Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Bu prosedürün genel amacı, Drosophila'nın kalp fonksiyonunu optik koherens mikroskobu tekniği kullanarak in vivo olarak uzunlamasına görüntülemektir. Bu yöntem, Drosophila metamorfozu sırasında kardiyak çap, kalp atış hızı ve kardiyak aktivite süresindeki değişiklikler gibi ölçümler sağlayarak Drosophila kardiyak yapısal ve fonksiyonel gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, optik koherens mikroskobunun küçük hayvan kalplerini yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle noninvaziv olarak görüntüleyebilmesidir.

Bu teknik, Drosophila ve omurgalılar arasında var olan genetik benzerlikler nedeniyle insan kalp hastalığının mekanizmalarını ve kalp gelişimi ile ilişkisini ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu yöntem, hayvan modellerinde zayıflamış kalp pili fonksiyonunu incelemek veya tedavi etmek için optogenetik pacing gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu deney için sinekleri üretirken, üreme amaçlı ebeveyn sineklerinin çiftleşmesine ve sekiz saat boyunca taze bir şişede yumurta bırakmasına izin verin.

Böylece, bırakılan yumurtaların kavraması benzer yaştaki sineklere dönüşecektir. OCM görüntüleme için bir larva monte etmek için, önce bir parça çift taraflı bantla temiz bir taraf hazırlayın. Bandın altında sıkışan hava kabarcıklarını dışarı itin.

Ardından, şişeden doğru boyutta bir larva çıkarmak için yumuşak bir fırça kullanın. Larvaları temiz bir dokuya yerleştirin. Nemli bir fırça kullanarak üzerine yapışan yiyecekleri çıkarın ve ardından kurumasını bekleyin.

Şimdi, geniş bir alan mikroskobu altında, larvaların gelişim aşamasını onaylayın. Ardından, larvaları montaj için sırt tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Ardından, yapışkan slaytı larvaların üzerine indirin ve banda sabitlemek için orta derecede basınç uygulayın.

Monte edilmiş larvaları, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde y-enine yönü boyunca OCM sisteminin ayarlanabilir aşamasına yerleştirin. Sahnedeki küçük bir delik, larvaların sahne düzlemi ile temasını engeller. Kalp tüpünün geniş bir lümeni A5'ten A8'e kadar olan segmentlerden bulunur. Bilgisayardaki gerçek zamanlı görüntüleri kullanarak, kalp tüpünün arka bölgesini bulun ve A7 segmenti görünene kadar sahneyi ileri doğru hareket ettirin.

Şimdi, görüntü edinme parametrelerini ayarlayın. B taraması başına 100 A taraması kullanın ve 100 B taraması kullanın. Ardından, tarayıcı voltajını x enine yönünde yaklaşık 0,28 milimetreyi kapsayacak şekilde ayarlayın ve y enine yönünde 0 volta ayarlayın.

Ardından, örnek ışın yolunu koyu renkli bir bezle bloke edin ve arka plan çıkarma için arka plan gürültüsü verilerini almak üzere yazılımdaki başlat düğmesine tıklayın. Enine M modu görüntüleri toplamak için, parametreleri B taraması başına 128 A taramasına ayarlayın ve 4.096 B taraması kullanın. Ardından, voltajı daha önce olduğu gibi x yönünde 0,28 milimetre ve y yönünde 0 voltu kapsayacak şekilde yeniden ayarlayın.

Ardından, sinek kalp tüpünün A7 segmentinin enine M modunda görüntüler elde edin. Veri kaydetme işlemi sırasında, numune numunesine ışık maruziyetini en aza indirmek için görüntüleme ışınını koyu renkli bir bezle engelleyin. Kalp fonksiyonunun güvenilir bir ölçümünü elde etmek için kalbi beş kez görüntüleyin.

Üç boyutlu görüntüleri toplamak için, B taraması başına 400 A taraması, 800 B taraması kullanın ve x enine üzerinde 1,7 milimetre ve y enine üzerinde yaklaşık 4 milimetre voltaj kullanın. Ardından, tüm sineği gözlemlemek için mikroskop aşamasını hareket ettirin ve net görüntüler görmek için odağı ayarlayın. Larvaları çıkarmak için, sürekli gelişim ve uzunlamasına çalışma için taze yiyeceklerle yeni bir şişeye aktarmak için ıslak, yumuşak bir fırça kullanın.

Kalp tüpünün geniş lümeni, pupa evresi PD1'de A5 ila A8 segmentlerinde kalır. PD1'de, L2 ve L3 evre larvalarında olduğu gibi A7 segmentini görüntülemeye çalışın. PD1 pupa evresi beyaz puparium ile tanımlanır.

