293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Tufts New England Tıp Merkezi'ndeki Moleküler Onkoloji Araştırma Enstitüsü'ndeyiz. Benim adım Christina Lesco ve Dr. Rick Van'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Laboratuvarımız, insan immünogen lösemiyi, KML'yi ve KML benzeri hastalıkları incelemek üzerine çalışmaktadır.

Bu insan hastalığını fareler üzerinde modelliyoruz ve bunu, insan onkogenini retroviral bir vektör aracılığıyla aktararak gerçekleştiriyoruz. Bu nedenle, söz konusu insan onkogenini fare hücrelerine aktarmak için yapılması gereken ilk işlem, virüsün kendisini üretmektir. Bir sonraki adım ise virüsü gerçek anlamda paketlemek olacaktır.

İşte 2 9 3 T hücreleri stok plağım. Besiyerini PBS ile yıkamam gerekecek. 2 9 3 T hücreleri yapışkan hücrelerdir, ancak aşırı derecede yapışkan olmadıkları için her hareket oldukça nazikçe yapılmalıdır. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, PBS'yi tripsin ile değiştireceğiz.

Hücreleri plakadan ayırmak için, plağı yaklaşık üç dakika boyunca tekrar inkübatöre yerleştirmemiz gerekir. Böylece iki üç dakika sonra hücreler aslında süspansiyon haline gelir. Birkaç ml daha standart besiyeri ekleyeceğiz.

Bu işlem tripsini nötralize edecektir. Bu aşamada, tüm hücrelerin süspansiyonda olduğundan emin olmak için yukarı aşağı pipetleme yapıyoruz; ardından süspansiyonu 50 ml'lik bir tüpe aktarıyoruz ve trypan blue varlığında hücreleri saymak için bir hemositometre kullanarak manuel sayım gerçekleştiriyoruz. Şimdi hesapladığım şekilde dilüsyonu yapıyorum ve her plak için 3 × 10⁶ hücre ekeceğim.

Dört ml besiyeri içerisinde hücrelerin iyi bir şekilde ekildiğinden emin oluyoruz ve plakları 16 ila 18 saat boyunca, genellikle ertesi sabaha kadar, inkübatöre geri koyacağız. Şu an GFP virüs enfeksiyonundan 48 saat sonrasındayız. Klorokin, hücrelere ekleyeceğimiz DNA'nın alımını artırmak için kullanılır.

Plakaların kenarlarından hafifçe vakumlayarak, artık plakalara yapışmış olan hücrelerin üzerindeki besiyerini dikkatlice çektik. Bu aşamada, plakaları yaklaşık bir saat boyunca inkübatörlere geri yerleştireceğiz. Bu sırada, hücrelere uygulamak üzere DNA karışımımızı hazırlayacağız; hücrelerin bir grubu neomisin direnç genini, diğer grubu ise GFP'yi eksprese etmektedir. Tüm transfeksiyon işlemi için kontrol amacıyla XI DNA kullanıyorum.

Son olarak, kalsiyum klorür ekliyoruz. Kalsiyum klorür kullanımı, transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırır. Bir saat sonrasındayız; klorokin besiyerli plakaları aldık ve şimdi transfeksiyon solüsyonumuzu ekleyeceğiz.

Yapmamız gereken son adım, 2x steril HBS eklerken aslında 1 ml 2x steril HBS ilave etmektir. Aynı zamanda tüpü vortekse tabi tutmamız ve damla damla, yavaşça ilerlememiz gerekir. Bu işlem çökmeleri önlemek içindir; ardından hemen 1 ml çözeltiyi ilgili plakaya, yine damla damla olacak şekilde dağıtıyoruz.

Bu aşamada, kullandığımız klorokinli ortam nedeniyle 2 9 3 T hücreleri oldukça duyarlı hale gelmiştir. Tüm alanın kaplı olduğundan emin olmamız ve plakaları mümkün olduğunca az hareket ettirmemiz gerekir; plakayı eklediğiniz konstrükt ile etiketleyin ve bir sonraki konstrükt için işlemi tekrarlayın.

Bu noktada, plakaları yedi ila 11 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Klorokin nedeniyle hücreler çok duyarlı hale geldiği ve bu sürenin sonunda besiyerini değiştirmemiz gerekeceği için süre en az yedi, ancak 11 saatten fazla olmamalıdır. Şu anda transfeksiyondan yaklaşık 30 saat sonrasındayız.

Bu, bu aşamadaki son besiyeri değişimimizdir; 2 9 3 C3 T hücreleri konfluense ulaşmıştır. Yeni besiyerini plağın kenarından eklerken yine çok nazik olmalıyız. İğneli 10 ml'lik bir şırınga kullanıyorum.

İğneyi bir filtre ile değiştireceğim, bu nedenle şu noktada besiyerini iyice karıştırıyorum; virüsümüzü topladık ve kullanana kadar -80 °C'ye yerleştirebiliriz. Yapılması gereken ilk şey aslında virüsü titrelenmektir. Virüs üretimi sırasında hassas birkaç adım vardır ve bunlardan ilki 293T hücrelerinin doğru konsantrasyonudur.

Hücreleri, 18 saat sonra yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşacakları için plaka başına 10⁶ hücre olacak şekilde ekiyoruz. Bu durum, hücrelere daha fazla büyüme süresi tanır; böylece transfeksiyondan 24 saat sonra %100 konfluense ulaşırlar. Bunun, mükemmel bir virüs titresi elde etmek için oldukça önemli olduğu gösterilmiştir.

Bir sonraki adım klorokin kullanımıdır ve klorokin kullanımı aslında 2 9 3 hücrelerini duyarlı hale getirir; ayrıca, 2 9 3 T hücrelerinin tüm tabakasının plakadan kalkmaması için tüm besiyeri değişimleri çok nazikçe yapılmalıdır. Son olarak, virüs üretmek için kullandığınız DNA son derece temiz olmalıdır. Biz, C bantlı DNA kullanıyoruz.

Virüsümüzü elde ettikten sonra -80 °C'de saklarız. Genellikle takibini yaparız; her çözme işlemi virüs titresini iki kat azaltacaktır. Bu nedenle, virüsün gerçek titresini belirlemeden önce, hazırladığımız virüsü dondurmayı tercih ederiz.

Virüslere bağlı olarak, gerçek enfekte hücreleri takip etmek için virüsle birlikte GFP ekspresyonuna sahip olabiliriz veya neomisin direncine sahip olabiliriz. Deneyler arasında veya farklı mutantlar arasında uyum sağlayabilmek için, virüsü kullanmadan önce titresinin belirlenmiş olması çok önemlidir.