli TLC plakasını uygun geliştirme çözücüsünü içeren bir geliştirme odasına yerleştirin. Çözücü çizgisi, TLC plakası üzerinde işaretlenen taban çizgisinin altında olmalıdır.
2. Gelişmekte olan oda, kapaklı bir kavanoz veya alüminyum folyo veya plastik film ile kaplı bir beher olabilir. TLC plakasını barındıracak mevcut en küçük kabı kullanın.
3. Çözücünün plakanın üst kenarına ulaşmasına izin vermeyin. Çözücü cephesi (adsorbanın ıslak kısmının bittiği sınır) plakanın üstünden 5-10 mm uzakta olduğunda, TLC plakasını geliştirme odasından çıkarın ve çözücü kurumadan önce çözücü önünü bir kalemle işaretleyin.

5. Görselleştirme

1. Renkli noktalar hemen görselleştirilebilir ve bir kalemle işaretlenebilir. Çoğu zaman, lekeler görünmez ve bu nedenle başka bir yöntemle görselleştirilmelidir.
2. Genellikle, TLC adsorbanı bir floresan göstergesi içerir. Lekeler, elde tutulan bir ultraviyole (UV) lamba kullanılarak görüntülenebilir. Floresanı söndüren bileşikler, plaka kısa dalga (254 nm) UV ışığı ile ışınlandığında koyu lekeler olarak görünecektir. Floresan bileşikler, uygun bir dalga boyunda UV ışığı ile ışınlandığında parlak noktalar üretecektir. Her noktanın ortasını bir kalemle işaretleyin.
3. Lekeler, TLC plakasına bir görselleştirme reaktifi veya leke uygulanarak da görselleştirilebilir. Görselleştirme reaktifi, plakayı reaktife daldırarak veya plakayı aşındırıcı olmayan bir reaktifle doyurulmuş bir pamuk top ile silerek uygulanabilir.
4. Etanol içindeki% 20'lik bir fosfomolibdik asit çözeltisi, çoğu organik bileşiğin görselleştirilmesi için yararlıdır. Lekeler, plakanın bir ısı tabancasıyla veya bir fırında ısıtılmasıyla ortaya çıkar.
5. Belirli bileşik sınıflarının görselleştirilmesi için başka reaktifler de kullanılabilir. Örneğin, amino asit görselleştirme için ninhidrin reaktifi ve aldehitler ve ketonlar için 2,4-dinitrofenilhidrazin kullanılır.

6. Analiz

1. Geciktirme faktörü (R_f), bir bileşiğin bir TLC plakasından kat ettiği mesafenin, çözücünün kat ettiği mesafeye oranıdır. Bu, taban çizgisinden noktanın merkezine olan mesafenin ölçülmesi ve değerin taban çizgisinden çözücü cephesine olan mesafeye bölünmesiyle belirlenebilir.
   
2. Bir bileşiğin R_f değeri, fiziksel özelliklerinin karakteristiğidir ve sıcaklık, numune boyutu ve adsorbanın kalınlığı ve aktivitesi, sıcaklık ve numune boyutu gibi faktörlere bağlıdır.
3. Bir bilinmeyenin bilinen bir bileşikle aynı olduğunu doğrulamak için, aynı TLC plakasında bir standart tespit edilmelidir. Aynı maddeler aynı özelliğe sahip olacaktır R_f.

İnce tabaka kromatografisi veya TLC, organik kimyada yaygın olarak kullanılan uçucu olmayan bileşiklerin karışımlarını ayırmak için kullanılan kromatografik bir yöntemdir.

TLC, cam veya plastik destekli bir plaka üzerinde gerçekleştirilir. Plaka üzerinde etiketlerle birlikte bir taban çizgisi işaretlenmiştir. İncelenen karışım ve referans bileşikler uygun bir çözücü içinde çözülür ve küçük noktalar halinde TLC plakasının alt kenarına yakın bir yere uygulanır. Plaka bir kavanoza yerleştirilir ve bir çözücü mü? (mobil faz)?karışımı her bir bileşenin fiziksel özelliklerine göre ayırır.

Daha fazla alet ağırlıklı ayırma tekniğinin TLC'den daha fazla çözme gücüne sahip olmasına rağmen, TLC'yi anında kalitatif analiz için çekici bir teknik haline getiren hız ve düşük maliyettir. Bu video, ince tabaka kromatografisinin hazırlanmasını, çalıştırılmasını ve analizini gösterecektir.