Bu zaman penceresi, erken pupa'nın optik görüntülemesini gerçekleştirmek için idealdir, çünkü yüksek şeffaflık, OCM görüntüleme için daha yüksek ışık penetrasyonuna yol açar. Vücuda yapışmış yiyecek varsa pupayı fırça ile temizleyin. Islak bir fırça kullanarak pupayı küçük bir cam kızak üzerine monte edin ve sırt tarafını yukarı bakacak şekilde tutun.

Slayt, hayvanın gelişimini kendi odasında korumak için bir sinek tüpüne sığmalıdır. Pupadaki fazla suyu kurutun ve ardından pupa yukarı bakacak şekilde sahneye yerleştirin ve A7 segmentini larva ile yapıldığı gibi görüntülemeye devam edin. Görüntülemeden sonra, sürekli kültür için cam slaytı pupa ile birlikte tüpe aktarın.

PD1 aşamasından sonra, PD2'den başlayarak, A1 ve A4 segmentleri arasında konik bir oda oluşmaya başlar. Pupa giderek daha opak hale geldiğinden, görüntüleme sisteminin penetrasyon derinliği azalır. PD2'de pupa kabuğu sarımsı hale gelir ve vücut PD1'den daha az şeffaftır.

PD3'te, pupa'nın rengi PD2 aşamasından biraz daha koyudur. PD4 aşamasında, kabuğun içinde siyah çizgiler görülebilir. Bazı PD4 yetişkinlere dönüşecek ve diğerleri PD5 aşamasına girecektir.

PD5 aşamasında siyah çizgiler daha da belirgindir. Cımbız kullanarak bir PD2 pupa alın ve bir slayta monte edin. OCM sisteminde, kalp tüpünün ön ucunu bulun ve ardından kalp tüpünün A1 segmentini bulmak için yaklaşık 50 mikron arka uca doğru hareket ettirin.

PD2 aşamasında, kalbin konik odasının çok küçük olduğunu ve henüz atmıyor olabileceğini unutmayın. Daha önce açıklandığı gibi görüntülemeye devam edin. Drosophila'yı PD3, PD4 ve PD5 aşamalarında görüntülemek için aynı prosedürü tekrarlayın.

Başlamak için, yetişkin sineği yaklaşık 45 mililitre hacme sahip boş bir şişeye aktarın. Ardından, bir pamuk aplikatörünü anestezik solüsyona batırın ve çubuğu, pamuk ucu pamuk tıpanın hemen altında olacak şekilde şişeye koyun. Üç dakika bekleyin.

Yetişkin sinek, büyüklüğüne bağlı olarak iki buçuk ila üç buçuk dakika boyunca uyuşturulacaktır. Şimdi bir parça çift taraflı bantla bir cam slayt hazırlayın. Daha sonra, yumuşak bir fırça kullanarak, anestezi uygulanmış sineği sırt tarafı yukarı bakacak şekilde cam sürgünün üzerine hareket ettirin.

Geniş alan mikroskobu altında, cımbız kullanarak kanatları ayırın ve banda yapıştırın, böylece görüntüleme için kalp bölgesini açığa çıkarın. Şimdi, kalbin A1 segmentini görüntülemek için daha önce açıklanan görüntüleme tekniğini kullanın ve deneyin sonunda sineği feda edin. Uzunlamasına kardiyak görüntüleme, 24B-GAL4 sürücüsünün bir kopyası ile gerinim sinekleri kullanılarak gerçekleştirildi.

Larva aşamalarında, kalp tüpü daha geniş bir lümen ile arka karın bölgesi A8'de başlar ve daha dar bir çapa sahip ön dorsal segment A1'de sona erer. PD2'nin sonlarında, A1 ila A4 segmentinde konik bir oda gelişmeye başladı. Sinek kalp atış hızı, enine M-mod OCM görüntülerinden ölçüldü.

İlginçtir ki, pupa aşamalarında kalp ara sıra atmayı bıraktı. Genel olarak, kalp atışı larva aşamasından pupa aşamasına önemli ölçüde yavaşladı ve daha sonra pupadan yetişkine kadar önemli ölçüde arttı. Bu gelişmeden bu yana, bu teknik, gelişimsel kardiyoloji alanındaki araştırmacılara, Drosophila modellerinde çeşitli genlerin kalp gelişimi üzerindeki etkilerini araştırmak için yeni bir araç sağlamıştır.

Bu prosedürü denerken, her gelişim aşamasında görüntüler oluşturmak için bir Drosophila'nın gelişimini dikkatlice izlemek önemlidir.