Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test

Bu prosedürün genel amacı, bir zebra balığı embriyo modelinde kanser hücrelerinin kötü huylu ve invaziv davranışını değerlendirmektir. Bu yöntem, araştırmacıların kanser hücrelerinin işlevsel bir dolaşım sisteminden istila edip edemeyeceğini belirlemelerine yardımcı olur, böylece metastatik kaskadda önemli bir adımı modeller. Bu tekniğin temel avantajı, zebra balığı embriyo modelinin bu değerlendirmeyi ve farelerde sıklıkla yapılan benzer deneylerden daha kısa geri dönüş süresini sağlamasıdır.

Prosedürü gösteren, Georgetown Üniversitesi'ndeki zebra balığı çekirdek tesisini işleten Doktor Eric Glasgow olacak. Kanser hücrelerini, reaktifleri ve zebra balığı embriyolarını metin protokolüne göre hazırladıktan sonra, mikro enjeksiyon dağıtım sistemini basınçlı bir hava kaynağına takın ve güç kaynağını açın. Ayak pedalına basarak basıncı test edin.

İğne tutucusundan kısa bir hava darbesi çıkmalıdır. Bir enjeksiyon plakasına 20 mililitre 2X Trikain Çözeltisi ekleyin ve plakayı dengelemek için bir çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Daha sonra dengelemeyi ikinci bir 2X Trikain alikotu ile tekrarlayın.

Daha sonra, bir grup embriyoyu 2X Trikain Çözeltisi içeren küçük bir tabağa aktarmak için plastik bir pipet kullanın. Bir jel yükleme ucu kullanarak, mikro enjeksiyon iğnesini kanser hücreleriyle doldurun. İğneyi, hücrelerin uca yakın yerleşmesi için sivri ucu aşağı bakacak şekilde bir elektrot saklama kavanozuna yerleştirin.

Anestezi uygulanmış 20 ila 30 embriyoyu, bol miktarda 2X Trikain içeren embriyoları plastik bir pipette toplayarak bir enjeksiyon plakasına aktarın. Embriyoların pipetin ucuna oturmasına izin verin, ardından embriyoları nazikçe enjeksiyon plakasının oluğuna boşaltın ve embriyoları oluğun uzunluğu boyunca yayın. Embriyoları, başları yukarı bakacak ve karınları oluğun dik duvarına bakacak şekilde hizalayın.

İğneyi mikro manipülatörün iğne tutucusuna takın. Ardından, enjeksiyon plakasını 60 derecelik duvar sola bakacak şekilde stereoskopun altına yerleştirin ve 25X büyütmede üst embriyoya odaklanın. Mikro manipülatörü, uzatıldığında iğne embriyoyu delecek şekilde konumlandırın.

Daha sonra iğneyi neredeyse embriyoya değene kadar gözle uzatın. Şimdi, mikroskop altında bakarken, iğneyi embriyoya karşı hizalayın. Hücreleri enjekte etmek için, embriyo oluğunu yumurta sarısı kesesinden delin.

Ayak pedalına basın, ucu prekardiyak sinüsün içine değil, tam ortasına yerleştirin. Enjeksiyonun kuvveti, hücreleri kardiyak sinüse atacaktır. Alternatif olarak, hücrelerin yumurta sarısı kesesine enjeksiyonu, el yazmasında tarif edildiği gibi vasküler invazyonun farklı yönlerinin incelenmesine izin verir.

Sağ elinizi kullanarak enjeksiyon iğnesini uzatın ve geri çekin. Sol elinizle bir sonraki embriyoyu konumlandırmak için ince ayarlamalar yapın. Plakanın tamamı enjekte edildiğinde, iğneyi elektrot saklama kavanozuna geri koyun.

