X-ışını kristalografisi, biyofizik ve fonksiyonel tahliller kullanılarak mekanizmalar Yönetim T hücresi kanser antijenleri Reseptör tanıma belirlemek için

Bu prosedürün genel amacı, biyofiziksel ve yapısal analizde kullanım için yeterli kalitede çözünür yaslanmış T-Hücreleri reseptörü ve peptit HLA proteinleri üretmektir. Bu yöntem, T Hücresi İmmünolojisi alanındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, T Hücreleri neden kansere sağlam bir şekilde yanıt vermiyor?

Bu tekniğin temel avantajı, T-Hücresi reseptörlerinin hedeflerini nasıl tanıdığını açıklayan ve T-Hücresi aracılı bağışıklık tepkilerine yol açan son derece yüksek çözünürlüklü mekanik veriler elde etmemizdir. Bu tekniğin etkileri, hemen hemen her insan hastalığının tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü T-Hücreleri çoğu bağışıklık tepkisinde çok önemli bir rol oynar. Bu yöntem, T Hücresi bağışıklık tepkileri hakkında bilgi sağlayabilse de, reseptör ligand etkileşimleri tarafından kontrol edilen diğer sistemlere de uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, biyofiziksel ve yapısal deneyler için yeterli kalitede çözünür, aktif proteinler üretmek çok zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Peptit HLA yeniden katlama prosedürüne 10 milometre ditiyotreitol ile altı mililitre guanidin tamponuna başlamak için, 30 miligram HLA-A2 inklüzyon cisi, 30 miligram beta 2-M inklüzyon cisimciği ve istenen peptitin dört miligramını ekleyin. Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, karışımı dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş bir litre HLA refold tamponu ile seyreltin ve karışımı bu sıcaklıkta üç saat karıştırın. Karışımı, her biri 24 saat boyunca 20 litre 10 milimolar tris, pH 8.1'e karşı iki kez diyalize edin. TCR yeniden katlama prosedürüne başlamak için, 10 milimolar ditiyotreitol ile altı mililitre guanidin tamponuna, TCR Alfa ve beta zinciri IB'lerinin her birine 30 miligram ekleyin.

Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin ve karışımı bir litre önceden soğutulmuş TCR referans tamponu ile seyreltin. Seyreltilmiş TCR referans karışımını, peptit HLA karışımı ile aynı şekilde karıştırın ve diyalize edin. Her iki diyalize edilmiş refold karışımını 0.45 mikrometrelik bir membran filtreden süzün.

Daha sonra, filtrelenmiş refold preparatlarından birini, 20 mililitre 10 milimolar tris, pH 8.1 ile önceden dengelenmiş 7.9 mililitre 50 mikrometre anyon değişim reçinesi kolonuna yükleyin. Proteini dakikada beş mililitrelik bir tuz gradyan tampon sistemi ile elute edin. Bir mililitrelik kesirleri toplayın ve kesirleri SDS-Page ile analiz edin.

Yeniden katlanmış proteini içeren fraksiyonları birleştirin. Protein karışımını 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme santrifüj yoğunlaştırıcıya yerleştirin. Karışımı 500 mikrolitreye konsantre etmek için karışımı 20 dakika veya ne kadar uzun olursa olsun, 4000 kez g'de santrifüjleyin.

Akışı atın. Konsantre protein preparatını iki mililitrelik bir enjeksiyon döngüsüne kalıplayın ve proteini, uygun elüsiyon tamponu ile önceden dengelenmiş 24 mililitre boyutunda bir dışlama kromatografi kolonuna enjekte edin. Proteini dakikada 0,5 mililitrede bir sütun hacminde tampon ile elute edin.

Bir mililitrelik fraksiyonları toplayın, fraksiyonları SDS-Page ile analiz edin ve ilgilenilen proteini içeren fraksiyonları birleştirin. Biliniyorsa, spesifik TCR peptidi HLA etkileşiminin KD'sinin 10 katı ila 10 katı arasında değişen bir konsantrasyon aralığında TCR çözeltisinin 10 seri seyreltmesini hazırlayın. Aksi takdirde, 200 mikromolar TCR konsantrasyonundan başlayın.

Daha sonra, 100 milimolar ve N-Hidroksisüksinamid ve 400 milimolar EDC karışımını çip üzerinde 10 dakika boyunca 10 dakika boyunca 25 santigrat derecede bire bir akıtarak karboksimetillenmiş dekstran kaplı bir sensör çipini etkinleştirin. Ardından, çip yüzeyini işlevsel hale getirmek için dört akış hücresinin tümüne mililitre streptavidin başına 110 mikrolitre 200 mikrogram ve 10 milimolar asetat pH 4.5 yükleyin. Kalan reaktif grupları 100 mikrolitre bir molar etanolamid hidroklorür ile devre dışı bırakın.

