Name: Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Öğrenin, dekonvolüsyon mikroskobu kullanarak doketaksel dirençli meme kanser hücrelerinde mikrotübül dinamik dengesizliğini canlı görüntüleme yöntemiyle nasıl ölçeceğinizi. Bu protokol, ilaç tedavileri altında hücre biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma CBCF'den (ZW'ye) sağlanan fonla desteklenmektedir.

1. Canlı Görüntüleme Hücreleri hazırlanması <ol><li> Hücre kültürü ve tohum <ol><li> Dosetaksel (MCF-7 TXT) ve dirençli olmayan ana hücre dizisi (MCF-7 CC) karşı direnç için seçilir MCF-7 göğüs kanseri hücreleri kullanır. Ayrıntılı seçim süreci ve bu seçilen hücre hatları özellikleri daha önce 24 tarif edildi. </li><li> Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) ve fetal sığır serumu (FBS), 10%, 90% oluşan ve temel olmayan amino asitler ile takviye edilmiş bir ortam içinde, 37 ° C&#39;de 10 cm kültür tabaklarında tüm hücreleri büyütün. % 5 CO2 atmosferinde ortam muhafaza edin. 5 nM dosetaksel de MCF-7 TXT hücreleri korumak. </li><li> canlı görüntüleme için lamelleri Tohum hücreleri. Gecede UV onları teşhir sonra% 70 alkol ile durulama ve 24 mm poli-L-lizin kaplı cam lamelleri sterilize edin. 35 mm&#39;lik bir 6-yuvalı kültür plakasına lamelleri yerleştirin. plHer iyi bir lamel ace. </li><li> 10 cm&#39;lik bir kültür kabı orta çıkarın ve hücreler PBS ile yıkayın. çanak hücreleri ayırmak için çanak tripsin-EDTA 0.5 mL ekleyin. Hücrelerin dekolmanı aşağıdaki tripsin nötralize etmek çanak kültür ortamı 5 ml ekleyin. </li><li> Birim hacim başına hücre sayısını belirlemek için bir hemasitometre ile hücre sayımı. </li><li> Her bir birim hacmi başına hücre sayısı göre yaklaşık olarak 10 5 hücre ekleyin. hafifçe sallayarak sonra, hücreler lamelleri eklemek için izin inkübatör geri tabak koydu. </li></ol></li><li> GFP etiketli α-tubulin ekspresyonu <ol><li> Mikrotübül dinamiklerinin tahlil üreticinin protokolüne göre, ticari GFP transdüksiyon kontrolü (ör BacMam) GFP-etiketli α-tubulin ile hücreleri nakletmek için. </li><li> 37 ° C hücre kültürü inkübatöründe 36 saat bir gözdeki hücrelerin com izin vermek için, kültürkomplet yapışma ve% 60 izdiham. </li><li> aşağıdaki denkleme göre, her bir oyuğa ilave GFP-etiketli α-tubulin uygun hacimde hesaplayın: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55027/55027eq1.jpg" /> hücrelerin sayısı etiketleme sırasında bir gözdeki hücrelerin sağ tahmini toplam sayısıdır ve istenen PPC hücre başına parçacıkların sayısıdır. Not: MCF-7 hücreleri tohumlama 20 arzu edilen bir PPC 10 5 5 10 ila 2 x hücre sayısı iki gereken her bir lamel için gerekli hacmi dolayısıyla 40 ml. farklı hücreler için, hacim en iyi olmayabilir yukarıda verilen formüle göre hesaplanacaktır. Kesin hacmin GFP tubulin gerçek ifade seviyesine göre ayarlanmalıdır. </li><li> homojen bir çözelti sağlamak için ters çevirme ile GFP etiketli α-tübülin birkaç kez karıştırılır. vorteks etmeyin. NOT: kontrolü için, boş (kontrol) reaktif herhangi bir memeli genetik yoksunelemanları ve potansiyel bakulovirüs dolayımlı etkileri ve arka plan floresanı belirlenmesine yardımcı olmak için kullanılabilir. Olmayan hedefli GFP transdüksiyon kontrolü de tüm hücre yanacaktır, hangi kullanılabilir. </li><li> taze ortam ile kültür ortamı değiştirin. Her bir oyuğa GFP etiketli α-tubulin, yeni orta 2 mL 40 uL ekleyin. </li><li> kültür ortamı ile GFP etiketli α-tubulin tamamen karışmanın sağlanması için hafifçe plakayı sallayın. Kültür Plakaları kuluçka makinesine geri dönün ve GFP-tubulin ekspresyonunu sağlamak için 24 saat boyunca inkübe edilir. </li></ol></li><li> Dosetaksel ile muamele hücreleri Not: Bu deney mikrotübül dinamik