Name: 293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Keşfedin, 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon ile çoğaltma-arızalı retrovirus üretimini. Bu yöntem, insan onkogenlerini fare modellerinde miyeloproliferatif hastalık oluşturmak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li> 3-5x10 6 hücre / 6 cm doku cultureplate dönüşümü, plaka 293T hücreleri önce akşam. Not: Biz transfeksiyon ve efficacyas virüs üreten hücrelerin kendi kolaylığı için 293T hücreleri kullanır. Bu hücreler, plazmid bir yardımcı tanıtıldı sürece virüs ambalaj eksikliği vardır . </li><li> Sabah ilk, orta hafifçe kaldırın ve 4 ml 293T hücre med 25 mM Klorokin içeren değiştirin. 1 saat için kuvöz koyun. Not: plaka konfluent yaklaşık% 80 olmalıdır. </li><li> Bu arada, 5 ml tüpler, bir seferde 2 plakaları için virüs yapımı karışımının hazırlanması: <ol><li> 2 x 10 mg retroviral plazmid inşa </li><li> 2 x 5 mg ambalaj inşa (EcoPak) </li><li> 2 x 62 ml CaCl </li><li> 1 ml steril GKD 2 O ile tamamlamak Not: retroviral plazmid faiz ve bir işaretleyici onkogen kodlar, EcoPak gag-pol-env kodlar. 293T hücreleri ile birlikte, bir fare hücreleri için spesifik ecotropic retrovirüs (RV), ama insan hücreleri için enfektif üretecektir. Klorokin ve CaCl 2 transfeksiyon verimliliği artırmak için gösterilmiştir. </li></ol></li><li> 2x sterileHBS 1ml ise tüp hafifçe karıştırın, karışımın açılan akıllıca ekleyin. </li><li> Hemen hafifçe 2 tabak, her biri 1 ml, bu çözümü eklemek damla bırak. </li><li> 7 ila 11 saat için kuvöz koyun. </li><li> Akşam (7 ila 11 saat sonra), yavaşça orta kaldırmak ve çok yavaşça 5 ml taze 293T orta ile değiştirin. , Ertesi gün öğlene kadar kuvöz koyun. Not: Bu adım, hücrelerin klorokin çıkarmak için ihtiyacınız olan önemlidir. Uzun süre devam ederse, klorokin toksiktir. Plakalarda çözüm transfeksiyon karışımı çok ince bir toz gibi yağış nedeniyle, bulanık görünüyor. Not: klorokin duyarlı hücreler olan ve plakası kolayca ayırmak gibi, aşırı yumuşaklığı ile tüm medya değişiklikleri yapmak önemlidir. </li><li> Ertesi gün, 18 ila 24 saat. Öğleyin) virüsü (almadan önce, hafifçe orta kaldırmak ve çok nazikçe 3 ml taze 293T orta ile değiştirin. Inkübatör O / N değiştirin. </li><li> Üçüncü sabah (18 ila 24 saat sonrası), yavaşça, 18 G iğne ile donatılmış 10 ml şırınga ile orta formu plakaları emmek. Bu süpernatant retrovirüs içerir. </li><li> ,, 45 mm şırınga filtre iğne, şırınga iyi çözüm karıştırmak için birkaç kez ters filtre ile süpernatant geçmek ve cryotubes içinde kısım Not: Alternatif olarak, 5 0 ml konik tüp içine virüs, havuz aynı virüs tüm süpernatantlar 3 + plaka yapıyoruz. Cryotubes retrovirüs içeren kısım süpernatantlar filtreleyerek, sonra iyice karıştırın. </li><li> Virüs dolu süpernatantlar içeren tüpler -80 ° C&#39;ye kadar içinde tutulur. </li></ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Dört kritik noktaları iyi bir virüs stokunun başarısını temin edecektir: <ol><li> 293T üreten hücrelerin bir yoğunluk ulaşmak olduğunu, bu yüzden, çok düzenli olarak bölünmüş olan, yani çok sağlıklı olmak için büyümüş asla ve 6 cm doku kültürü plaka başına 3.5-5 milyon optimize yoğunlukta kaplama transfeksiyon sabahı plaka% 80. </li><li> Hücre lysozomes stabilize ve çekirdeği ulaşır DNA kesir artırarak, 5-kat klorokin eklenmesi yaklaşık 3 transfeksiyon verimliliği ve daha sonraki bir virüs titresi geliştirir. Sodyum butirat ...

