Name: Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster'da beslenme davranışını ölçmek için CAFE analizini. Bu güvenilir yöntem metabolik araştırmalarda besin alım mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Tartışma için Scholz laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine ve mükemmel teknik destek için Helga Döring'e teşekkür ederiz. Özellikle Köln Üniversitesi Biocenter çalıştayı üyelerine destekleri ve yaratıcılıkları için teşekkür ederiz. Çalışma SFB 1340, SysMedAlc ve DAAD-Siemens tarafından desteklenmektedir.

1. CAFE Deneyi NOT: Bir deney şişesi, belirli bir kapak ve mikro kılcal: deney üç bileşenden oluşur. kapaklı bir plastik kutu hazırlanan şişeleri taşımak için daha verimli bir şekilde nem kontrol etmek için kullanılır. <ol><li> Tahlil için bir tüp gibi Drosophila melanogaster kültürü plastik şişe (isteğe 8 cm yükseklik, 3.3 cm çapında) kullanın. </li><li> O-halkası (Şekil 1A, 1B) ihtiva eden bir imal pleksiglas kapaklı şişe contasına. Yük dokunarak veya ayrıca hava sirkülasyonu ve su temini sağlayan kapağın merkezi açıklık (0.9 cm çapında), üzerinden bir blowpipe ile uçar ve bir sünger tapa deliği kapatın. Altı küçük konik açıklıkları (0.4 cm üst çapı, 0.3 cm iç çapı) merkezi deliği çevreleyen ve 2 pipet uçları uygun - yerinde kılcal tutmak için 20 uL hacmi. (Kapağın teknik detaylar için ek şekillere bakınız.) NOT: kullanımbunun yerine Metinde kullanılan ölçüye kapak kılcal açıklıklar ile bir sünger durdurucunun mümkündür. Bizim özel kapak capillaries düşme riskini en aza indirmek hazırlanan şişeleri güvenli kullanım sağlar. </li><li> Sıvı gıdalar sunmak için, 1 uL işaretleri ile 5 uL mikrokapilerler kullanın. Delik (kırmızı kenarı ile işaretlenmiş Şekil 1B) içine ucu 20 uL pipet ve ekleme - 2 üst keserek kapağındaki konik açıklıklar kılcal yerleştirin. Aynı ağzına 20 uL pipet - kaçmasını sinekler önlemek için, bir kesilmemiş 2 yerleştirin. </li><li> Güvenli, çoklu hazırlanan şişeleri ele bir ızgarah kakma (Şekil 2A) ile bir plastik kutu içine koyun. </li></ol> Sineklerin 2. Hazırlık <ol><li> 25 ° C,% 60 bağıl nem ve 12 saat / 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü standart gıda sinekler tutun. </li><li> , Üreme koşullarını kontrol 35 bakire kadın tanıtmak için bir50 mL içeren plastik kültür şişenin içine her bir deney grubu d 15 erkek (9.8 cm yükseklik, 4.8 cm çapında) gıda sinek. sinekler sonra yetişkin taze gıda şişeleri uçar aktarmak ve onları iki gün daha yumurtalarını izin ilk 3 gün yumurtalarını bırakmak için izin verin. Bundan sonra tekrar transferi tekrarlayın. Iskarta yetişkin 2 gün daha sonra uçar. </li><li> Gıda alımı uçucu büyüklüğüne bağlıdır gibi, 3 günlük bir yetişkine 2- anestezi 100 sinekler grubunun ağırlığını belirlemek CO2 uçucu takımını kullanarak ve bir 1.5 mL&#39;lik bir plastik tüp içine toplanması ve standart ölçme sinekler laboratuar ölçekli. Seks (Tablo 1) olanlar en az dört bağımsız sinek gruplarının ıslak ağırlığını belirlemek; mg sinek başına uL gıda tüketimi hesaplamak için ağırlık kullanın. Tek bir sinek deney başına besleyen gıda miktarını belirlemek ve besleyerek kılcal damarların boşaltılmasını önlemek için buna göre gıda dolu kılcal damarların sayısını ayarlamak için değeri kullanın. <ol><li> 3 saatlik deney, kullanım için20 sinek ve iki dolu kapilerlere. uzun vadeli bir deney (&gt; 3 saat ve en fazla 9 güne kadar) için, (güvenilir sonuçlar anlatılan koşullarda az sekiz sinekler elde edilemez) dört doldurulmuş kılcal damarların bir kaynağı ile sekiz sinekler bir grup kullanın. </li></ol></li><li> CO 2 maruz altında ağırlıkları ölçüldükten sonra gruplar (8 veya 20 sinekler) içine ayrı sinekler. CO2 