istikrarsızlık üzerinde dosetaksel etkisini test etmektir. Bu durumda, hücreler, dosetaksel istenen konsantrasyona ile muamele edilir. <ol><li> Orta DMEM% 90 FBS ve% 10 oluşur ve temel olmayan amino asitler ile takviye hazırlayın. fenol kırmızısı flüoresan etkileyebilir çünkü fenol kırmızısı olmadan DMEM kullanınGFP-tubulin CE. (10 nM ila 10 uM arasında) doketaksel istenilen konsantrasyonu ekleyin. dosetaksel stok solüsyonları dimetil sülfoksitte (DMSO) içinde 10 mM&#39;dir. </li><li> Ön sıcak doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C docetaksel içeren ortam. </li><li> docetaksel içeren ortam ile normal kültür ortamı yerine ve doku kültürü kuluçka makinesi içinde 30 dakika inkübe edilir. Her bir dosetaksel konsantrasyonu için oyuk başına en az 3 lamelleri olmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Canlı Görüntüleme Mikrotubul dinamik dengesizlik incelemek için <ol><li> Sistem kurma <ol><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 de muhafaza edilen bir oda içinde deneyleri gerçekleştirmek. Bir 60X, ters floresan mikroskop ve bir CCD kamera ile 1.42 NA petrol objektif lens ile donatılmış bir mikroskobik sistemi ile zaman atlamalı tarafından floresan görüntü kazanır. </li><li> canlı görüntüleme için hücreler ayarlayın. Pre-sıcak numune tutucu hem de37 ° C&#39;ye kadar ortam. incelemek için lamel seçin. Bir numune tutucu üzerinde ilgi lamel monte ve aşama 1.3.1 hazırlanan docetaksel içeren ortam 1 ml ile inkübe edin. </li></ol></li><li> Mikrotübül dinamik istikrarsızlık Canlı görüntüleme <ol><li> görüntüleme için kullanılacak hücrelerin belirlenmesi. Bunlar, düz GFP-tubulin yüksek floresan yoğunluğunu, ve açık bir mikrotübül yapılarının sahip olmalıdır. </li><li> İlk incelemek için aşama 2.2.1 üzerinden tanımlanmıştır hücre grubundan bir ölçeri seçin. belirlenen hücrenin çevresel alana odaklanmak. maruz kalma süresi için program ve görüntü alımı sıklığını ayarlayın. Pozlama süresi genellikle 0,5 s gibi görüntüleri her iki s satın alınacak. </li><li> 1.33 den 2.2.3 adımları için ek bir 20 dakika bekleyin. Aşama 1.3.3 tarif edildiği gibi nedenle, tam 50 dakika dosetaksel ilave edildikten sonra (bu standardizasyon için) görüntüleme başlar. </li><li> mikrotübül d kaydedindinamiği çalışmaları 2 dakika süreyle, bir Fotoğrafa her 2 sn alarak. Toplamda, tespit hücre için 60 görüntü kazanır. </li><li> Bir sonraki tanımlanmış hücreye taşımak ve tekrar 2.2.4 için 2.2.2 adımları. 5 hücreleri görüntülü kadar aynı işlemi tekrarlayın. Adım 1.3.3 de açıklandığı gibi zaman, dosetaksel eklenmesinden sonra 70 dakika ulaşmadan önce bunu yapmak zorunludur. </li><li> Her tedavi koşulu için tekrarlayın 3 farklı lamelleri için 2.2.5 için 2.2.1 adımları. Toplamda, görüntü 15 hücreleri, yeterli veri mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için hangi. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü İşleme ve Veri Analizi <ol><li> Görüntülerin Dekonvolüsyon <ol><li> yüksek kalitede elde etmek için elde edilen görüntüleri Deconvolve. mikroskop sistemi ile donatılmış Dekonvolüsyonun programını açın. </li><li> &quot;Süreç&quot; tıklayın ve &quot;Deconvolve.&quot; &quot;Giriş&quot; penceresinde görüntü dosyasını sürükleyin ve tıklayın &quot;Do.&quot; görüntü dosyası deconvolved ve olacakdeconvolved dosya otomatik olarak yeni bir dosya olarak kaydedilir. </li></ol></li><li> Videoları Üretimi <ol><li> donanımlı yazılımla açmak için deconvolved görüntü dosyasını tıklatın. </li><li> &quot;Dosya&quot; tıklayın ve &quot;film olarak kaydedin.&quot; olarak &quot;AV&quot; ve &quot;Animasyon tarzı&quot; olarak &quot;Film formatı&quot; Seç &quot;İlet.