Transfeksiyon kullanılan tüm reaktifler steril filtre edilir (CaCl 2, 2x HBS, miliQ H 2 O) ve steril tutulan gerekir.

293t hücreleri geçici transfeksiyon Çoğaltma-arızalı retrovirus Üretimi

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Bcr-Abl veya büyüme faktörü reseptör-kaynaklı onkogenler (ZNF198 FGFR1, Bcr-PDGFRα, vb) gibi onkogenler tarafından uyarılan laboratuar çalışmaları insan myeloproliferatif hastalıklar. Biz fare modelinde daha önce ilgi onkogen ifade bir retrovirüs ile enfekte kemik iliği hücrelerinin nakli, insan gibi bir hastalık modeli ve çalışma edebiliyoruz. Çoğaltma arızalı retrovirüs bir insan onkogen kodlama ve bir işaretleyici (GFP, RFP, antibiyotik direnç geni, vb.) 293T hücreleri, adenovirüs E1A gen ürünü tarafından dönüştürülmüş bir insan böbrek epitel hücre hattı kullanarak geçici bir transfeksiyon protokol tarafından üretilir. Kolayca ulaşılabilir% 50-80 transfeksiyon verimliliği kadar 293 hücreler, kalsiyum fosfat (Capo 4) yüksek transfectable olağandışı bir özelliği var . Burada, ilgi onkogen ve ambalaj Bu durumda kat veya PCL, yapıları tek genom EcoPak plazmid gibi gag-pol-env ambalaj fonksiyonları, ifade eden bir plazmid ifade retroviral vektör ile 293 hücreleri transfect ortak. Ilk transfeksiyon daha klorokin kullanımı artırıldı. Ecotropic virüs Hisse Senetleri, kültür süpernatant 48 saat olarak toplanır. post-transfeksiyon, C ° -80 saklanan ve dönüşüm görünümünde ve in vitro çalışmalardan sonra fare modeli nakli için kullanılabilir hücre hatları, ya da, fare kemik iliği hücreleri gibi birincil hücreleri, enfeksiyon için kullanılır. .

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Laboratuvarımız, Bcr-Abl gibi onkogenler veya büyüme faktörü reseptörü kaynaklı onkogenler (ZNF198-FGFR1, ... ile tetiklenen insan miyeloproliferatif hastalıklarını incelemektedir.