sedasyon 48 saat deney öncesinde geri dönüşüne verecek şekilde (15 mL standart gıda ihtiva eden) yeni bir gıda şişeye grubu aktarın. CAFE tahlil için 4 ila 6 günlük bir sinekler kullanın. </li><li> Olmayan aç vahşi tip sinekleri sadece marjinal besleme olarak 19, 21, ön açlıktan 3H beslenme deneyleri için gider. Gıda tüketimi birkaç gün içinde takip edildiğinde hiçbir açlık gereklidir. açlık transfer yavaşça ~ 0.5 mL GKD&#39;li nemlendirilmiş sadece 45 mm çaplı filtre kağıdından ihtiva eden bir şişe içine dokunarak testten önce 16 ila 20 saat uçan2 O (distile su-double) ve bir takılı CAFE tahlil kapaklı yakın. </li></ol> Sıvı Gıda 3. hazırlanması <ol><li> 100 mL GKD 2 O Pipet 3 uL, 33 uL, 333 uL, 3.3 mL ve 6.6 mL 102.6 gr sakaroz (Cı 12H 22 o 11) doldurarak (ağ / hac% 10), sakroz stok çözeltisi, 3 M hazırlanması 15 ml plastik tüp içine stok çözeltisi; 2 mL Gıda renk eklemek (kırmızı için: Cochineal [E124]; mavi: Indigo karmin [E132]) ve GKD 2 O. ile 10 ml doldurmak sonuçlanan konsantrasyonları 0.001, 0.01, 0.1, 1, ve 2 M sukroz vardır . NOT: gıda boyası daha kolay menisküs görselleştirme sağlar. Ancak boya gıda alımı üzerinde bir etkiye sahip olabilir. boya, gıda boyası dağıtmak veya deney ve gruplar sırasında gıda numunelerine boyaların kullanımını randomize nedeniyle önyargı önlemek için. </li><li> Alkol tercih pipet için bir 15 ml plastik bir tüp içinde 3 M sukroz stok çözeltisi 333 uL test etmek için.% 100 EtOH (etanol), 1.5 mL (2.3 mL) ilave edilir ve% 15 (0.25 mM) ve% 23 (0.39 mM) çalışma çözeltileri neden 10 mL&#39;ye GKD 2 O ekleyin. </li><li> 4 ° C&#39;de stok -20 ° C&#39;de çözüm ve çalışma çözümleri tutun; 1 hafta içinde kullanın. </li><li> kılcal zorla, renkli bir gıda solüsyonu ile aynı anda 10 kılcal doldurun. sakaroz çözeltisini (çözelti 45 ° açıyla kılcal tutarak) içine kılcal damarların uçlarını takın. Sıvı üst kılcal (5 uL) işareti ulaşırsa durdurun ve kağıt mendil ile dış ve iç aşırı çözüm kaldırmak. </li></ol> 4. Montaj ve kapiller Besleyici Testi Sahne <ol><li> oruç gerekli değilse, dokunarak ya da darbe-borusu ile tahlil deneysel sinekler aktarın. buharlaşmasını ölçmek için sinekler olmadan üç kontrol şişeleri dahil ettiğinizden emin olun. </li><li> Dış openin birini kapatıyor - (20 uL hacmi 2) dikkatli bir pipet kaldırmakgs ve ilk bir dolu cam kapiller, dip-ucunu. geri ileri kılcal pipet koyarak kılcal sabitleyin. çeşitli gıda çözümleri test ediliyor ise, buna göre bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Yerleştirin kılcal besin kaynakları farklı yüksekliklerde bulunan sanki oluşabilir önyargı önlemek için aynı düzeydeki tüm şişeleri içinde biter (3 - kapaktan 4 cm); kaza filtre kağıtları veya gıda kaynaklarının farklı viskozitelere dokunarak sızmasını kılcal önlemek için filtre kağıdı için mesafe tutun. </li><li> Bir işaretleyici kalem (başlangıç işareti) kullanarak renkli sıvının üst ucunu Etiket. Onları tek tek bir renk veya çizgili kodunu kullanarak etiket, farklı kılcal damarlar tespit edilebilir sağlamak. </li><li> Gridlenmiş kakma bir plastik kutu içinde birden hazırlanan CAFE deneyleri yerleştirin ve laboratuar koşullarında veya ısıya, ışığa ve nem kontrollü clim güvenli bir konuma (Şekil 2A) kutusunu transferiDeney süresi (örneğin 3 saat veya gün): odacık (25 ° C,% 60 bağıl nem, 12 saat / 12 saat ışık-karanlık döngüsü parametreleri) yedi. </li><li> Tahlil birkaç gün içinde yapılırsa alt filtre kağıdı kurur gibi, sünger tapa (100 uL) üzerinden 24 saatte tahlil içindeki nem sabit tutmak için tatlı su uygulayın. Nem cihazları gibi 30 ml GKD 2 O ile dolu dört ayrı şişeleri (8 cm yükseklik, 3.3 cm çapında) kullanın ve plastik kutu CAFE deneyleri yanında