&quot; &quot;100%&quot; ve &quot;Çerçeve oranı&quot; için &quot;Sıkıştırma kalitesi&quot; Set &quot;5 / saniye.&quot; </li><li> &quot;Zaman içinde canlandırın&quot; ve tıklayın kutusunu işaretleyin &quot;Do it.&quot; Video oluşacaktır. </li></ol></li><li> Mikrotübül kısalma ve büyüme hızının ölçülmesi <ol><li> ölçümü için kullanılacak mikrotübül belirleyin. her bir hücre için, sadece bir kaç mikrotübüller bunların yağ ya da büyüme açık ve tam olarak takip olması mümkün olur. </li><li> mikrotübül a başlangıç ​​uzunluğunu gösterir çerçeveyi belirlemek için videonun her karesini inceleyinnd en uzatılabilir veya kısaltılabilir mikrotübül ile çerçeve. İki mikrotübül ve iki kare arasında geçen süre arasındaki uzunluk değişimi ölçün. </li><li> zaman uzunluğu değişimi bölerek büyüme veya kısalma oranını hesaplamak (birim mm / s). Her bir tedavi durumu için, en az 10 hücrelerin takip ve en az 20 mikrotübülleri ölçer. </li><li> Her bir tedavi durumu için ortalama ve standart hata hesaplanır. Öğrenci testi kullanılarak koşulları arasındaki istatistiksel fark analiz eder. tablo ve / veya bir grafik veri rapor edin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kamangar, F., Dores, G. M., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cancer+incidence%2C+mortality%2C+and+prevalence+across+five+continents%3A+defining+priorities+to+reduce+cancer+disparities+in+different+geographic+regions+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cancer incidence, mortality, and prevalence across five continents: defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world.</a> J Clin Oncol. 24 (14), 2137-2150 (2006).</li>
<li>Yardley, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+and+the+role+of+combination+chemotherapy+in+improving+patient+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug resistance and the role of combination chemotherapy in improving patient outcomes.</a> Int J Breast Cancer. 2013, 137414(2013).</li>
<li>Jassem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+paclitaxel+versus+fluorouracil%2C+doxorubicin%2C+and+cyclophosphamide+as+first-line+therapy+for+women+with+metastatic+breast+cancer%3A+final+results+of+a+randomized+phase+III+multicenter+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and paclitaxel versus fluorouracil, doxorubicin, and cyclophosphamide as first-line therapy for women with metastatic breast cancer: final results of a randomized phase III multicenter trial.</a> J Clin Oncol. 19 (6), 1707-1715 (2001).</li>
<li>Nabholtz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docetaxel+and+doxorubicin+compared+with+doxorubicin+and+cyclophosphamide+as+first-line+chemotherapy+for+metastatic+breast+cancer%3A+results+of+a+randomized%2C+multicenter%2C+phase+III+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Docetaxel and doxorubicin compared with doxorubicin and cyclophosphamide as first-line chemotherapy for metastatic breast cancer: results of a randomized, multicenter, phase III trial.</a> J Clin Oncol. 21 (6), 968-975 (2003).</li>
<li>Zelnak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+taxane+and+anthracycline+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Overcoming taxane and anthracycline resistance.</a> Breast J. 16 (3), 309-312 (2010).</li>
<li>Rivera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+anthracycline-resistant+and+taxane-resistant+metastatic+breast+cancer+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+J%22%5BJournal%5D)">Implications of anthracycline-resistant and taxane-resistant metastatic breast cancer and new therapeutic options.</a> Breast J. 16 (3), 252-263 (2010).</li>