Daha sonra, çip üreticisi tarafından sağlanan tamponda yaklaşık bir mikromolar peptit HLA'dan oluşan bir çözeltiyi, yanıt birimi sayısı 500 ila 600 arasında bir artışa sahip olana kadar çipin yüzeyi üzerinde dakikada 10 mikrolitre olarak akıtın. Çipin yüzeyini bir milimolar biyotin ve üretim tarafından sağlanan tampon ile 60 saniye boyunca doyurun. Daha sonra, TCR çözeltisinin 10 seri seyreltmesini 25 santigrat derecede dakikada 30 mikrolitre enjekte edin.

Denge bağlama sabitini hesaplayın ve bir kinetik analiz yapın. Bu şekilde, yalnızca TCR seyreltmelerinin enjekte edildiği sıcaklığı değiştirerek bir dizi SPR deneyi gerçekleştirin. Her sıcaklık için denge bağlanma sabitini belirleyin ve Gibbs enerjilerini ve diğer termodinamik parametreleri hesaplayın.

Doğrusal olmayan bir regresyon uyumu kullanarak Gibbs enerjilerini sıcaklığa karşı takın. Peptit HLA çözeltisini, 10 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj yoğunlaştırıcıda 3.000 kez g'de santrifüjleme yoluyla 0.2 milimolar ve kristalizasyon tamponuna konsantre edin. Ko-kompleks kristalizasyonu için bire bir TCR ve peptit HLA'dan oluşan 0.1 milimolar bir çözelti hazırlayın.

Bir kristalizasyon robotu ve bir eleme kiti kullanarak, 96 Kuyulu bir plakada oturarak damla tekniğini kullanarak kristalizasyon denemeleri hazırlayın. Her rezervuarda 60 mikrolitre kristalizasyon tamponu ve her damla 200 nanolitre protein çözeltisi ve tampondan oluşur. Kristalleri 18 santigrat derecede büyütün.

24 saat, 48 saat, 72 saat sonra mikroskop altında kristaller için puan verin ve ardından haftalık olarak. Yeterli kalitede tek kristaller büyüdükten sonra, tek kristalleri kriyojen uyumlu bir döngü ile hasat edin ve kristalleri sıvı nitrojen içinde saklayın. 100 kelvin'de bir nitrojen gazı akışı altında senkrotron x-ışını kırınımı gerçekleştirin, verileri analiz edin ve yapıları uygun yazılımla çözün.

Çözülmüş yapılardan kontakları, yüzey tamamlayıcılığını ve geçiş açısını hesaplayın. Bu yöntemler kullanılarak, TCR ve peptit HLA molekülleri eksprese edildi ve çözünür bir forma yeniden katlandı. Peptit HLA moleküllerindeki peptit, gp100 antijeniydi.

SPR, PMEL17 TCR'nin çeşitli sıcaklıklarda antijen için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Daha sonra protein-protein etkileşiminin termodinamik parametrelerini belirlemek için SPR ve izotermal kalorimetrik titrasyon kullanıldı. PMEL17 TCR A2-YLE-9V kompleksi kristalize edildi ve senkrotron x-ışını kırınımı ile değerlendirildi.

TCR proteini ile temas eden TCR CDR döngüleri ve peptit HLA kalıntılarının her ikisi de tanımlandı ve temasların doğası incelendi. Peptitin mutasyona uğramış formlarına sahip peptit HLA molekülleri de bu şekilde saflaştırıldı ve kristalleştirildi. TCR ile bağlanma etkileşimlerini engelleyebilecek yapısal farklılıkları araştırmak.

Üçüncü veya beşinci kalıntının mutasyonunun, prolin dördünün konumunu önemli ölçüde değiştirdiği bulundu, bu da TCR CDR-3 Alfa Döngüsü ile temasların çoğunu bozacaktı. Bu prosedürü denerken, daha fazla analiz için yalnızca en saf proteinleri seçmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, peptit HLA tetramer boyama gibi diğer yöntemler, teşhis ve daha ileri analizler için antijene özgü T-Hücrelerini hasta kanından izole etmek için çözünür proteinler kullanılarak gerçekleştirilebilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, T-Hücre immünolojisi alanındaki araştırmacıların, TCR peptit HLA bağlanmasını en ince ayrıntısına kadar keşfetmelerinin yolunu açarak, kanser ve diğer insan hastalıkları için yeni ilaçların geliştirilmesini sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, biyofiziksel ve yapısal analiz yapmak için yeterli kalitede TCR ve peptit HLA proteinlerinin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.