Name: X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Öğrenin T hücresi reseptörü ve peptit HLA proteinlerini biyofiziksel ve yapısal analiz için üretme yöntemlerini. Bu teknik kanser immünoterapisinde yüksek çözünürlüklü mekanistik veriler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BM Kanser Research UK Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. AG, bir Yaşam Bilimleri Araştırma Ağı Galler Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. VB Kanser Araştırma Galler Doktora öğrencilik tarafından desteklenmektedir. DKC bir Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme Görevlisi (WT095767) &#39;dir. AKS, Wellcome Trust Araştırmacı olduğunu. YHİ ortak Yaşam Bilimleri Araştırma Ağı Galler ve Tenovus Cancer Care Doktora Bursu tarafından finanse edilmektedir. Biz tesisleri ve destek sağlamak için Elmas Işık Kaynağı kadroyla teşekkür ederiz.

1. Protein Ekspresyonu <ol><li> Daha önce 17, 18 ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi, çözünür TCRlerin ve pHLAs üretimi için gen yapılarını yapmak. bir 5 &#39;BamH1 ve bir 3&#39; pGMT7 vektörüne sokulması için EcoR1 kısıtlama sahası ile inşa her tasarım. </li><li> 4 ° C&#39;de 50-200 ng / 5 dakika boyunca E.coli 5 uL uL plazmid 1 uL inkübe edilerek ilgili proteini kodlayan sekansı ihtiva eden bir pGMT7 türetilmiş plazmit vektörü ile E.coli Rosetta (DE3) pLysS Transform 42 ° C&#39;de 2 dakika ve 4 ° C&#39;de 5 dakika ve 50 mg / L karbenisilin ile desteklenmiş LB agar plakası üzerinde 37 ° C&#39;de gece boyunca plaka. </li><li> Bireysel koloniler ve süspansiyon kadar 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş 37 ° C ve 220 rpm&#39;de 30 ml TYP ortam içinde (16 g / L tripton, 16 g / L maya ekstresi, 5 g / L HK 2 O 4) büyümesine optik DE ulaşırnsity 0.4 ila 0.6 arasında (OD 600). </li><li> 3 saat boyunca, 0.5 mM izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) verilmesi ile 5 ml kısım protein üretimini uyarmaktadır. ve sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile analiz için uyandırılmadan süspansiyon 20 uL tutmak ve jel leke. </li><li> 100 uM karbenisilin ile desteklenmiş TYP 1 L başlatıcı kültürler ekleyin ve süspansiyon 0.4 ila 0.6 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar adım 1.3 tarif edildiği gibi hücreler büyür. </li><li> 0.5 mM IPTG ile 3 saat boyunca protein ifadesi neden. 3,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca hücreleri Santrifüj ve dikkatli süpernatant dökün. </li><li> Bir 2 s aralığı kullanılarak 30 dakika ila 60% &#39;si güç için, buz üzerinde sonikasyon liziz tamponu 40 mL pelet çözülür (% 10 gliserol, 10 mM magnezyum klorür, MgCI2, 150 mM NaCI, 10 mM Tris, pH 8.1) ve 0.1 g / L DNaz ile 30 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir. </li><li> sus tedaviYıkama tampon maddesi 100 mL inklüzyon cisimcikleri (IB) &#39;şeklindeki proteinleri içeren emekli (% 0.5 Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8.1; 100 mM NaCI; 10 mM EDTA). </li><li> 4 ° C&#39;de 20 dakika ve 8000 x g&#39;de santrifüj numunenin ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün. yeniden süspansiyon tamponu 100 ml pelet askıya-Re (100 mM NaCI, 50 mM Tris, pH 8,1 mM EDTA, pH 8.1 ve 10), bir santrifüj daha önce olduğu gibi 8000 xg, ve dikkatli bir şekilde Süpernatantı dökün. </li><li> Son olarak, guanidin tampon maddesi 10 mL pelet çözülür (6 M guanidin, 50 mM Tris, pH 8.1; 2 mM EDTA, pH 8.1; 100 mM NaCI) ve bir spektrofotometre kullanılarak 280 nm&#39;de protein konsantrasyonu ölçülür. </li></ol> 2. pHLA ve TCR tekrar katlanması <ol><li> pHLA refolds için, bir son hacim içinde, bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de IBS (bir biyotin etiketi ya da HLA-A2) β2m IB, 30 mg ve 30 dakika süre ile 4 mg peptit, HLA-A2 30 mg karıştırın 10 mM ditiotreitol ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL(DTT). </li><li> önceden soğutulmuş bir HLA yeniden katlama tamponu, 1 L önceki karışımı seyrelterek, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 400 mM L-arginin, 2 mM EDTA, pH 8.1, 6 mM sisteamin ve 4 mM sistamin). </li><li> HLA 3 saat boyunca 4 ° C de karıştırılarak yeniden katlama ve daha sonra bir 12.4 kDa&#39;lık bir MWCO halinde (molekül ağırlığı kesme) diyaliz tüpü transfer 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz bırakın. </li><li> TCR refolds için, 10 mM DTT ile takviye edilmiş guanidin tamponu 6 mL bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de 30 dakika süre ile TCR α zinciri IB, 30 mg ve TCR β zinciri IB, 30 mg karıştırın. </li><li> önceden soğutulmuş bir TCR yeniden katlama tamponu 1 L denatüre TCR karışımını, protein yeniden katlaması başlatma (50 mM Tris, pH 8.1; 2.5 M üre, ve 4 mM sistamin, 2 mM EDTA, pH 8.1;, 6 mM sisteamin) 3 h. </li><li> 12.4-kDa&#39;lık bir MWCO diyaliz tüpü içine katlanan aktarın ve 10 mM Tris, pH 8.1 20 L karşı 24 saat boyunca iki kez diyaliz. </li><li> pHLA veya TCR ref hem Filtresaflaştırma adımları için 0.45 um&#39;lik bir membran filtre kullanılarak yaş. </li></ol> Hızlı protein sıvı kromatografi ile 3. saflaştırma (FPLC) <ol><li> 7.9 ml üzerine süzüldü yeniden katlama preparasyonu (pHLA ya da TCR) yüklemek, 50 um anyon değişim reçine kolonu 10 mM Tris, esnek ve sezgisel kromatografi sistemi üzerindeki pH 8.1 20 mL önceden dengelenmiş. </li><li> (8 sütun hacmi boyunca, 10 mM Tris içinde 0-500 mM NaCl, pH 8.1), bir tuz gradyanı ile 5 ml / dak proteinini ayrıştırmak ve 1 mL&#39;lik kısımlar toplanır. </li><li> birlikte ilgili proteini ihtiva eden fraksiyonlar havuzda SDS-PAGE ile, ilgilenilen proteine ​​karşılık gelen fraksiyonlar, analiz etmek ve 4.000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüjleme ile 10 kDa ile 500 uL kadar bir MWCO 20 ya da 10 kDa&#39;lık bir MWCO 4 aşağı konsantre , flow-through atarak. </li><li> 24 ml boyut dışlama kromatografi kolonu üzerine 2 mL enjeksiyon döngüsü içine konsantre edildi proteini preparatları yük uygulama ile önceden dengelenmişropriate elüsyon tamponu: fosfat tamponlu salin (PBS), HBS (10 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM NaCI; 3.4 mM EDTA ve% 0.005 yüzeyaktif madde), veya kristal tamponu (10 mM Tris, pH 8.1 ve 10 mM NaCI ). </li><li> 0.5 mL / dakika hacmi kolonu üzerinde 1 bir akış hızında proteinleri elüte; SDS-PAGE ile doğrulandı ilgili proteini ihtiva eden 1 ml&#39;lik fraksiyonlar toplanır. Not: Bu yöntem çözünebilir PMEL17 TCR ve gp100 TCRler, hem de bu çalışmada kullanılan pHLAs her şekilde üretilmesi için kullanılmıştır: HLA-A * 0201 ile birlikte YLEPGPVTA (A2-yle), YLEPGPVTV (A2-YLE-9V), ALEPGPVTA (A2-YLE-1 a), YLAPGPVTA (A2-YLE-3A), YLEAGPVTA (A2-YLE-4A), YLEPAPVTA (A2-YLE-5A), YLEPGAVTA (A2-YLE-6A), YLEPGPATA (A2-YLE- Şekil 7A) veya YLEPGPVAA (A2-YLE-8A). </li></ol> 4. Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) Analizler <ol><li> Bir CM5 sensör çipi 19 ile donatılmış bir moleküler etkileşim analiz sistemi kullanılarak denge bağlayıcı analizi veya termodinamik analizi yapın. </li><li> f CM5 çip etkinleştiriniyice silinir 1: 10 uL / ​​dakika akış hızında 25 ° &#39;de 10 dakika boyunca 100 mM N-hidroksisüksinimid (NHS) ve 400 mM 1-etil-3- (3-dimetil-propil) -carboiimide (EDC)&#39; nin 1 karışımı C. </li><li> dört akım-hücrelerinde çip yüzeyine bağlama ve devre dışı bırakmak için, 1 M etanolamin hidroklorid, 100 uL kullanımı kovalent yükü yaklaşık 5000 tepki ünitesinde (10 mM asetat, 200 ug 110 ul / ml, pH 4.5) (RU) streptavidin kalan reaktif gruplar. </li><li> pHLA Birkaç yaklaşık 500-600 RU, 10 uL / ​​dakika yavaş bir akış hızında CM5 sensör çipine (üretici tarafından sağlanan), ticari tampon maddesi içinde ~ 1 uM, talaş yüzeyinde üniform dağılım sağlamak için. </li><li> 60 saniye boyunca (üretici tarafından sağlanan) ticari tamponunda 1 mM biotin ile yonga yüzeyi doyurabilecek. </li><li> 25 ° C&#39;de 30 ul / dakikalık bir yüksek akış hızında ilgili akış hücreleri üzerinde çözünür TCRlerin on seri dilüsyonları enjekte edilir. </li><li> denge bağlama sabitini hesaplamak(KD (e)), bir doğrusal olmayan eğri uyum (y = (P1x) / (P2 + x)) ile 20 değerleri kullanarak. NOT: y = tepki birimleri x = analist konsantrasyonu, P1 = r max, P2 = K D. </li><li> 1 varsayarak kinetik analiz gerçekleştirin: bağlama 1 Langmuir ve yazılım paketinde 2 küresel-fit algoritması kullanarak veri uyar. </li><li> 5 ° C, 12 ° C, 18 ° C, 25 ° C ve 30 ° C 19: Aşağıdaki sıcaklıklarda bu yöntemi tekrarlayarak termodinamik deneyleri gerçekleştirmek. </li><li> Standart termodinamik denklemi (ΔG ° = -RTlnK D) 19 kullanılarak ° ΔG hesaplamak için farklı sıcaklıklarda SPR tarafından belirlenen K D değerleri kullanın. NOT: R = gaz sabiti, T K = sıcaklık, ln = doğal günlüğü. </li><li> 19 - Gibbs-Helmholtz denklemi (TΔS ° ΔG ° = AH) göre termodinamik parametreleri hesaplayın. </li&gt; <li> (Üç parametreli denklem uygun bir lineer olmayan regresyon kullanılarak sıcaklığa karşı bağlanma serbest enerjileri, ΔG ° (ΔG ° = -RTlnK D), (k) Konu Y = Sh + ΔCp * (x-298) -X * ΔS- x * ΔCp * ln (x / 298)) 19. : X = ΔG ° K y = sıcaklığı. </li></ol> 5. İzotermal Titrasyon Kalorimetre (ITC) <ol><li> izotermal titrasyon kalorimetre kullanarak ITC deneyleri. şırıngaya Kalorimetre hücre ve yük 210 uM çözünür TCR&#39;yi 30. uM pHLA enjekte edilir. 20 mM Hepes, 150 mM NaCI ihtiva eden (pH 7.4): Aşağıdaki tampon koşulları kullanın. </li><li> 20 TCR enjeksiyonları, 2 mcL hacmi her gerçekleştirin. Analitik yazılımı kullanarak Sh ve K D hesaplayın. </li></ol> 6. Kristalleşme, Kırınım Veri Toplama ve Model Arıtma <ol><li> Bir kristalleşme robot kullanılarak kristalleşme denemeleri yapın. </li><li> vap kristalleri büyürveya kristalleştirme tamponu, 60 ul (ana çözelti) 21 içeren bir rezervuar ile 96 oyuklu bir plaka içerisinde, kuluçka süresi, damla tekniği ile 18 ° C &#39;de difüzyon. </li><li> 10 kDa molekül ağırlıklı bir kesim santrifüjlü konsantre 3000 xg&#39;de eğirme kristal tamponu içinde yaklaşık olarak 10 mg / ml (0.2 mM) çözünür pHLA konsantre edilir. </li><li> yaklaşık 10 mg / ml (0.1 mM) bir protein solüsyonu elde etmek için 1 mol oranında: CO-kompleks yapılar için, Bir 1 TCR ve pHLA karıştırın. </li><li> 24 saat sonra, 48 saat, 72 sonra bir mikroskop altında kristalleri için TCR ve pHLA 1 mol oranı karışımı, bir kristalizasyon robot kullanılarak kristalleştirme ekranından Her rezervuar çözeltisi 200 nL ve skor: Tek başına 200 nL pHLA eklenir, ya da 1 H ve sonra haftada bir kez. </li><li> El mikroskop altında cryo-döngüler onları monte edilerek hasat tek kristaller batış ve sıvı azot (100 K) saklayarak onları cryo-serin. NOT: Yükleme kristaller Uy biraz alırtice ve veri toplama için yeterince iyi olan kristalleri karar tecrübesi ile birlikte geliyor. Genel bir kural, daha büyük ve daha düzenli kristal, daha iyi olarak. </li><li> 100 K azot gazı akımı verileri toplamak Not: Bu veriler Elmas Işık Kaynağı (DLS) İngiltere&#39;de ulusal sinkrotron bilim tesisinde elde edildi. </li><li> Her iki MOSFLM 22 kullanılarak xia2 ile yansıma yoğunlukları tahmin verileri analiz etmek ve XDS 23 paketleri ve daha sonra SCALA veya amaçsız 24 ve CCP4 paketinin 25 ile veri ölçeklendirme. </li><li> Phaser 26 kullanılarak moleküler değiştirme ile yapıları çözün. </li><li> Coot 27 modelini ayarlayın ve REFMAC5 28 modeli rafine. </li><li> Pirol 29 ile grafik temsilleri hazırlayın. </li><li> &quot;Temas&quot; seçeneğini kullanarak kişileri hesaplayınCCP4 paketinde programı. Van der Waals kişiler için 4 Å kesme ve hidrojen bağları ve tuz köprüleri için 3.4 Å cut-off kullanın. </li><li> CCP4 paketinde &quot;SC&quot; programını kullanarak yüzey tamamlayıcılık hesaplayın. </li><li> 30 tarif edildiği gibi, TCR-kompleksinin pHLA kesişme açısı hesaplanır. NOT: Bu çalışma için, yansıma verileri ve son modeli koordinatları PDB veritabanı tevdi edilmiştir (PMEL17 TCR-A2-yle-9V PDB: 5EU6, A2-YLE PDB: 5EU3, A2-yle-3A PDB: 5EU4 ve A2 -YLE-5A PDB: 5EU5). </li></ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması veya rekabet eden mali çıkarları yoktur.