Tufts New England Tıp Merkezi'ndeki Moleküler Onkoloji Araştırma Enstitüsü'ndeyiz. Benim adım Christina Lesco ve Dr. Rick Van'ın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Laboratuvarımız, insan immünogen lösemiyi, KML'yi ve KML benzeri hastalıkları incelemek üzerine çalışmaktadır.Bu insan hastalığını fareler üzerinde modelliyoruz ve bunu, insan onkogenini retroviral bir vektör aracılığıyla aktararak gerçekleştiriyoruz. Bu nedenle, söz konusu insan onkogenini fare hücrelerine aktarmak için yapılması gereken ilk işlem, virüsün kendisini üretmektir. Bir sonraki adım ise virüsü gerçek anlamda paketlemek olacaktır.İşte 2 9 3 T hücreleri stok plağım. Besiyerini PBS ile yıkamam gerekecek. 2 9 3 T hücreleri yapışkan hücrelerdir, ancak aşırı derecede yapışkan olmadıkları için her hareket oldukça nazikçe yapılmalıdır. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, PBS'yi tripsin ile değiştireceğiz.Hücreleri plakadan ayırmak için, plağı yaklaşık üç dakika boyunca tekrar inkübatöre yerleştirmemiz gerekir. Böylece iki üç dakika sonra hücreler aslında süspansiyon haline gelir. Birkaç ml daha standart besiyeri ekleyeceğiz.Bu işlem tripsini nötralize edecektir. Bu aşamada, tüm hücrelerin süspansiyonda olduğundan emin olmak için yukarı aşağı pipetleme yapıyoruz; ardından süspansiyonu 50 ml'lik bir tüpe aktarıyoruz ve trypan blue varlığında hücreleri saymak için bir hemositometre kullanarak manuel sayım gerçekleştiriyoruz. Şimdi hesapladığım şekilde dilüsyonu yapıyorum ve her plak için 3 × 10⁶ hücre ekeceğim.Dört ml besiyeri içerisinde hücrelerin iyi bir şekilde ekildiğinden emin oluyoruz ve plakları 16 ila 18 saat boyunca, genellikle ertesi sabaha kadar, inkübatöre geri koyacağız. Şu an GFP virüs enfeksiyonundan 48 saat sonrasındayız. Klorokin, hücrelere ekleyeceğimiz DNA'nın alımını artırmak için kullanılır.Plakaların kenarlarından hafifçe vakumlayarak, artık plakalara yapışmış olan hücrelerin üzerindeki besiyerini dikkatlice çektik. Bu aşamada, plakaları yaklaşık bir saat boyunca inkübatörlere geri yerleştireceğiz. Bu sırada, hücrelere uygulamak üzere DNA karışımımızı hazırlayacağız; hücrelerin bir grubu neomisin direnç genini, diğer grubu ise GFP'yi eksprese etmektedir. Tüm transfeksiyon işlemi için kontrol amacıyla XI DNA kullanıyorum.Son olarak, kalsiyum klorür ekliyoruz. Kalsiyum klorür kullanımı, transfeksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırır. Bir saat sonrasındayız; klorokin besiyerli plakaları aldık ve şimdi transfeksiyon solüsyonumuzu ekleyeceğiz.Yapmamız gereken son adım, 2x steril HBS eklerken aslında 1 ml 2x steril HBS ilave etmektir. Aynı zamanda tüpü vortekse tabi tutmamız ve damla damla, yavaşça ilerlememiz gerekir. Bu işlem çökmeleri önlemek içindir; ardından hemen 1 ml çözeltiyi ilgili plakaya, yine damla damla olacak şekilde dağıtıyoruz.Bu aşamada, kullandığımız klorokinli ortam nedeniyle 2 9 3 T hücreleri oldukça duyarlı hale gelmiştir. Tüm alanın kaplı olduğundan emin olmamız ve plakaları mümkün olduğunca az hareket ettirmemiz gerekir; plakayı eklediğiniz konstrükt ile etiketleyin ve bir sonraki konstrükt için işlemi tekrarlayın.Bu noktada, plakaları yedi ila 11 saat boyunca inkübatöre yerleştirin. Klorokin nedeniyle hücreler çok duyarlı hale geldiği ve bu sürenin sonunda besiyerini değiştirmemiz gerekeceği için süre en az yedi, ancak 11 saatten fazla olmamalıdır. Şu anda transfeksiyondan yaklaşık 30 saat sonrasındayız.Bu, bu aşamadaki son besiyeri değişimimizdir; 2 9 3 C3 T hücreleri konfluense ulaşmıştır. Yeni besiyerini plağın kenarından eklerken yine çok nazik olmalıyız. İğneli 10 ml'lik bir şırınga kullanıyorum.İğneyi bir filtre ile değiştireceğim, bu nedenle şu noktada besiyerini iyice karıştırıyorum; virüsümüzü topladık ve kullanana kadar -80 °C'ye yerleştirebiliriz. Yapılması gereken ilk şey aslında virüsü titrelenmektir. Virüs üretimi sırasında hassas birkaç adım vardır ve bunlardan ilki 293T hücrelerinin doğru konsantrasyonudur.Hücreleri, 18 saat sonra yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşacakları için plaka başına 10⁶ hücre olacak şekilde ekiyoruz. Bu durum, hücrelere daha fazla büyüme süresi tanır; böylece transfeksiyondan 24 saat sonra %100 konfluense ulaşırlar. Bunun, mükemmel bir virüs titresi elde etmek için oldukça önemli olduğu gösterilmiştir.Bir sonraki adım klorokin kullanımıdır ve klorokin kullanımı aslında 2 9 3 hücrelerini duyarlı hale getirir; ayrıca, 2 9 3 T hücrelerinin tüm tabakasının plakadan kalkmaması için tüm besiyeri değişimleri çok nazikçe yapılmalıdır. Son olarak, virüs üretmek için kullandığınız DNA son derece temiz olmalıdır. Biz, C bantlı DNA kullanıyoruz.Virüsümüzü elde ettikten sonra -80 °C'de saklarız. Genellikle takibini yaparız; her çözme işlemi virüs titresini iki kat azaltacaktır. Bu nedenle, virüsün gerçek titresini belirlemeden önce, hazırladığımız virüsü dondurmayı tercih ederiz.Virüslere bağlı olarak, gerçek enfekte hücreleri takip etmek için virüsle birlikte GFP ekspresyonuna sahip olabiliriz veya neomisin direncine sahip olabiliriz. Deneyler arasında veya farklı mutantlar arasında uyum sağlayabilmek için, virüsü kullanmadan önce titresinin belirlenmiş olması çok önemlidir.