koyun. Deney (Şekil 2A) sırasında nem kontrollü bir ortam oluşturmak için plastik kutu için bir kapak kullanın. NOT: Geniş değişkenlik laboratuar şartlarında oluşur; ancak, (bir sınıfta, örneğin.), oda sıcaklığında CAFE tahlil gerçekleştirmek için mümkündür. (Plastik kutu su şişeleri ve kapağı dolu ya da ıslak bir sünger tapa olmadan filtre kağıdı,) bir nemlendirme cihazının kullanımı son derece (buharlaşmayı azaltmak için teşvik edilmektedir <stRong&gt; Şekil 2B). </li><li> Uzun süreli deneylerde her 24 saat için taze doldurulmuş olanlarla kılcal değiştirin. Her 24 saat arayla önce ölü sinekler not edin ve bir sonraki dönem için sinek başına tüketimi hesaplamak için canlı sineklerin numarasını kullanabilirsiniz. menisküsün düşüş (5.1 bakınız) ölçüldükten sonra eski kılcal atın. NOT: biz neredeyse hiç ölü sinekler bkz 3 saat Deney sırasında. 3 ölü sinekler - 4 gün çalışma sırasında biz genellikle 1 bulabilirsiniz. </li><li> CAFE tahlil dik konumda iken bu testin veya kılcal değiştirmeden önce sonunda, bir marker kalem ile kılcal (işareti sonu) alt menisküs işaretleyin. Işareti sonu (başlangıç işareti) ilk işaretinin altında değilse veri atın. Bu menisküs değişebilir olarak, kapağını çıkarmayın. </li><li> Dikkatle testte kılcal damarları kaldırmak ve veri toplama için saklayın. Discar değilse kılcal içindeki sıvı alt ucunu ulaştı olmadığını kontrol edind veriler, gıda sinekler için erişilebilir değildi. Bir grup olarak şişe başına tüm kılcal toplayın. kaçmasını sinekler önlemek için tüm açıklıklar içine kesilmemiş pipet uçları takın. setup dağıtın ve daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında sabun banyosu kuru gece boyunca şişe, kapakları ve sünger tapalar yıkayın. NOT: Sinekler ayrıca tahlil sonra analiz edilebilir. gözle veya bir diseksiyon mikroskobu altında gıda alımını onaylayın. </li><li> en az üç farklı günlerde aynı genotipleri ile tekrarlayın deneyler. </li></ol> 5. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Bir kumpas veya cetvel kullanarak kapiller işareti başında ve işareti sonu arasındaki mesafeyi ölçün. Bir e-tabloya doğrudan veri aktarmak için, dijital kumpas (Şekil 1E) bağlı bir USB (Universal Serial Bus) kullanın. ölçümden sonra kılcal atın. </li><li> kılcal boyutu için hesap gıda alımını veya buharlaşma hesaplamak için. Örneğin, bir kap dikkateUzun 73 mm ve gıda çözüm 5 mcL içeren Illary. menisküs bir 14.6 mm azalarak 1 uL solüsyonu alımını yansıtmaktadır. Aşağıdaki formülü kullanarak gıda alımını hesaplayın: Gıda alımı (uL) = ölçülen mesafe (mm) / 14.6 mm </li><li> gıda alımı üzerindeki buharlaşma etkisini dışlamak için, sinekler olmadan üç (en azından) kontrol şişelerini buharlaşma ortalama hesaplamak. sinekler tarafından gıda tüketimi için elde edilen değerden bu ortalama değeri çıkartın. </li><li> sinek başına toplam tüketim belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın: Gıda tüketimi (uL) = (Gıda alımı [ul] - Evaporatif kayıp [ul]) / flakon sineklerin toplam sayısı. uzun vadede deneyler 24 saat aralığının başlamadan önce canlı sineklerin numarasını kullanabilirsiniz. </li><li> Böyle erkek ve dişi sinekler arasında olduğu gibi vücut büyüklüğü farklılıkları, hesaba katılması için, vücut ağırlığı gıda tüketimi (ul yiyecek / mg sinek) normalleştirmek. </li><li> Veri analizi için istatistiksel yazılım kullanın. normmüttefiki dağıtık veri, kullanım öğrencinin T-test, iki sinek gruplar arasındaki farklılıkları belirlemek ve ikiden fazla gruplar için post hoc Tukey Cramer testleri ile ANOVA (varyans analizi) kullanın. Bir seçim durumda, bir parametrik olmayan tek örnek işareti testi kullanılarak rastgele seçim farklılıkları analiz. </li></ol>