Kromatografik teknikler, sabit ve hareketli bir faz içerir. TLC'de, sabit faz, plakaya sabitlenmiş ince bir malzeme tabakasından oluşur. Malzeme, silika jel gibi polar bir maddedir. Mobil faz, kılcal hareket ile adsorban tabakayı yukarı doğru hareket ettiren polar olmayan bir sıvıdır. Mobil faz plakada yukarı doğru hareket ettikçe, daha sonra polariteye göre ayrılan her bir noktanın bileşenleri boyunca sürüklenir.

Daha az polar olan bileşikler, plakayı yukarı çekerken mobil fazda daha fazla zaman harcayacaktır. Daha polar olan bileşikler durağan faza daha fazla çekilir ve bu nedenle plakayı o kadar yukarı hareket ettirmezler.

Ayırma, gelişmekte olan bir kapta gerçekleşir. Bunlar kapaklı kavanozlar veya alüminyum folyo ile kaplanmış beherler olabilir. Ayırmayı hızlandırmak için TLC plakasını barındıracak mevcut en küçük kabı kullanın.

Mobil faz veya gelişen çözücü, iyi bir ayırma için mümkün olduğunca polar olmamalıdır. Burada, ekstraksiyon gücünü artırma sırasına göre yaygın mobil fazların bir listesi olan silika jel için bir eluotropik seri gösterilmektedir.

Bir dizi mobil faz aynı anda test edilebilir. Temiz bir tabakta, çözünmüş numuneyi en az 2 cm aralıklarla birden çok kez tespit edin. Her noktaya 1-2 cm çapında bir daire oluşturacak kadar mobil faz uygulayın.

Mobil fazın kat ettiği mesafeyi işaretleyin. Mobil faz yeterince polar değilse, numune ilk noktaya yakın kalacaktır. Mobil faz çok polar ise, numunenin tamamı çözücü cephesi ile birlikte göç edecektir. Uygun bir mobil faz, en dıştaki halka çözücü cephesine olan mesafenin yaklaşık% 50'si ile iyi ayrılmış halkalar gösterecektir.

Gerekirse, istenen özellikleri elde etmek için iki karışabilir mobil faz değişen oranlarda karıştırılabilir. Burada, 1:1 etil asetat ve heksan karışımı çok polardı, ancak 1:20 karışımı uygun şekilde ayrıldı.

Seçilen mobil faz ile plakayı geliştirmeye başlamaya hazırsınız.

Prosedüre başlamak için, piyasada bulunan bir TLC plakasını istenen boyutta kesin. Plakanın bir cam desteği varsa, bir cam kesici ile çizin ve çizgi boyunca dikkatlice kırın.

Bir kalemle, plakanın altından yaklaşık 1 cm uzakta bir taban çizgisi işaretleyin. Numunelerin çizgi boyunca tespit edileceği yeri işaretleyin. Noktaların kenardan en az 1 cm uzakta ve 3 mm aralıklı olduğundan emin olun. Bunları uygun şekilde etiketleyin.

Katı numuneler uygun bir çözücü içinde çözülmelidir. Yaygın çözücüler arasında heksanlar, etil asetat veya diklorometan bulunur. Numuneyi çözecek en az polar çözücüyü kullanın.

Numune/çözücü karışımını bir cam kılcal damar ile çizin. Ucu TLC plakası üzerinde istediğiniz yere nazikçe dokundurun ve hemen çıkarın. Sabit fazı rahatsız etmemek önemlidir.

Noktayı mümkün olduğunca küçük tutun, çünkü bu daha iyi bir ayrılmaya yol açar. Daha fazla numuneye ihtiyaç duyulursa, lekeler her yerde art arda uygulanabilir. Uygulamalar arasında çözücünün kurumasını bekleyin. Daha az uçucu çözücüleri kurutmak için bir hava akımı kullanılabilir.

TLC plakası artık geliştirilmeye hazırdır. Buhar basıncını artırmak için kavanozun dibine bir parça filtre kağıdı yerleştirin. Mobil fazı, taban çizgisine ulaşmayan bir derinliğe ekleyin. Kullanılmadığı zaman kavanozu kapatın, böylece solvent buharları dışarı çıkmaz.

Benekli TLC plakasını gelişmekte olan kavanoza dikkatlice yerleştirin. Mobil aşamanın taban çizgisinin altında olduğundan emin olun. Solvent cephesinin ilerlemesini izliyor musunuz? Mobil aşamanın öncüsü mü? çünkü plakada hızlı bir şekilde hareket edecektir.