<li>Longley, D. B., Johnston, P. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15641020">Molecular mechanisms of drug resistance.</a> J Pathol. 205 (2), 275-292 (2005).</li>
<li>Downing, K. H., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+structure+of+tubulin%3A+implications+for+dynamics+and+drug+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Struct.Funct%22%5BJournal%5D)">Crystallographic structure of tubulin: implications for dynamics and drug binding.</a> Cell Struct.Funct. 24 (5), 269-275 (1999).</li>
<li>McGrogan, B. T., Gilmartin, B., Carney, D. N., McCann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%2C+microtubules+and+chemoresistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.Biophys.Acta%22%5BJournal%5D)">Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer.</a> Biochim.Biophys.Acta. 1785 (2), 96-132 (2008).</li>
<li>Kamath, K., Oroudjev, E., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microtubule+dynamic+instability+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of microtubule dynamic instability in living cells.</a> Methods Cell Biol. 97, 1-14 (2010).</li>
<li>Dumontet, C., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-binding+agents%3A+a+dynamic+field+of+cancer+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics.</a> Nat Rev Drug Discov. 9 (10), 790-803 (2010).</li>
<li>Jordan, M. A., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+as+a+target+for+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules as a target for anticancer drugs.</a> Nat.Rev.Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J.Cell Sci. 122 (15), 2579-2585 (2009).</li>
<li>Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+and+resistance+to+tubulin-binding+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Cancer%22%5BJournal%5D)">Microtubules and resistance to tubulin-binding agents.</a> Nat.Rev.Cancer. 10 (3), 194-204 (2010).</li>
<li>Diaz, J. F., Valpuesta, J. M., Chacon, P., Diakun, G., Andreu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microtubule+protofilament+number+induced+by+Taxol+binding+to+an+easily+accessible+site.+Internal+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Changes in microtubule protofilament number induced by Taxol binding to an easily accessible site. Internal microtubule dynamics.</a> J.Biol.Chem. 273 (50), 33803-33810 (1998).</li>
<li>Abal, M., Andreu, J. M., Barasoain, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxanes%3A+microtubule+and+centrosome+targets%2C+and+cell+cycle+dependent+mechanisms+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Taxanes: microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action.</a> Curr Cancer Drug Targets. 3 (3), 193-203 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mechanisms+underlying+acquired+resistance+to+taxanes+in+selected+docetaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple mechanisms underlying acquired resistance to taxanes in selected docetaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (37), (2014).</li>
<li>Lal, S., Mahajan, A., Chen, W. N., Chowbay, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenetics+of+target+genes+across+doxorubicin+disposition+pathway%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenetics of target genes across doxorubicin disposition pathway: a review.</a> Curr. Drug Metab. 11 (1), 115-128 (2010).</li>
<li>Murray, S., Briasoulis, E., Linardou, H., Bafaloukos, D., Papadimitriou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxane+resistance+in+breast+cancer%3A+mechanisms%2C+predictive+biomarkers+and+circumvention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treat.Rev%22%5BJournal%5D)">Taxane resistance in breast cancer: mechanisms, predictive biomarkers and circumvention strategies.</a> Cancer Treat.Rev. 38 (7), 890-903 (2012).</li>