<ol><li>Krauth, C., Buser, J., Vogel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+high+are+the+costs+of+eating+disorders+-+anorexia+nervosa+and+bulimia+nervosa+-+for+German+society%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Health+Econ%22%5BJournal%5D)">How high are the costs of eating disorders - anorexia nervosa and bulimia nervosa - for German society.</a> Eur. J. Health Econ. 3 (4), 244-250 (2002).</li>
<li>Cawley, J., Meyerhoefer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+medical+costs+of+obesity+and+instrumental+variables+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Health+Econ%22%5BJournal%5D)">The medical costs of obesity and instrumental variables approach.</a> J. Health Econ. 31, 219-230 (2012).</li>
<li>PriceWaterhouse Coopers LLP. The costs of eating disorders: Social, health and economic impacts. Assessing the impact of eating disorders across the UK on behalf of BEAT. PwC. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf">https://www.beat.co.uk/assets/000/000/302/The_costs_of_eating_disorders_Final_original.pdf</a> (2015).</li>
<li>Lenard, N. R., Berthoud, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+and+peripheral+regulation+of+food+intake+and+physical+activity%3A+pathways+and+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Central and peripheral regulation of food intake and physical activity: pathways and genes.</a> Obesity. 16, S11-S22 (2008).</li>
<li>Magni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+behavior+in+mammals+including+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Comp.+Endocrinology+and+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Feeding behavior in mammals including humans.</a> Trends in Comp. Endocrinology and Neurobiology. 1163, 221-232 (2009).</li>
<li>Morton, G. J., Meek, T. H., Schwartz, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+food+intake+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of food intake in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15, 367-378 (2014).</li>
<li>Bharuchka, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicurean+fly%3A+using+Drosophila+melanogaster+to+study+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">The epicurean fly: using Drosophila melanogaster to study metabolism.</a> Pediatr. Res. 65 (2), 132-137 (2009).</li>
<li>Smith, W. W., Thomas, J., Liu, J., Li, T., Moran, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fat+fruit+fly+to+human+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">From fat fruit fly to human obesity.</a> Physiol. Behav. 136, 15-21 (2014).</li>
<li>Rajan, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+flies+and+men%3A+insights+on+organismal+metabolism+from+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies.</a> BMC Biology. 11, (2013).</li>
<li>Ja, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prandiology+of+Drosophila+and+the+CAFE+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Prandiology of Drosophila and the CAFE assay.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (20), 8253-8256 (2007).</li>
<li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDethier%2C+VG+%22The+Hungry+Fly%3A+A+Physiological+Study+of+the+Behavior+Associated+with+Feeding%22">The Hungry Fly: A Physiological Study of the Behavior Associated with Feeding</a>. , Harvard Univ Press. Cambridge, MA. (1976).</li>
<li>Albin, S. D., Kaun, K. R., Knapp, J., Chung, P., Heberlein, U., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+serotonergic+neurons+evokes+hunger+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A subset of serotonergic neurons evokes hunger in adult Drosophila.</a> Curr. Biol. 25, 2435-2440 (2015).</li>
<li>Deshpande, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Drosophila+food+intake%3A+comparative+analysis+of+current+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology.</a> Nat. Methods. 11 (5), 535-540 (2014).</li>
<li>Geer, B. W., Olander, R. M., Sharp, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dietary+choline+utilization+in+adult+Drosophila+melanogaster+by+radioisotope+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of dietary choline utilization in adult Drosophila melanogaster by radioisotope methods.</a> J. Insect Physiol. 16, 33-43 (1970).</li>
<li>Thompson, E. D., Reeder, B. A., Bruce, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+method+for+quantitating+food+consumption+for+mutation+assays+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Characterization of a method for quantitating food consumption for mutation assays in Drosophila.</a> Environ. Mol. Mutagen. 18, 14-21 (1991).</li>
<li>Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+food+intake+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantification of food intake in Drosophila.</a> PLoS One. 4 (6), e6063(2009).</li>
<li>Scheiner, R., Steinbach, A., Classen, G., Strudthoff, N., Scholz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+indirectly+affects+proboscis+extension+response+habituation+in+Drosophila+melanogaster+by+controlling+sucrose+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Octopamine indirectly affects proboscis extension response habituation in Drosophila melanogaster by controlling sucrose responsiveness.</a> J. Insect Physiol. 69, 107-117 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Luo, J., Carlsson, M. K., Nässel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+and+insulin-like+peptides+modulate+leucokinin-producing+neurons+that+affect+feeding+and+water+homeostasis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Serotonin and insulin-like peptides modulate leucokinin-producing neurons that affect feeding and water homeostasis in Drosophila.</a> J. Comp. Neurol. 523, 1840-1863 (2015).</li>
<li>Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLIC%3A+high-throughput%2C+continuous+analysis+of+feeding+behaviors+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila.</a> PLoS One. 9 (6), e101107(2014).</li>
<li>Itskov, P. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25087594">Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behavior in Drosophila.</a> Nat. Commun. 5, 4560(2014).</li>
<li>Qi, W., Yang, Z., Lin, Z., Park, J. Y., Suh, G. S. B., Wang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+feeding+assay+in+adult+Drosophila+reveals+rapid+modulation+of+food+ingestion+by+its+nutritional+value%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Brain%22%5BJournal%5D)">A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value.</a> Mol. Brain. 8, 87(2015).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism%3A+feeding+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Metabolism: feeding fruit flies.</a> Nat. Methods. 12 (7), 609-612 (2015).</li>
<li>Spieth, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Courtship+behavior+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Courtship behavior in Drosophila.</a> Annu. Rev. Entomol. 19, 385-405 (1974).</li>
<li>Devineni, A. V., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+ethanol+consumption+in+Drosophila+models+features+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction.</a> Curr. Biol. 19 (24), 2126-2132 (2009).</li>
<li>Lee, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+and+reproduction+in+Drosophila%3A+New+insights+from+nutritional+geometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Lifespan and reproduction in Drosophila: New insights from nutritional geometry.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (7), 2498-2503 (2008).</li>
<li>Pohl, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+preference+in+Drosophila+melanogaster+is+driven+by+its+caloric+value%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Ethanol preference in Drosophila melanogaster is driven by its caloric value.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 36 (11), 1903-1912 (2012).</li>
<li>Vargas, M. A., Luo, N., Yamaguchi, A., Kapahi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+S6+kinase+and+serotonin+in+postmating+dietary+switch+and+balance+of+nutrients+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for S6 kinase and serotonin in postmating dietary switch and balance of nutrients in D. melanogaster.</a> Curr. Biol. 20 (11), 1006-1011 (2010).</li>
<li>Masek, P., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limited+taste+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limited taste discrimination in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (33), 14833-14838 (2010).</li>
<li>Pool, A. H., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+regulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Feeding regulation in Drosophila.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 29, 57-63 (2014).</li>
<li>Luo, J. N., Lushchak, O. V., Goergen, P., Williams, M. J., Nässel, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+insulin-producing+cells+are+differentially+modulated+by+serotonin+and+octopamine+receptors+and+affect+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Drosophila insulin-producing cells are differentially modulated by serotonin and octopamine receptors and affect social behavior.</a> Plos One. 9 (6), e99732(2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Raporda, teknik kurulum ve laboratuvarda başarılı performansına odaklanarak, bir adım-adım moda CAFE deneyi açıklamaktadır. Kolaylığından dolayı, bu deney aynı zamanda bir okul deney olarak eğitimsel kullanılabilir. Örnekler tahlil kısa ve uzun süreler (gün saat) üzerinde Drosophila melanogaster gıda algılama, tercih ve tüketim soruşturma izin verdiğini göstermektedir. CAFE tahlil gıda ve ilaç tüketimi, madde bağımlılığı, enerji dengesini ve beslenme 16 nöronal kontrolüyle, <s...