Burada belirtilen protokoller herhangi bir insan hastalığı bağlamında T-hücresi tepkilerinin, moleküler ve hücresel diseksiyon için bir çerçeve sağlar. Kanser Bu çalışmanın ana odak olmasına rağmen, biz virüs 32, 33, 34, 35, T-hücresi tepkilerini araştırmak için çok benzer yaklaşımlar kullanmışlardır 36, 37 ve otoimmünite 38, 39, 40 döneminde. Ayrıca, T-hücresi antijen tanıma 2, 19, 41, 42 yöneten moleküler ilkelerini anlamak için daha geniş bu teknikleri kullandık. Gerçekten de, modifikasyonların öngörülemeyen doğası, hatta kalıntıları peptidTCR temas artıkları dışında, etkileri T-hücre tanıma heteroklitik peptidler tasarımı için önemli etkileri vardır. Bu bulgular doğrudan gelişmiş teşhis 45, 46, 47, yanı sıra peptit aşılarının 6, 43 ve yapay yüksek afiniteli TCR&#39;Irin 3, 4, 5, 20, 44 de dahil olmak üzere, yeni T-hücre tedavilerinin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur. protokolü içinde kritik adımlar yüksek ölçüde saf bir fonksiyonel protein üretimi bu dokümanda belirtilen yöntemlerin tümü için gereklidir. Değişiklikler ve sorun giderme yüksek ölçüde saf protein üreten güçlükler çoğu kez yüksek ekspresyonu ile ilgilidir-Saf E. coli sentezleme sistemi için çözünmeyen IBler. Genellikle, ifade protokolü (örneğin, farklı E.coli suşları kullanılarak, farklı optik yoğunluklarda uyarılması veya farklı medya oluşumları kullanarak) modifiye bu sorunları çözer. tekniğin sınırlamaları Bu teknikler, normal olarak hücre yüzeyinde ifade edilir çözünür protein molekülleri (TCR ve pHLA) kullanın. Böylece, yapısal / biyofizik bulgular biyolojik önemini teyit etmek için hücresel yaklaşımlar ile tutarlı olmasını sağlamak için önemlidir. Mevcut / alternatif yöntemlere göre tekniğin önemi X-ışını kristalografisi ve fonksiyonel analiz ile ispat biyofizik kullanımı sayesinde, biz ve diğerleri, kanser epitoplarına için TCR&#39;ler özgü genellikle düşük bağlanma ilgisi 48 ile karakterize olduğunu göstermiştir. Bu düşük TCR afinite T hücreleri ar açıklamaya yardımcı olabilirE kanseri temizlenmesi de doğal olarak etkili değildir. anti-kanser TCR&#39;lerinin ve soydaş tümör antijenleri arasındaki komplekslerin yüksek çözünürlüklü atomik yapıları bu zayıf afinite moleküler temelini ortaya çıkarmak için başlıyor. Ayrıca, bu çalışmalar gelecekteki gelişmeler 16 ekim, bu sorunu aşmak için tasarlanmış terapötik girişimlerin altında yatan mekanizmaları belirlemek için faydalıdır. Bu çalışmada, bir gp100, HLA-A * 0201 kısıtlı melanom epitopu kompleks bir doğal olarak meydana gelen αβTCR ilk yapısı incelenmiştir. derinlemesine bir biyofiziksel muayene ile kombine yapısı, etkileşim genel bağlayıcı modu saptandı. Ayrıca ve CD8 + T-hücresi tanımayı (fonksiyonel deneyler) (yüzey plasmon rezonansı kullanılarak değerlendirildi) bağlanma TCR iptal peptidin mutasyona uğramış bir biçimde meydana gelen beklenmedik bir molekül anahtarı, ortaya çıkardı. HLA antijeni presentati bu yeni mekanizma göstermek mümkün olmuşturaçıklanan yüksek çözünürlüklü yöntemleri kullanarak. Bu tekniği mastering sonra gelecek uygulamalar veya yön sağlam, fonksiyonel analizler ile kombine edildiğinde Genel olarak, bizim sonuçlar X-ışını kristalografisi ve biyofizik yöntemlerin gücünü göstermek. Bu yaklaşımları kullanarak, T-hücresi antijen tanıma yöneten kesin moleküler mekanizmalar teşrih etmek mümkündür. Gerçekten de, biçim alma değişiklikleri, antijen ayrım 49, 50, 51 boyunca bir rol oynasa gösteren bağlanmamış TCRlerin yapısını çözmek için bu yaklaşım kullanmak da mümkündür. TCR-pHLA etkileşimleri destekleyen son derece karmaşık ve dinamik doğasının daha iyi anlaşılması da tedavi tasarımı için bariz etkileri vardır. doğrudan değişiklikler antijen recognitio var terapötik hedef alınmaktadır molekülleri yanı sıra etkisi &quot;görmek&quot; için güçlü olmakn, açıkça ileriye dönük bu ilaçların geliştirilmesini artıracaktır. Bu çalışmada, yoğun bir TCR ile birleşmeyen tek bir peptid artığı da değişiklikler tahmin edilemeyecek da, önemli ölçüde T-hücresi tanımayı değiştirir, HLA bağlı peptid, diğer kalıntısı elde etmek, yapısal değişiklikler iletebilir göstermektedir. insan hastalıklarının geniş bir aralığı için gelecekteki terapiler tasarımı T hücresi antijen tanıma sırasında kullanılan moleküler mekanizmalar daha tam olarak anlaşılması, oldukça faydalı olacaktır.