<li>Kamath, K., Wilson, L., Cabral, F., Jordan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BetaIII-tubulin+induces+paclitaxel+resistance+in+association+with+reduced+effects+on+microtubule+dynamic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">BetaIII-tubulin induces paclitaxel resistance in association with reduced effects on microtubule dynamic instability.</a> J.Biol.Chem. 280 (13), 12902-12907 (2005).</li>
<li>Banerjee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+levels+of+tyrosinated+alpha-%2C+beta%28III%29-%2C+and+beta%28IV%29-tubulin+isotypes+in+paclitaxel-resistant+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.Biophys.Res.Commun%22%5BJournal%5D)">Increased levels of tyrosinated alpha-, beta(III)-, and beta(IV)-tubulin isotypes in paclitaxel-resistant MCF-7 breast cancer cells.</a> Biochem.Biophys.Res.Commun. 293 (1), 598-601 (2002).</li>
<li>Wiesen, K. M., Xia, S., Yang, C. P., Horwitz, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+class+I+beta-tubulin+sensitizes+Taxol-resistant+breast+adenocarcinoma+cells+harboring+a+beta-tubulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Wild-type class I beta-tubulin sensitizes Taxol-resistant breast adenocarcinoma cells harboring a beta-tubulin mutation.</a> Cancer Lett. 257 (2), 227-235 (2007).</li>
<li>Iseri, O. D., Kars, M. D., Arpaci, F., Gunduz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+of+drug-resistant+MCF-7+cells%3A+implications+for+relation+to+extracellular+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis of drug-resistant MCF-7 cells: implications for relation to extracellular matrix proteins.</a> Cancer Chemother.Pharmacol. 65 (3), 447-455 (2010).</li>
<li>Hembruff, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+drug+transporters+and+drug+accumulation+in+the+temporal+acquisition+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of drug transporters and drug accumulation in the temporal acquisition of drug resistance.</a> BMC.Cancer. 8, 318(2008).</li>
<li>Yenjerla, M., Lopus, M., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dynamic+instability+of+steady-state+microtubules+in+vitro+by+video-enhanced+differential+interference+contrast+microscopy+with+an+appendix+by+Emin+Oroudjev%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of dynamic instability of steady-state microtubules in vitro by video-enhanced differential interference contrast microscopy with an appendix by Emin Oroudjev.</a> Methods Cell Biol. 95, 189-206 (2010).</li>
<li>Sammak, P. J., Gorbsky, G. J., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+vivo%3A+a+test+of+mechanisms+of+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in vivo: a test of mechanisms of turnover.</a> J Cell Biol. 104 (3), 395-405 (1987).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> J Cell Biol. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 13, 83-117 (1997).</li>
<li>Walczak, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+and+tubulin+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins.</a> Curr Opin Cell Biol. 12 (1), 52-56 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

In vitro ve in vivo: mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için iki ana yöntem vardır. In vitro yöntemde, saflaştırılmış tubulin bilgisayar destekli zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için kullanılır. In vivo metodunda, floresan tubulin mikroenjeksiyon ya da GFP-tubulin ifade mikrotübüllere dahil edilir. Mikrotübül dinamikleri (büyüme ve kısalma) sonra fazlar arası hücrelerinin 10,<...