Yeme gereklidir; Bununla birlikte, bulimia, anoreksia ve kıldığını aşın yemesine genel eğilim gibi yeme bozuklukları ile sonuçlanır gıda alımının deregülasyonu bireyler ve toplum, 1, 2, 3 maliyeti. Bu araştırmanın amacı, gıda alımının düzenleyici mekanizmaların ortaya çıkarmak ve bozukluk oluşumunu engellemeyi için bir strateji sağlamaktır. Memeli model organizmalar kullanarak çok sayıda çalışmalar bozuklukları 4, 5, 6 yeme devresi ve sinyal sistemlerinin rolünün yeni anlayışlar sağladı. Bununla birlikte, bu bozuklukların altında yatan nöronal ve moleküler üsleri bilgimiz tam uzaktır. Son yıllarda, meyve Drosophila melanogaster metabolis düzenlenmesi, temel mekanik anlayışlar çözülüyor için değerli bir model sistem haline gelmiştir uçmakm 7, 8, 9. Drosophila melanogaster için kılcal besleyici (CAFE) deneyi blowfly 10, 11 DETHIER tarafından daha önceki bir çalışmadan esinlenerek 2007 yılında Seymour Benzer&#39;in laboratuarda kurulmuştur. CAFE tahlil mümkün doğrudan Drosophila melanogaster gıda alımını ölçmek için yapılan. Bu davranışsal test sistemi, sinekler, bir şişeye içine yerleştirilen kademeli cam kılcal sağlanan sıvı gıdalarla beslenmesidir. Kılcal menisküsün düşüş buharlaşma ve gıda tüketimi yoluyla gıda çözümünün kaybını gösterir. sinekler olmadan şişeleri ile buharlaşma hızının belirlenmesi gıda alımının doğru ölçümü sağlar. CAFE tahlil Drosophila melanogaster beslenme ölçmek için kullanılan çeşitli davranışsal paradigmalar biridir ve araştırmacılar kendi özel için en uygun olanı seçmek zorundasoru. Aşağıdaki noktaları göz önünde belirli bir tahlil kullanma kararı: sağlanan gıda doğasını; beslenme durumu; alımı veya besin alımı ve soruşturma gıda tüketimi veya gıda tepki ölçümü. Bu raporda açıklanan şekilde CAFE tahlil dik besleme koşullarında bir sıvı gıda kaynağının gıda alımını takip için idealdir. Seçenek olarak gıda alımı, bir şişe içinde ya da plaka üzerinde renkli bir besin kaynağı bir uçucu grup için ölçülebilir. Sinekler normalde öldürülmüş ya da anestezi beslendikten sonra ve yutulur boya miktarı spektrometresi veya lekeli karın görsel muayene ile belirlenir edilir. Sinekler sadece 30 dk alımından sonra yutulur gıda salgılanmasını başlatmak, bu nedenle bu yaklaşım, sürekli uzun beslenme analizi için kullanımının zor 13, 12 davranışlar. Buna karşılık sinekler zaman emilebilir boya bozulmadan tutulurRadyoaktif işaretleyicilerle s kullanılmış ve radyoizotopun tüketim bir parıldama sayacı 14, 15 puanlanmıştır. sinek sindirim sistemi tarafından radyoaktif emilimi uzun vadeli gıda alımı ölçümü mümkün kılan, ancak çünkü olmayan emilir ve atılır izleyici moleküllerinin tüketim küçümsemeye yol açabilir. Başka bir yaklaşım melanogaster normalde gıda alımının 16 oluşur hortum uzatma yanıtı (PER) &#39;dir Drosophilia&#39;daki gıda tepkisini ölçmek için. Bu zarif yöntem bir gıda uyarana ilk tepkiyi ölçen ama alımının miktarını yazmaz. Gıda alımı dinamik besleme 17, 18 düzenlenmesi için önemli olan birkaç post-sindirim geribildirim sinyallerini kullanarak beslenme sırasında ayarlanır. Birçok deneme başına deneyinde yarı otomatikleştirmek veri toplama son yıllarda yapılmış <sclass = &quot;xref&quot;&gt; 19, 20 kadar. Başına elektrik ped ya da elektrotların bir kombinasyonu ile tespit edilir ve bilgisayar aracılığı ile sayılır. Radyoizotop alımı ile PER tahlil birleştiren bu testte miktar beslenme farklılıklarını 18 tespit düşük hassasiyet ile sınırlı olduğunu ortaya çıkardı. Sinek cam kılcal el ile beslendiği elle besleme deneyi (MAFE) 21, en son tek hareketsiz sinek gıda alınmasının ölçümü için geliştirilmiştir. MAFE tahlil başlamanın toplayıcı ve beslenme müdahaleleri ortadan kaldırır ve PER bir zaman saniye çözünürlük ve inisiyasyon sahiptir ve gıda tüketimi deneyinde bağımsız izlenebilir. Ancak, yol hangi sineğin immobilizasyon (örneğin hareket, motivasyon) hala araştırılması gereken beslenme davranışının bazı yönlerini etkiler. Drosophila beni yiyecek tüketiminin ölçülmesi için farklı testlerin mükemmel karşılaştırmalı değerlendirme içinlanogaster ve en uygun olanı bulmakta araştırmacılara yardımcı Deshpande ve Marx tarafından raporlarını görmek için 13, 22. CAFE deneyi, yukarıda tarif edilen diğer deneylerden dezavantajlarının bazılarının önler ve gıda alımının güvenilir ölçümler ile kullanım sadeliği birleştirir. Burada, CAFE tahlilinde ayrıntılı bir açıklaması temin edilmiştir ve buharlaşmayı azaltmak için basit bir ayar değişikliği göstermektedir. İki gıda seçimi deneyi (kısa ve uzun vadeli) ve sineklerin sakaroz alımı da dahil olmak üzere Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir. tartışmada biz CAFE tahlil gerçekleştirmek ve potansiyel sınırlamaları vurgulamak için alternatif yollar ile tarif edilen yöntem karşılaştırın.

