Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA'nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, bitki tohumlarından yüksek saflıkta RNA çıkarmaktır. Bu yöntem, tohumlardaki orijinal transkriptleri içeren gen profillerini anlamak gibi tahıl biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, araştırmacıların spin sütunu tabanlı yöntemde hafif bir değişiklikle yüksek saflaştırılmış RNA hazırlayabilmeleridir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü ön elekteki yüksek miktarda yağ, protein, karbonhidrat ve polifenol, yüksek oranda saflaştırılmış RNA'nın izole edilmesini zorlaştırır; Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Kazumi Hikino olacak. Deneye başlamak için, RNA ekstraksiyonu için hücre lizis tamponuna hacim başına yüzde bir ağırlık moleküler biyoloji sınıfı PVP ekleyin ve karışımı kuvvetlice girdaplayın. PVP'yi tamamen çözmek için 25 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

20 dakikalık inkübasyondan sonra, kabarcıkların oluşmasını önlemek için tüpü ters çevirerek tamponu hafifçe karıştırın. Arabidopsis thaliana bitkilerinden meyveleri hasat edin ve bunları buz üzerinde iki adet 1,5 milimetrelik polipropilen tüpe koyun, ardından meyveleri dört santigrat derecede tutulan alüminyum plakalara yerleştirin ve meyvelerden tohumları stereo mikroskop altında izole edin. Daha sonra, yaklaşık 200 izole edilmiş tohumu, daha önce buz üzerinde bir alüminyum rafta saklanan 1,5 mililitrelik polipropilen tüplere yerleştirin ve tüpleri hemen sıvı nitrojen içine yerleştirin.

Tüpleri sıvı nitrojenden çıkarın ve buz üzerindeki alüminyum rafa geri koyun. Her tüpe yüzde bir PVP tamponundan 100 mikrolitre ekleyin ve tüpleri dört santigrat derecede 1000 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpü alüminyum rafta buz üzerinde tutarken 60 saniye boyunca bir motor öğütücü kullanarak numuneyi paslanmaz çelik bir havaneli ile homojenize edin; daha sonra, 550 mikrolitre %100 PVP tamponu ekleyin ve tüpü karıştırmak ve inkübe etmek için tüpü yavaşça ters çevirin.

İnkübasyondan sonra, çözeltiyi santrifüjleyin, ardından 550 mikrolitre süpernatanı yeni bir 1.5 milimetre polipropilen tüpe aktarın ve süpernatanı santrifüjleyin. 450 mikrolitre süpernatanı yeni bir 1.5 milimetre polipropilen tüpe aktarın. Süpernatanı, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanarak RNA ekstraksiyonu için hücre lizatı olarak kullanın.

Buz üzerinde bir alüminyum raf hazırlayın ve toplam RNA karışımını hafifçe vurarak çözün, ardından tüpü rafa yerleştirin. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra toplam RNA'yı RNaz içermeyen suda seyreltin.

Ticari kitten toplam RNA ve tampon setlerini çözün, kitteki enzimleri hafifçe vurduktan sonra buz üzerinde tutun. Sonraki analizler için sterilize edilmiş nükleaz içermeyen 0.2 mililitre polipropilen tüpler hazırlayın. Buz üzerinde, 0.2 mililitrelik polipropilen tüpte beş mikrolitre toplam RNA, bir mikrolitre veya 50 mikromolar oligo DT primer ve bir mikrolitre veya 50 mikromolar rastgele altı-mer'i birleştirin.

Karışımı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin, ardından tüpü buzun üzerine yerleştirin. Standart eğriler için DNA şablonları için plazmit konsantrasyonlarını ayarlayın. Daha sonra, CDNA çözeltilerini damıtılmış su ile bir ila 100 arasında seyreltin, daha sonra seyreltilmiş CDNA çözeltilerinden iki mikrolitre ve standart eğriler için önceden hazırlanmış plazmitleri kantitatif gerçek zamanlı PCR kitinden ana karışıma ekleyin.

Son olarak, gerçek zamanlı PCR'yi ayarlayın ve örnekleri yerleştirin. Toplam RNA, değişen konsantrasyonlarda hücre lizis tamponu, PVP kullanılarak yaklaşık 1.000 tohumdan izole edildi. İzole edilen RNA'ların miktarları ve saflığı, tohumlardan büyük miktarlarda saflaştırılmış RNA'yı izole etmek için %1.0PVP'nin en etkili konsantrasyon olduğunu göstermektedir.

200 tohumdan izole edilen RNA'nın konsantrasyonları, A260 ve A280 oranları ve A260 A230 oranları, bu yöntemin çiçeklenmeden sekiz ila 12 gün sonra veya DAF tohumlarından yüksek oranda saflaştırılmış RNA'yı izole etmede en iyi olduğunu gösterdi. Gelişmekte olan tohumlarda buruşuk ve şekere bağımlı bir transkript miktarları nispeten düşük olmasına rağmen, gerçek zamanlı PCR ile farklı gelişim aşamalarında tohumlar arasındaki ifade değişikliklerini tespit etmek mümkün olmuştur; Bu yöntem, bu tabloda gösterildiği gibi diğer yağlı tohumlar için de uygundur. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, bitki biyolojisi alanındaki araştırmacıların, tohumlar ve meyveler gibi depolanmış rezervlerin yüksek konsantrasyonunda gen ekspresyon profillerini keşfetmelerinin yolunu açtı.