<html> Meme kanseri ölümlerinin önde gelen nedenidir metastazı 1, 2 geçer. Birinci basamak metastatik meme kanseri, 2, 3, 4, 5, 6 tedavisinde rejimleri gibi dosetaksel ve paklitaksel gibi taksanlarm kendilerine hidrofobik şu anda kullanılmaktadır. Onlar mikrotübül dinamiklerini bozabilir mikrotübül hedefleme ajanları (MTAs) bir grubun parçasıdır. Ancak, küratif tedavi taksan kullanarak en büyük sorunlardan biri nüks 7 neden kanser hücrelerinde taksan direnci, geliştirilmesidir. İlaç direnci metastatik meme kanseri 7 olan hastalarda, tüm ölümlerin% 90&#39;dan fazla sorumludur. Mikrotübüller α- ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonuyla oluşurclass = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9. mikrotubul dinamiği kesin düzenlemesi, hücre polarizasyon, hücre döngüsü ilerlemesinin, hücre içi ulaşım ve hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok hücre fonksiyonları için önemlidir. Mikrotübüllerin ve dinamikleri bozulması hücre fonksiyonunu bozabilir ve hücre ölümü 10, 11 neden olur. Bu sistem bozukluğu neden bağlı olarak, MTA ilaçlar mikrotübül stabilize edici ajanlar (örneğin, taksanlar) ya da mikrotübül destabalizing maddeler (örneğin, vinka alkaloidler ve kolşisin yerinde bağlama maddeleri), 20, ya da sınıflandırılabilir. Mikrotübül kütlesi üzerindeki zıt etkilerine rağmen, yeterli dozda, hem sınıflar mikrotübül dinamiklerine 21 üzerindeki etkileri yoluyla kanser hücrelerini öldürür. Taksan yol açan mikrotübül mili 12 dengeleyici öncelikle işlevkromozomal hiza. mili montaj kontrol noktasında (SAC) sonraki sürekli aktivasyon mitoz hücreyi tutuklamalar. Uzamış mitotik tutuklama daha sonra apoptoz 13, 14 olur. Taksan monte tubulin 16 sadece mevcut olan β-tubulin 8, 15, ilgili taksan bağlanma sitesi üzerinden mikrotübüller ile etkileşime girer. Taksan direnç çok mekanizma 17 9 önerilmiştir. Bu mekanizmalar sayesinde ilaç akış proteinler ve taksan özgü direnci 5, 9, 18, 19 aşın hem genel hem de çoklu ilaç direncini kapsamaktadır. Örneğin, taksan dirençli kanser hücreleri, bazı β-küvet ekspresyonu ve fonksiyonunu değiştirmiş olabilirUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 izotipleri. Mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için bir in vivo yöntem kullanarak, dirençli olmayan ebeveyn MCF-7 hücreleri CC 17 ile karşılaştırıldığında, dosetaksel dayanıklı MCF-7 TXT hücrelerin mikrotübül dinamiklerinin dosetaksel tedaviye duyarlı olduğunu göstermektedir. Daha iyi MTAs işlevini ve kanserli hücrelerde taksan direnci tam mekanizmasını anlamak için, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için esastır. Burada, bu sayede, bir in vivo yöntem sunulmaktadır. Hücrelerinde GFP-etiketli tubulin sentezlenmesi ile birlikte canlı görüntüleme kullanarak, MCF-7 TXT ve MCF-7 hücreleri CC ve wi mikrotübül dinamiklerinin ölçebilirthout dosetaksel tedavisi. Sonuçlar bize taksan direncini aşmak için daha etkili ilaçlar tasarlamaya yardımcı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>12483</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100x)</td> <td>Yaşam Teknolojileri, Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>dosetaksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01885-5mg-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenol kırmızı içermeyen</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>21063</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Reaktif * BacMam 2.0 * GFP-tubulin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10613</td><td>Hücrelerde GFP tübülini eksprese etmek için anahtar reaktif</td></tr><tr><td>CellLight Reaktifi * BacMam 2.0 * GFP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B10383</td><td>Kontrol</td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich + B9: AA9</td><td>472301</td><td>decetaxel'i dağıtmak için</td></tr><tr><td>22 mm cam coveslip</td><td>Fisher Scientifics</td><td>12-545-101</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu kültür plakası</td><td>Greiner Bio-One International</td><td>6 Kuyulu Celi Kültür Plakası</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision Mikroskopi Görüntüleme Sistemleri</td><td>GE Health</td><td></td><td>Bu sistem, sıcaklık ve CO2'yi kontrol etmek için hava durumu istasyonu ile donatılmıştır. Ayrıca evrişim ve zaman atlamalı kontrol için Worx Yazılımı ile donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Parlak Çizgili Hemasitometre Seti, Hausser Scientific</td><td>Hausser Scientific, VWR tarafından dağıtıldı</td><td>Tedarikçi No.: 1492 VWR No.:15170-172</td><td></td></tr></tbody></table>

canlı görüntüleme taksan dirençli meme kanserlerinde mikrotubul dinamik dengesizlik eğitim için

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Dosetaksel gibi taksanlar, kanseri tedavi etmek için yaygın olarak güvenilen bir grup mikrotübül hedefleme ajanına (MTA) aittir. Bununla birlikte, kanserli hücrelerdeki taksan direnci, ilaçların uzun süreli kullanımının etkinliğini büyük ölçüde azaltır. Birikmiş kanıtlar, taksan direncinin altında yatan mekanizmaların, ilaç akışı proteinlerinin aşırı ekspresyonuna bağlı olarak çoklu ilaç direncinin gelişmesi gibi genel mekanizmaları ve mikrotübül dinamiklerini içerenler gibi taksana özgü mekanizmaları içerdiğini göstermektedir. 
Taksanlar hücre mikrotübüllerini hedef aldığından, mikrotübül dinamik kararsızlığının ölçülmesi, taksan direncinin mekanizmalarını belirlemede önemli bir adımdır ve bu direncin nasıl üstesinden gelineceğine dair içgörü sağlar. Deneyde, mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için in vivo bir yöntem kullanıldı. GFP etiketli α-tübülin, MCF-7 hücrelerinde eksprese edildi ve mikrotübüllere dahil edildi, bu da mikrotübül dinamiklerinin hassas bir kamera kullanılarak zaman atlamalı olarak kaydedilmesine izin verdi. Sonuçlar, dirençli olmayan ebeveyn MCF-7CC hücrelerinin aksine, dosetaksele dirençli MCF-7TXT hücrelerinin mikrotübül dinamiklerinin dosetaksel tedavisine duyarsız olduğunu ve bunun da dosetaksel kaynaklı mitotik arrest ve apoptoza karşı dirence neden olduğunu göstermiştir. Bu makale, mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için bu in vivo yöntemi özetleyecektir.

Burada sunulan protokolü kullanarak, (MCF-7 TXT) meme kanseri hücrelerinde (MCF-7 CC), normal ve dosetaksel dayanıklı mikrotübül dinamiklerine dosetaksel etkilerini inceledi. Görüntü iki takım MCF-7 CC ve MCF-7 TXT hücreleri (Şekil 1A) mikrotübül büyüme ve katı üzerine dosetaksel (0.5 uM) etkilerini göstermektedir. Ayrıca, iki hücre hatları için bu koşullar altında m...