Embriyoları kurtarma kabına aktarmak için, alttaki embriyoları çekmek için enjeksiyon plakasını eğin, embriyoları oluktan yıkayın ve bunları toplamak için plastik pipeti kullanın. Embriyoların pipetin dibine yerleşmesine izin verin, ardından embriyoları minimum miktarda Trikain ile kurtarma kabına aktarın. Canlı embriyoları ölü embriyolardan ve döküntülerden ayırmadan önce kurtarma kabını bir saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin.

Çanağı puanlamaya hazır olana kadar 33 santigrat derecede inkübe edin. Puanlanacak bir grup embriyoyu uyuşturduktan sonra, metin protokolüne göre, anestezi uygulanmış bir larvayı bir damla Trikain içinde bir depresyon mikroskobu lamı üzerine yerleştirin. Kaudal bölgenin en iyi şekilde görüntülenmesi için larvaları yanal olarak yönlendirin.

Slaytı 10X objektif lensli bir bileşik floresan mikroskobu üzerine yerleştirin. Sağlam hücreleri net bir şekilde ayırt etmek için kuyruk bölgesi boyunca yukarı ve aşağı odaklanarak damar sisteminden başarılı bir şekilde istila eden kanser hücrelerinin sayısını sayarak larvaları puanlayın. % 1.5 agaroz Trikain çözeltisini eritin ve 37 santigrat dereceye getirin.

Embriyoları daha önce olduğu gibi uyuşturduktan sonra, bir damla Trikain çözeltisi içinde bir embriyoyu görüntüleme yüzeyine aktarın. Embriyoyu görüntüleme yüzeyinde tutan fazla Trikain solüsyonunu çıkarmak için bir cam pipet kullanın. Daha sonra embriyonun üzerine bir damla erimiş agaroz çözeltisi sürün.

Hızlı bir şekilde çalışarak, agaroz polimerize olmadan önce, embriyoyu görüntüleme için yanal olarak yönlendirmek için kirpik fırçası gibi hassas bir alet kullanın ve embriyonun görüntüleme yüzeyi boyunca düzleşmesini sağlamak için ekstra özen gösterin. Agaroz damlası polimerize olduğunda, Trikain çözeltisine batırın. Son olarak, canlı zebra balığı embriyosunu mikroskobik görüntülemeye tabi tutun.

Zebra balığı embriyolarında vasküler invaziv yetenekleri açısından test edilen yedi meme kanseri hücre hattından, MDA-MB-231 hücre hattı, enjeksiyondan 96 saat sonra değerlendirildiğinde embriyo başına en fazla sayıda ekstravaze kanser hücresi sergiledi. Ayrıca BT-474 hücrelerinin embriyoların kaudal bölgesine kolayca invaze olduğu, MCF-7, SK-BR-3 ve T-47D hücreleri gibi diğer hücre dizilerinin ise minimal invaziv olduğu gözlendi. Farklı bir enjeksiyon bölgesi kullanan modifiye edilmiş bir tahlilde, vasküler invaziv yeteneklerinde farklılık gösteren iki MDA-MB-231 hücre popülasyonunun aynı anda gelişmekte olan embriyoların yumurta sarısı kesesine enjekte edildiği bir rekabet deneyi gerçekleştirildi.

Skorlama üzerine, enjeksiyondan önce birleşik kültür koşulları altında çoğaltılan MDA-MB-231 hücrelerinin, dolaşıma intravazasyonda bir azalma sergilediği ve bu nedenle embriyoların kaudal bölgesinde azalmış bir varlığa sahip olduğu belirlendi. Bir kez ustalaştıktan sonra, zebra balığı embriyo enjeksiyonları uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kanser hücresi ekstravazasyonunu puanlarken titiz ve tutarlı kriterler kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, sonuçlar bir fare modelinde daha fazla doğrulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı embriyolarında kanser hücrelerinin vasküler invaziv yeteneğini test etmenize izin vererek, enjeksiyonların nasıl gerçekleştirileceğini ve ekstravazasyonun nasıl puanlanacağını iyi anlamalısınız.