X-ışını kristalografisi olmuştur ve ligand-reseptör etkileşimleri doğasını anlamak için son derece güçlü bir tekniktir olmaya devam edecektir. atomik ayrıntılı olarak bu etkileşimleri görselleştirerek, sadece mümkün birçok biyolojik süreçleri düzenleyen moleküler mekanizmaları açıklamaya, ama doğrudan terapötik fayda irtibat arayüzleri değiştirmek de mümkündür. Bu tür yüzey plazmon rezonansı ve (isim sadece bir çift) izotermal titrasyon kalorimetri gibi teknikler ile birleştiğinde, bu tür değişiklikler daha sonra bağlanma afinitesi, etkileşim kinetik ve termodinamik doğrudan etkisini değerlendirmek için biyofiziksel analiz edilebilir. Son olarak, ilgili hücre tipleri üzerinde fonksiyonel deneyler yaparak, reseptör-ligand etkileşimleri değişiklikler moleküler ve fonksiyonel etkisi ayrıntılı bir resim çok özel mekanik bilgi veren, toplanan olabilir. Genel olarak, yöntemler bu tür caydırmak sağlayan bir atomik çözünürlükte görüntü elde<html> tanı ve tedavi gelişmeler için görevli etkileri olan, nasıl çalıştığını, biyolojik sistemleri ermesi. Laboratuvarımız rutin otoimmünite, patojenler ve kansere insan T-hücresi bağışıklık aracılık reseptörleri incelemek için bu teknikleri kullanır ve nakli sırasında. Burada, T-hücresi reseptörü (TCR) ve insan lökosit antijeni (HLA) -restricted tümör kaynaklı peptid (pHLA) arasındaki etkileşim aracılık ettiği kanseri insan CD8 + T-hücresi yanıtı, odak. CD8 + T hücreleri, kanser hücrelerini hedeflemek için mümkün olsa da, ve diğerleri, daha önce bir anti-kanser TCRler Optimal kendi aynı kökenli pHLA 1, 2 bağlanan göstermiştir, çünkü bu önemlidir. Bu nedenle, bir çok laboratuar değiştirme girişiminde ya TCR 3, 4, 5 ya da peptid bağ 6,bağışıklık artırmak amacıyla daha iyi hedef kanserli hücrelerin sınıf = &quot;xref&quot;&gt; 7, 8. Ancak, bu yaklaşımlar her zaman etkili değildir ve hedef dışı toksisite 4, 9, 10 de dahil olmak üzere ciddi yan etkileri olabilir. Kanser antijenleri T-hücre tanıma yöneten moleküler mekanizmaları keşfetmek daha fazla araştırma bu eksiklikleri aşmak için önemli olacaktır. Bu çalışmada, en yaygın * 0201 (HLA-A tarafından sunulan 100 (gp100) glikoprotein farklılaşma melanosit antijenin bir parçası için spesifik CD8 + T hücreleri ile otolog melanoma hücrelerine karşı tepkiler, gp100 280-288, odaklanmış eksprese insan pHLA sınıfı I). Bu antijen, melanom immünoterapisi için çok çalışılan hedef olmuştur ve valin, alanin yerine olan bir sözde &quot;heteroklitik&quot; peptit olarak geliştirilmiştirçapa 9 konumundaki pHLA istikrarı 11 artırmak için. Bu yaklaşım, in vitro melanom reaktif CTL &#39;lerin indüksiyonunu arttırmak için kullanılmış ve başarılı klinik çalışmalarda 12 kullanılmıştır. Bununla birlikte, peptid kalıntılarına modifikasyonlar klinik 6, 13 en heterolitic peptidlerin zayıf etkinlik gösterdiği T-hücresi özgüllüğü, öngörülemeyen etkileri olabilir. Gerçekten de, Glu3 Ala ile ikame edildiği, peptit kısımsını gp100 280-288 diğer heteroklitik şekilde, gp100 280-288 özgü T hücreleri 14, 15 bir poliklonal nüfus tarafından tanınması iptal etmiştir. Daha önce peptid bağlantı kalıntılarının küçük değişikliklere bile hemen hemen tahmin edilemeyecek bir şekilde 6, 16 T-hücresi tanımayı değiştirebileceğini gösterdi. Böylece, çalışma yapı üzerinde durulduCD8 + T hücreleri TCRler ve pHLA arasındaki etkileşimin gp100 ve nasıl modifikasyonları fark ne ilişkin daha ayrıntılı bir görüntü ing bu işlevi etkileyebilir. Burada, HLA-A * 0201 (A2-yle) tarafından sunulan gp100 280-288 özgü iki TCRlerin son derece saf, çözünür formları, yanı sıra pHLA doğal ve değiştirilmiş formları üretilir. Bu reaktifler heteroklitik A2-YLE şeklinde, hem de bağlanmamış formda mutan pHLAs iki ile kompleks olan bir insan TCR üçlü atom yapısını çözmek protein kristallerinin üretilmesi için kullanılmıştır. Daha sonra derinlemesine biyofiziksel deneyler yaparak TCR&#39;lerinin peptit değiştirmelerin etkisini göstermek için bir peptit tarama yaklaşımı kullanılır. Son olarak, genetik olarak modifiye edilmiş CD8 + T hücre soyu elde çeşitli peptid değişiklikler biyolojik etkilerini test etmek fonksiyonel deneyler için, A2-yle özgü TCRlerin bir ifade yeniden programlanabilir. Bu veriler bile Modi ortaya koymaktadırfications öngörülemeyen vuruş on TCR bağlanması ve T-hücre tanıma iptal bitişik peptid artıkları üzerindeki etkileri olabilir TCR bağlanma motifi dışındaki kalıntılarını peptid. Bulgularımız melanom için bu önemli terapötik hedefin T-hücre tanıma altında yatan yapısal mekanizmaların ilk örneğini temsil etmektedir.