<table><tbody><tr>Şişeler <td>(ıslah)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>960177</td><td>www.greinerbioone.com</td></tr><tr><td>Şişeler (CAFE tahlili)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>217101</td><td>www.greinerbioone.com</td></tr><tr><td>Lid-CAFE tahlili</td><td>Çalıştayı</td><td>&ndash;</td><td>&ndash;</td></tr><tr><td>Plastik kutu, alçak duvar</td><td>Plastime</td><td>353</td><td>www.plastime.it</td></tr><tr><td>Plastik kutu kapağı</td><td>Atölye</td><td>&ndash;</td><td>&ndash;</td></tr><tr><td>Kılcal damarlar</td><td>BLAUBRAND&nbsp;</td><td>REF 7087 07 www.brand.de</td><td></td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771290</td><td>www.greinerbioone.com</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı daireleri</td><td>Whatman</td><td>10 311 804</td><td>www.sigmaaldrich.com</td></tr><tr><td>D (+) - Sükroz</td><td>AppliChem</td><td>57-50-1</td><td>www.applichem.com</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR Kimyasallar</td><td>20.821.330</td><td>www.vwr.com</td></tr><tr><td>Gıda boyası (kırmızı, E124)</td><td>Backfun</td><td>10027</td><td>www.backfun.de</td></tr><tr><td>Gıda boyası (mavi, E133)</td><td>Backfun</td><td>10030</td><td>www.backfun.de</td></tr><tr><td>Sabun çözeltisi (CVK 8)</td><td>CVH</td><td>103220</td><td>www.cvh.de</td></tr><tr><td>Dijital kumpas</td><td>GARANT</td><td>412,616</td><td>www.hoffmann-group.com</td></tr><tr><td>Şişeler (üreme)</td><td></td><td></td><td>Yükseklik 9,8 cm, çap 4,8 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Şişeler (CAFE testi)</td><td></td><td></td><td>Yükseklik 8 cm, çap 3.3 cm</td></tr><tr><td>Kapak-CAFE testi</td><td></td><td></td><td>Üniversite atölyesinde üretilmiştir, teknik çizim verilir 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55024/Diegelmann-Cafe-Lid-technical-drawing.pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a></td></tr><tr><td>Plastik kutu, alçak duvar</td><td></td><td></td><td>Plastik bir ızgara dolgusu, 8 x 10 flakon pozisyonu için özel olarak üretilmiştir&nbsp;</td></tr><tr><td>Plastik kutu</td><td></td><td></td> kapağı <td>Ölçüler (37 x 29 x 18 cm)</td></tr><tr><td>Kılcal damarlar</td><td></td><td></td><td>DIN ISO 7550 normuna uygundur. IVD-guideline 98/79 EG, uçlar cilalı</td></tr><tr><td>Pipet uçları</td><td></td><td></td><td>Dış çember için pipetler kapağa göre kesilir</td></tr><tr><td>Filtre kağıdı daireleri</td><td></td><td></td><td>45 mm çap katlandığında iyi çalışır Kullanılan şişeler için</td></tr><tr><td>D (+) - Sükroz</td><td></td><td></td><td>Zararlı değil</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td></td><td></td><td>Yüksek derecede yanıcı sıvı ve buhar</td></tr><tr><td>Gıda boyası (kırmızı, E124)</td><td></td><td></td><td>Belirtilmemiş</td></tr><tr><td>Gıda boyası (mavi, E133)</td><td></td><td></td><td>Belirtilmemiş</td></tr><tr><td>Sabun çözeltisi (CVK 8)</td><td></td><td></td><td>Koku nötr sabun</td></tr><tr><td>Dijital kumpas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standart sinek yemi</td><td></td><td></td> <td>(20 L için)</td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td>160 g</td></tr><tr><td>Bira mayası</td><td></td><td></td><td>299,33 g</td></tr><tr><td>Mısır unu</td><td></td><td></td><td>1.200 g</td></tr><tr><td>Pekmez</td><td></td><td></td><td>1,6 L</td></tr><tr><td>Propiyonik asit</td><td></td><td></td><td>57,3 mL</td></tr><tr><td>Nipagin %30 160</td><td></td><td></td> <td>mL</td></tr></tbody></table>