Numune bantları difüzyon yoluyla genişlemeye başlayacağından, mobil fazın plakanın üst kenarına ulaşmasına izin vermeyin. Çözücü cephesi üste yaklaştığında, plakayı geliştirme odasından çıkarın ve çözücü kurumadan önce çözücü önünü bir kalemle işaretleyin.

Bileşikler renkli değilse, lekeleri görselleştirmek için bir UV lambası kullanılabilir. Bileşik, plakanın arka plan floresansını engelleyecektir. Lambayı kısa dalga ayarına getirin ve kuru plakayı aydınlatın. Bir kalem kullanarak, lambanın altında görünen noktaları çizin. Bir kalem kullanarak, lambanın altında görünen noktaları çizin.

Başka bir olası görselleştirme tekniği, oksitleyici bir ajan olan potasyum permanganat kullanmaktır. Cımbız kullanarak, plakayı permanganat lekesine batırın.

Fazla çözeltiyi çıkarın ve bir kağıt havluyla kurulayın. Çeker ocakta, lekeleri görselleştirmek için plakayı bir ısı tabancasıyla dikkatlice ısıtın. Görünen noktaları işaretlemek için bir kalem kullanın.

Noktalar görselleştirildikten sonra, ilgilenilen madde burada gösterildiği gibi standartlarla karşılaştırılabilir. Bu örnekte bilinmeyen, organik sentezde bir yapı taşı olan 1,3-difenilpropinondur. Bandı bilinen bir standart ve başlangıç malzemelerinden biri olan benzoil klorür ile karşılaştırarak ürün tanımlanabilir.

Geciktirme faktörü veya Rf, bilinmeyen bileşiği tanımlamak için kullanılır. Rf, bir bileşiğin bir TLC plakasına kadar kat ettiği mesafenin, mobil fazın kat ettiği mesafeye oranıdır. Faktör, taban çizgisinden noktaya olan mesafenin ölçülmesi ve taban çizgisinden çözücü cephesine olan mesafeye bölünmesiyle belirlenir.

Belirli bir bileşiğin Rf'si, çözücü seçimi, adsorbanın kalınlığı ve aktivitesi, sıcaklık ve numune boyutu dahil olmak üzere deneyde kullanılan koşullara bağlıdır. Bu faktörlerin deneyler arasında tutarlı olmasına özen gösterilmelidir.

İnce tabaka kromatografisinin çeşitli uygulamaları vardır.

Bu örnekte, yarasa yağ bezlerinin triaçilgliserit içeriği incelenmiştir. Lipid yüzey fraksiyonu ilk olarak bir TLC plakası üzerinde polarite ile ayrıldı. Triaçilgliserit bandı daha sonra bir spatula ile plakadan çıkarıldı. Silika tozu, çözücü içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Santrifüjlemeden sonra, sabit faz tüpün dibinde bırakılırken, bileşikler çözücü içinde çözünmüş halde kaldı. Triaçilgliseritler daha sonra başka bir fiziksel özellik ile daha da ayrıldı. Bu durumda, ayrılmanın ikinci boyutu moleküler boyuttu.

TLC, bir kimyasal reaksiyonun ilerlemesini izlemek için de kullanılabilir. Bu örnekte, reaksiyonun başlangıç malzemesi standart olarak kullanıldı ve bir TLC plakası üzerinde reaksiyon çözeltisi ile birlikte çalıştırıldı. Bu işlem, reaksiyon boyunca belirli aralıklarla tekrarlandı. Reaksiyon ilerledikçe, başlangıç malzemesi bandı azaldı ve ürün bandı genişledi. Bantlarda herhangi bir değişiklik olmadığında veya başlangıç malzemesinin tamamı tüketildiğinde, reaksiyon tamamlandı. ?

Son olarak, TLC plakaları biyo-tahlillerde kullanılabilir. Bu örnekte, bileşikler TLC ile kırmızı yoncadan ayrıldı. Her bant daha sonra agar plakalarında büyüyen bakterilere yerleştirildi. İnhibe edilmiş bakteri üremesi gösteren moleküller, antimikrobiyal özellikleri açısından daha fazla analiz edildi.

JoVE'nin ince tabaka kromatografisine girişini yeni izlediniz. Artık ayırmanın altında yatan teoriyi, deneyiniz için uygun bir mobil fazı nasıl seçeceğinizi ve bir TLC plakasının nasıl kurulacağını ve çalıştırılacağını anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!