<table><tbody><tr><td>S.O.C. media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbi-Safe New Orbit inkübatörü</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>karbenisilin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain SafeStain&nbsp;</td><td>Generon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Legend RT santrifüjü&nbsp;</td><td>Sorvall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnezyum klorür&nbsp;</td><td>Arcos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gliserol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls HD 2070&nbsp;</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA'sı&nbsp;</td><td>Balıkçı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND1000&nbsp;</td><td>Termo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptitler</td><td>Peptit Protein Araştırması</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-arginin&nbsp;</td><td>SAFC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sisteamin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sistamin&nbsp;</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>diyaliz tüpü&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>üre&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metricel 0.45 &mu; m membran filtre</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POROS 10/100 HQ&nbsp;</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ve AUML; KTA saf FPLC sistemi&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 20&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 kDa MWCO Vivaspin 4&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL sütunu&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin&nbsp;</td><td>Oksoit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore tamponu HBS&nbsp;</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biyotinilasyon kiti</td><td>Avidity</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BIAcore T200</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CM5 çip birleştirme kiti</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>streptavidin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcal Başkan Yardımcısı&nbsp;</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fakülte&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gryphon kristalizasyon robotu</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intelli-plaka&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristalizasyon ekranları ve reaktifleri</td><td>Moleküler Boyutlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 flask&nbsp;</td><td>Greiner Bio-Bir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 & mu; m filtreler</td><td>Miller-GP, Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear ultrasantrifüj tüpü ></td><td>SW28 rotorlu Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 mikro boncuklar&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 / CD28 Dynabeads&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-PE mikro boncuklar&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CK orta, PHA</td><td>Alere Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TCRV ve beta; mAb ve nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>BD</tr><tr><td>dasatinib&nbsp;</td><td>Akson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MIP-1 ve beta; ve TNF ve alfa; ELISA&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 51Cr&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1450 Mikrobeta sayacı</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