kılcal besleyici testi gıda alımını içinde tedbirler<em&gt; drosophila melanogaster</em

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

Çoğu hayvan için beslenme, hayatta kalmayı güvence altına almak için gerekli bir davranıştır ve gelişimi, hareketi, sağlığı ve üremeyi etkiler. Bu nedenle, doğru türde ve miktarda gıdanın yutulması, yaşam kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir. Beslenme davranışı üzerine yapılan araştırmalar, gerçek beslenmeyi sağlayan temel süreçlere odaklanır ve iç enerji homeostazını düzenleyen faktörlerin rolünü ve karar vermenin nöronal temellerini ortaya çıkarır. Model organizma Drosophila melanogaster, tek nöronları etiketlemek ve manipüle etmek için çok çeşitli genetik olarak izlenebilir araçlara sahip, nöronal ağların haritalandırılmasına ve gıda alımının düzenlenmesinde yer alan moleküler sinyal kaskadlarının tanımlanmasına izin verir. Bu rapor, CApillary FEeder testini (CAFE) gösterir ve bir grup sineğin gıda alımının saatler ile günler arasında değişen zaman aralıkları için nasıl ölçüleceğini gösterir. Bu kullanımı kolay tahlil, sineklerin serbestçe erişebileceği ve beslenebileceği sıvı gıdalarla dolu cam kılcal damarlardan oluşur. Tahlildeki gıda tüketimi, basit ölçüm araçları kullanılarak doğru bir şekilde belirlenir. Burada, CAFE testinin kurulumundan başarılı bir şekilde yürütülmesine kadar olan yöntemi adım adım açıklıyoruz ve kontrollü koşullar altında bir grup sineğin gıda alımını analiz etmek için pratik örnekler sunuyoruz. Okuyucu, testin olası sınırlamaları konusunda yönlendirilir ve yöntemin D. melanogaster'deki diğer besleme testlerine kıyasla avantajları ve dezavantajları değerlendirilir.

W 1118 genotip sinekler test yapılır göstermek için kullanılır. W 1118 mutantlan genellikle transjenik çizgiler üretmek ve transgenlerin genetik arka planı beyaz gen ile işaretlenmiş kontrol etmek için kullanılır. Normal olarak, davranış deneyler için, bütün transjenik soylarda deneysel kontrol olarak kullanılan aynı ağırlık 1118 stoklar, beş kuşaktır backcrossed edilir. Biz farklı deneyler gösteriyor: Modifiye kurulum ...

CApillary FEeder (CAFE) testi, gıda alımının altında yatan mekanizmaları araştırmak için basit, bütçe dostu, son derece güvenilir bir yöntemdir. Çok yönlü genetik model organizma Drosophila melanogaster ile birlikte kullanıldığında, gıda alımının düzenleyici mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmenin güçlü bir yolunu sunar.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