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Lentiviruses yapmak için, DNA vektörleri insan 293 hücrelerine transfekte. Hasattan sonra ve supernatant yoğunlaşarak, virüs titresi bir akış sitometresi ile floresan ifade tarafından belirlenir.

Lentivirüs Üretim

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Bu protokolü biz üretim, saflaştırma ve lentiviral vektörlerin titrasyonu açıklar. Biz primer kültürlerinde nöronlar ve astrositlerde lentiviral vektör aracılıklı gen aktarımının bir örnek oluşturmaktadır. Bizim yöntemleri diğer hücre türleri için de geçerli...

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

RNA müdahalesi (RNAi) gen nakavt üzerinden pek çok avantajı sahip ve geniş gen işlevsel çalışmalarda bir araç olarak kullanılmıştır. DNA vektör tabanlı RNAi teknolojisi buluşu uzun vadeli ve olası indüklenebilir gen Knockdown yaptı, hem de gen susturulması fizibilite...

Kanser gen Fonksiyon Eğitim için DNA vektör tabanlı RNA Girişim

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Burada, murin embriyonik fibroblastlarının, Tfap2c, Gata3, Eomes ve Ets2'nin on günlük aşırı ekspresyonu ile tamamen işlevsel ve stabil trofoblast kök hücrelerine doğrudan dönüştürülmesi için bir protokol sunuyoruz.

Trofoblast Kök Hücre içine Fare Embriyonik Fibroblastlar Doğrudan Dönüşüm Protokolü

Hücre etkinliğinin infüzyon çalışmaları için yeterli sayıda ilgi genlerinin mükemmel bir şekilde ifade edilen hücreleri veren rhesus makak periferik kan mononükleer hücrelerinin transdüksiyonu ve genişlemesi için 9 günlük bir protokol özetliyoruz.

Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

Bu el yazması, optimize edilmiş bir heparin bazlı afinite kromatografisi yöntemi kullanılarak adeno ile ilişkili viral vektörlerin üretilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Ultrasantrifüjleme ihtiyacını ortadan kaldıran basit, ölçeklenebilir ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunar. Elde edilen vektörler, klinik öncesi çalışmalarda değerlerini kanıtlayan yüksek saflık ve biyolojik aktivite sergiler.

Adeno ile İlişkili Viral Vektörlerin Tek Adımlı ve Yarı Otomatik Heparin Afinite Kromatografisi Protokolü ile İzolasyonu

Keşfedin, 293T hücrelerinde geçici transfeksiyon ile çoğaltma-arızalı retrovirus üretimini. Bu yöntem, insan onkogenlerini fare modellerinde miyeloproliferatif hastalık oluşturmak için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Daha fazla video keşfet