x-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar yönetim t hücresi kanser antijenleri reseptör tanıma belirlemek için

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

İnsan CD8+ sitotoksik T lenfositlerinin (CTL'ler) tümör kontrolünde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bu işlevi yerine getirmek için, hücre yüzeyinde eksprese edilen T hücresi reseptörü (TCR), insan lökosit antijeni (HLA) ile sınırlı tümör türevli peptitleri (pHLA) işlevsel olarak tanımalıdır. Bununla birlikte, biz ve diğerleri, çoğu TCR'nin tümör antijenlerine optimal olmayan bir şekilde bağlandığını göstermiştir. Bu zayıf tanımayı tanımlayan moleküler mekanizmaların ortaya çıkarılması, bu eksiklikleri gideren yeni hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Gerçekten de, bu moleküler anlayıştan yoksun olan mevcut tedaviler evrensel olarak etkili olmamıştır. Burada, TCR'ler ve pHLA arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz. Bu yöntemler, çözünür TCR'lerin ve pHLA'nın üretilmesini ve bu reaktiflerin X-ışını kristalografisi, biyofiziksel analiz ve pHLA multimerleri ile antijene özgü T hücresi boyaması için kullanılmasını içerir. Bu yaklaşımları kullanarak ve yapısal analizin rehberliğinde, TCR'ler ve pHLA arasındaki etkileşimi değiştirmek ve daha sonra bu modifikasyonların T hücresi antijen tanımayı nasıl etkilediğini test etmek mümkündür. Bu bulgular, bir dizi kanser antijeninin T hücresi tanıma mekanizmasının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olmuştur ve yeni kanser tedavileri için değiştirilmiş peptitlerin ve modifiye TCR'lerin geliştirilmesini yönlendirebilir.