CApillary FEeder testinin genel amacı, yetişkin sineklerin sıvı gıda alımını gözlemlemek ve ölçmektir. Bu yöntem, gerçek beslenme davranışının nasıl başlatıldığı ve gıda tüketiminin nasıl sonlandırıldığı gibi metabolik araştırmalardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, kullanımı kolay ve son derece güvenilir olmasıdır.Yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü tutarlı sonuçlar için birkaç hazırlık adımının dikkatli bir şekilde yürütülmesi gerekir. Deneye başlamak için, bir drosophila melanogaster kültürü plastik şişesi alın ve bir O-ring içeren imal edilmiş bir Pleksiglas kapakla kapatın. Sıvı gıdayı sunmak için bir mikrolitre işaretli beş mikrolitre mikrokılcal damar kullanın.İki ila 20 mikrolitrelik bir pipet ucunun üst kısmını kesin ve kılcal damarları konik açıklıklara yerleştirmek için ucu kapağın tamamına yerleştirin. Sineklerin kaçmasını önlemek için aynı açıklığa kesilmemiş iki ila 20 mikrolitrelik bir pipet ucu sokun. Kapağın merkezi açıklığından sekiz veya 20 sinek sıkıştırarak veya bir üfleme borusu ile yükleyin ve deliği bir sünger tıkaç ile kapatın.Ardından, hazırlanan çoklu şişeleri, güvenli bir şekilde tutmak

the-capillary-feeder-assay-measures-food-intake-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, meyve sinekleri için renkli gıdaların beslenmeyi izlemek için kullanıldığı bir besleme testi ve eklenen bileşiklerin besleme aktivitesi üzerindeki etkisi açıklanmaktadır. Örnek protokol, çeşitli endokrin bozucu kimyasalların (EDC) etkilerini test eder.

Beslenme Testi: Drosophila melanogaster'de Beslenme Tercihlerinin Değerlendirilmesi

Bu video, tercih edilen maddenin yutulmasından sonra sineğin karın rengini değerlendirerek farklı tada sahip renkli solüsyonlara karşı çekiciliği veya kaçınmayı ölçmek için kullanılan davranışsal bir yöntem olan tat tercihi testini açıklar. Öne çıkan protokol, sineklerin değişen sakaroz konsantrasyonlarına sahip çözeltilere yönelik tercihini ölçmek için kullanılan prosedürü göstermektedir.

Tat tercihi testi: Drosophila'da beslenme davranışını ölçmek için bir yöntem

Bu videoda, sınırsız meyve sineklerinin gıda alımını ve tercihini ölçen davranışsal bir yöntem olan CApillary FEeder veya CAFE testi açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, gıdayı vermek ve alımını izlemek için kullanılan sıvı dolu kılcal damarlardan minimum buharlaşma ile testin nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.

CApillary FEeder (CAFE) Testi: Drosophila'da Gıda Tüketimini ve Tercihini İzlemek İçin Bir Yöntem

Bu video makalede, Drosophila melanogaster uçmak yetişkin meyve koku bağımlı gıda arama davranışı üzerine açlık veya tokluk etkisini ölçmek için otomatik bir deneyi açıklar.

Toplayıcılık Davranış için Tek-sinek Deneyi Drosophila

Tat, faydalı maddelere çekilmeyi ve toksik maddelerden kaçınmayı kolaylaştıran önemli bir duyusal süreçtir.  Bu protokol, belirli bir kimyasal bileşik için Drosophila tat tercihini belirlemek için basit bir yutma testini tanımlar.

Yetişkin için tat Tercihi Testi<em&gt; Drosophila</em

Nicel gıda alımı deneyleri boyalı gıda ile sağlam sağlamak ve yüksek üretilen iş besleme motivasyon değerlendirileceği anlamına gelir. Gıda tüketimi tahlil ile thermogenetic birleştiren ve optogenetic ekranlar iştah yetişkin temel sinir devreleri araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır Drosophila melanogaster.

Nicel gıda alımı deneyleri birleştirerek ve zorla iştah Drosophila içinde çalışmaya nöronların aktive

Burada açıklanan, farklı makro besin kalitesinde diyetlere maruz kalan Drosophila melanogaster larvaları tarafından belirli bir zaman aralığında yenen yiyecek miktarının kolorimetrik olarak ölçülmesini sağlayan bir protokoldür. Bu tahliller nöronal termogenetik ekran bağlamında gerçekleştirilir.

Drosophila Larvaları Kullanılarak Termogenetik Nöronal Ekranda Makro besin alımının nicelleştirilmesi

Sinekler için iki seçenekli bir besleme tahlilleri için bir protokol sunuyoruz. Bu besleme testini çalıştırmak hızlı ve kolaydır ve sadece küçük ölçekli laboratuvar araştırmaları için değil, aynı zamanda sineklerdeki yüksek verimli davranışsal ekranlar için de uygundur.

Drosophila&apos;da Hızlı Bir Yemek Tercihi Tahlil

Mikro plaka besleyici tahlili, Drosophila'dakisıvı gıda tüketimini ölçmek için ekonomik, yüksek verim yöntemi sunar. 3D baskılı bir cihaz, sineklerin barındırıldığı 96 kuyulu bir mikro plakayı, sineklerin bir izleyici boyası ile bir besleme çözeltisi tükettiği 1536 kuyulu bir mikro plakaya bağlar. Çözelti hacmi düşüşü spektrofotometrik olarak ölçülür.

Drosophila'da Tüketimin Nicelleştirilmesi için Yüksek Verimli Mikro Plaka Besleyici Tahlili

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Öğrenin, Drosophila melanogaster'da beslenme davranışını ölçmek için CAFE analizini. Bu güvenilir yöntem metabolik araştırmalarda besin alım mekanizmalarını incelemeye yardımcı olur.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler

Daha fazla video keşfet