Burada, insan lökosit antijenleri tarafından sunulan T hücresi reseptörü ve tümör antijenleri arasındaki etkileşimin doğasının T hücresi işlevselliğini nasıl yönettiğini belirlemek için laboratuvarda yaygın olarak kullandığımız yöntemleri açıklıyoruz; bu yöntemler arasında protein üretimi, X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel T-hücresi deneyleri yer alır.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Bu prosedürün genel amacı, biyofiziksel ve yapısal analizde kullanım için yeterli kalitede çözünür yaslanmış T-Hücreleri reseptörü ve peptit HLA proteinleri üretmektir. Bu yöntem, T Hücresi İmmünolojisi alanındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, T Hücreleri neden kansere sağlam bir şekilde yanıt vermiyor?Bu tekniğin temel avantajı, T-Hücresi reseptörlerinin hedeflerini nasıl tanıdığını açıklayan ve T-Hücresi aracılı bağışıklık tepkilerine yol açan son derece yüksek çözünürlüklü mekanik veriler elde etmemizdir. Bu tekniğin etkileri, hemen hemen her insan hastalığının tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü T-Hücreleri çoğu bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynar. Bu yöntem, T Hücresi bağışıklık tepkileri hakkında bilgi sağlayabilse de, reseptör ligand etkileşimleri tarafından kontrol edilen diğer sistemlere de uygulanabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, biyofiziksel ve yapısal deneyler için yeterli kalitede çözünür, aktif proteinler üretmek çok zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Peptit HLA yeniden katlama prosedürüne 10 milometre ditiyotreitol ile altı mililitre guanidin tamponuna başlamak için, 30 miligram HLA-A2 inklüzyon cisi, 30 miligram beta 2-M inklüzyon cisimciği ve istenen peptitin dört miligramını ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.Daha sonra, karışımı dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir litre HLA refold tamponu ile seyreltin ve karışımı bu sıcaklıkta üç saat karıştırın. Karışımı, her biri 24 saat boyunca 20 litre 10 milimolar tris, pH 8.1'e karşı iki kez diyalize edin. TCR yeniden katlama prosedürüne başlamak için, 10 milimolar ditiyotreitol ile altı mililitre guanidin tamponuna, TCR Alfa ve beta zinciri IB'lerinin her birine 30 miligram ekleyin.Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve karışımı bir litre önceden soğutulmuş TCR referans tamponu ile seyreltin. Seyreltilmiş TCR referans karışımını, peptit HLA karışımı ile aynı şekilde karıştırın ve diyalize edin. Her iki diyalize edilmiş refold karışımını 0.45 mikrometrelik bir membran filtreden süzün.Daha sonra, filtrelenmiş refold preparatlarından birini, 20 mililitre 10 milimolar tris, pH 8.1 ile önceden dengelenmiş 7.9 mililitre 50 mikrometre anyon değişim reçinesi kolonuna yükleyin. Proteini dakikada beş mililitrelik bir tuz gradyan tampon sistemi ile elute edin. Bir mililitrelik kesirleri toplayın ve kesirleri SDS-Page ile analiz edin.Yeniden katlanmış proteini içeren fraksiyonları birleştirin. Protein karışımını 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj yoğunlaştırıcıya yerleştirin. Karışımı 500 mikrolitreye konsantre etmek için karışımı 20 dakika veya ne kadar uzun olursa olsun, 4000 kez g'de santrifüjleyin.Akışı atın. Konsantre protein preparatını iki mililitrelik bir enjeksiyon döngüsüne kalıplayın ve proteini, uygun elüsiyon tamponu ile önceden dengelenmiş 24 mililitre boyutunda bir dışlama kromatografi kolonuna enjekte edin. Proteini dakikada 0,5 mililitrede bir sütun hacminde tampon ile elute edin.Bir mililitrelik fraksiyonları toplayın, fraksiyonları SDS-Page ile analiz edin ve ilgilenilen proteini içeren fraksiyonları birleştirin. Biliniyorsa, spesifik TCR peptidi HLA etkileşiminin KD'sinin 10 katı ila 10 katı arasında değişen bir konsantrasyon aralığında TCR çözeltisinin 10 seri seyreltmesini hazırlayın. Aksi takdirde, 200 mikromolar TCR konsantrasyonundan başlayın.Daha sonra, 100 milimolar ve N-Hidroksisüksinamid ve 400 milimolar EDC karışımını çip üzerinde 10 dakika boyunca 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede bire bir akıtarak karboksimetillenmiş dekstran kaplı bir sensör çipini etkinleştirin. Ardından, çip yüzeyini işlevsel hale getirmek için dört akış hücresinin tümüne mililitre streptavidin başına 110 mikrolitre 200 mikrogram ve 10 milimolar asetat pH 4.5 yükleyin. Kalan reaktif grupları 100 mikrolitre bir molar etanolamid hidroklorür ile devre dışı bırakın.Daha sonra, çip üreticisi tarafından sağlanan tamponda yaklaşık bir mikromolar peptit HLA'dan oluşan bir çözeltiyi, yanıt birimi sayısı 500 ila 600 arasında bir artışa sahip olana kadar çipin yüzeyi üzerinde dakikada 10 mikrolitre olarak akıtın. Çipin yüzeyini bir milimolar biyotin ve üretim tarafından sağlanan tampon ile 60 saniye boyunca doyurun. Daha sonra, TCR çözeltisinin 10 seri seyreltmesini 25 santigrat derecede dakikada 30 mikrolitre enjekte edin.Denge bağlama sabitini hesaplayın ve bir kinetik analiz yapın. Bu şekilde, yalnızca TCR seyreltmelerinin enjekte edildiği sıcaklığı değiştirerek bir dizi SPR deneyi gerçekleştirin. Her sıcaklık için denge bağlanma sabitini belirleyin ve Gibbs enerjilerini ve diğer termodinamik parametreleri hesaplayın.Doğrusal olmayan bir regresyon uyumu kullanarak Gibbs enerjilerini sıcaklığa karşı takın. Peptit HLA çözeltisini, 10 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj yoğunlaştırıcıda 3.000 kez g'de santrifüjleme yoluyla 0.2 milimolar ve kristalizasyon tamponuna konsantre edin. Ko-kompleks kristalizasyonu için bire bir TCR ve peptit HLA'dan oluşan 0.1 milimolar bir çözelti hazırlayın.Bir kristalizasyon robotu ve bir eleme kiti kullanarak, 96 Kuyulu bir plakada oturarak damla tekniğini kullanarak kristalizasyon denemeleri hazırlayın. Her rezervuarda 60 mikrolitre kristalizasyon tamponu ve her damla 200 nanolitre protein çözeltisi ve tampondan oluşur. Kristalleri 18 santigrat derecede büyütün.24 saat, 48 saat, 72 saat sonra mikroskop altında kristaller için puan verin ve ardından haftalık olarak. Yeterli kalitede tek kristaller büyüdükten sonra, tek kristalleri kriyojen uyumlu bir döngü ile hasat edin ve kristalleri sıvı nitrojen içinde saklayın. 100 kelvin'de bir nitrojen gazı akışı altında senkrotron x-ışını kırınımı gerçekleştirin, verileri analiz edin ve yapıları uygun yazılımla çözün.Çözülmüş yapılardan kontakları, yüzey tamamlayıcılığını ve geçiş açısını hesaplayın. Bu yöntemler kullanılarak, TCR ve peptit HLA molekülleri eksprese edildi ve çözünür bir forma yeniden katlandı. Peptit HLA moleküllerindeki peptit, gp100 antijeniydi.SPR, PMEL17 TCR'nin çeşitli sıcaklıklarda antijen için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Daha sonra protein-protein etkileşiminin termodinamik parametrelerini belirlemek için SPR ve izotermal kalorimetrik titrasyon kullanıldı. PMEL17 TCR A2-YLE-9V kompleksi kristalize edildi ve senkrotron x-ışını kırınımı ile değerlendirildi.TCR proteini ile temas eden TCR CDR döngüleri ve peptit HLA kalıntılarının her ikisi de tanımlandı ve temasların doğası incelendi. Peptitin mutasyona uğramış formlarına sahip peptit HLA molekülleri de bu şekilde saflaştırıldı ve kristalleştirildi. TCR ile bağlanma etkileşimlerini engelleyebilecek yapısal farklılıkları araştırmak.Üçüncü veya beşinci kalıntının mutasyonunun, prolin dördünün konumunu önemli ölçüde değiştirdiği bulundu, bu da TCR CDR-3 Alfa Döngüsü ile temasların çoğunu bozacaktı. Bu prosedürü denerken, daha fazla analiz için yalnızca en saf proteinleri seçmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, peptit HLA tetramer boyama gibi diğer yöntemler, teşhis ve daha ileri analizler için antijene özgü T-Hücrelerini hasta kanından izole etmek için çözünür proteinler kullanılarak gerçekleştirilebilir.Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, T-Hücre immünolojisi alanındaki araştırmacıların, TCR peptit HLA bağlanmasını en ince ayrıntısına kadar keşfetmelerinin yolunu açarak, kanser ve diğer insan hastalıkları için yeni ilaçların geliştirilmesini sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, biyofiziksel ve yapısal analiz yapmak için yeterli kalitede TCR ve peptit HLA proteinlerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.

using-x-ray-crystallography-biophysics-functional-assays-to-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Krom salınım tahlili, sitotoksik T hücresi aktivitesini tespit etmek için ortak bir tahlil, bazı sınırlamalar vardır. Bu madde, antijen spesifik CD8 T hücreleri ve insan göğüs kanseri tümör hattı ile, SKBR3 kullanarak, bir empedans dayalı bir yaklaşım hücre öldürme saptama yeteneğine için incelenmiştir.

XCELLigence Sistemi Cr51 Yayın Assay Karşılaştırılması tarafından İnsan Her2neu Özgül CD8 T hücrelerinin Optimal Sitotoksik Aktivite Belirlenmesi

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Sitometresi tabanlı hücresel bağlama tahlil anlatılan ve öncelikle bir tarama aracı olarak bir fluorescently etiketli CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12) bağlama CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) inhibe bileşikler tanımlamak için kullanılan bir akış.

Fluorescently etiketli CXC Kemokin Ligand 12 CXC Kemokin reseptör 4 için bağlama bozabilir bileşikler tanımlamak için Akış Sitometresi tabanlı tahlil

Bu kağıt akış sitometresi-tabanlı bir tahlil kimyasal inhibitörleri ekran kitaplıklarına inhibitörleri ve T hücre reseptör sinyal etkileyen hedefleri tanımlaması için kullanır. Yöntem tanımlamak burada da yüksek üretilen iş gösterimleri için genişletilebilir.

T-hücre reseptör üzerinden tarama kimyasal inhibitörü kütüphanelerin sinyal arabulucu tanımlaması

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Burada fare tümörü ksenogreft modellerinde antikorların in vivo lokalizasyonunu incelemek için bir protokol sayılmaktadır.

Hedef Antijen Spesifik Terapötik Antikor tümör ve doku dağılımının analizi

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Burada sunulan, kullanıma hazır bir radyoetiketleme synthonu, [89 Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89Zr]Zr-p-izotiyosiyatobenzil-desferrioksamin ([89 Zr]Zr-DBN) kullanılarak bir pozitron emisyon tomografisi (PET) radyoizotopu, 89Zr (t1/2 78.4 h) ile radyoetiket hücrelerine yönelik bir protokoldür. [89Zr] Zr-DBN ile radyo-etiketleme hücreleri, uygulamadan sonra 7 güne kadar PET ile vücutta uygulanan radyoaktif işaretli hücrelerin invaziv olmayan izlenmesine ve görüntülenmesine izin...

Hücre Kaçakçılığının Pozitron Emisyon Tomografisi Görüntülemesi: Bir Hücre Radyo-Etiketleme Yöntemi

Öğrenin T hücresi reseptörü ve peptit HLA proteinlerini biyofiziksel ve yapısal analiz için üretme yöntemlerini. Bu teknik kanser immünoterapisinde yüksek çözünürlüklü mekanistik veriler sağlar.

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için (Video) | JoVE Journal

X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Daha fazla video keşfet