Bu yazıda, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde (MCF-7TXT) mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmek için in vivo bir yöntemi tanımlayan bir protokol sunuyoruz. Bu yöntemde, hedef hücrelerde GFP-tubulin ekspresyonunu tespit etmek için bir dekonvolüsyon mikroskobu görüntüleme sistemi kullanılır.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Bu deneyin genel amacı, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmektir. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki mikrotübül dinamik kararsızlığı ile ilgili fizyolojik koşullar altında ve çeşitli ilaç tedavilerini takiben önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerini incelemek için basit, güvenilir ve fizyolojik olarak uygulanabilir bir protokol sağlamasıdır.Prosedüre başlamadan önce, meme kanseri hücrelerini 37 santigrat derecede 10 santimetre kültür kaplarında tam kültür ortamında ve% 5 karbondioksiti uygun birleşme derecesine kadar büyütün. Deneyden bir gün önce, 24 milimetre poli L-lizin kaplı cam kapak kapaklarını %70 alkolle durulayın ve fişleri gece boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ertesi sabah, altı kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna bir kapak fişi yerleştirin.Daha sonra kültürleri PBS ile yıkayın ve her tabaktaki hücreleri 0.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Hücreler plakanın altından kalkmaya başladığında, tripsini beş mililitre taze kültür ortamı ile nötralize edin ve hücreleri sayın. Daha sonra her bir kapak fişine yaklaşık bir kez 10 beşinci hücre ekleyin, plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri en az 36 saat boyunca inkübatöre geri koyun.Hücrelerin mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için, girdap olmadan homojen bir çözelti sağlamak için GFP etiketli alfa tübülin stok çözeltisini birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, her bir oyuktaki kültür ortamını, 40 mikrolitre etiket tübülini içeren iki mililitre taze ortamla değiştirin. İşaretleyicinin kültür ortamı ile tamamen karışmasını sağlamak için plakayı hafifçe çalkalayın ve plakayı 24 saat daha inkübatöre geri koyun.Ertesi gün, kültür ortamını dosetaksel içeren taze ortamla değiştirin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Hücreler inhibe edilirken, ters çevrilmiş floresan mikroskobunu açın ve numune tutucuyu 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından 60X 1.42 NA yağ objektif lensini seçin ve ilk kapak fişini numune tutucuya takın.Numuneyi bir mililitre taze 37 santigrat derece dosetaksel içeren ortamla örtün ve açıkça görülebilen mikrotübül yapılarına sahip yüksek GFP etiketli alfa tübülin floresan yoğunluğu sergileyen bir düz hücre kümesi bulun. Kümedeki hücrelerden birinin çevresel alanına odaklanın ve görüntü alma frekansında uygun pozlama süresini ayarlayın. Dosetakselin ilk alikotunu ekledikten tam olarak 50 dakika sonra, mikrotübül dinamiklerini iki dakika boyunca kaydetmeye başlayın ve her iki saniyede bir fotoğraf elde edin.Tüm görüntüler elde edildiğinde, her bir dosetaksel konsantrasyonunun üç oyuğundan toplam beş hücrenin görüntüleri yakalanana kadar, bir sonraki hücreyi az önce gösterildiği gibi görüntüleyin. Her bir inhibitör konsantrasyonu için tüm görüntüler elde edildiğinde, mikroskop sistemi ve tıklama işlemi içinde dekonvolüsyon programını açın. Ardından, deconvolve'u seçin ve görüntü dosyasını giriş penceresine sürükleyin.Görüntüyü dekonvove etmek için yap'a tıklayın ve dekonvolved görüntü dosyasını mikroskop yazılımı içinde açın. Dosyayı tıklayın ve film olarak kaydedin. Film formatını AV ve animasyon stilini ileri olarak ayarlayın.Sıkıştırma kalitesini %100'e ve kare hızını saniyede beşe ayarlayın. Ardından zaman içinde animasyon kutusunu işaretleyin ve videoyu oluşturmak için yap'ı tıklayın. Bu temsili deneyde, normal ve dosetaksele dirençli meme kanseri hücreleri dosetaksel ile tedavi edildi ve sadece gösterildiği gibi görüntülendi, ancak tedavinin mikrotübül büyümesi ve kısalması üzerindeki etkileri, dosetaksele dirençli olmayan hücrelerde en belirgin olanı.Gerçekten de, 0.5 mikromolar dosetaksel tedavi koşulları altında mikrotübül büyüme ve kısalma hızının ölçülmesi, ebeveynin tübülin dinamiklerinin güçlü bir inhibisyonunu ortaya koymaktadır, ancak dosetaksele dirençli hücrelerin değil. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknikler uygun şekilde gerçekleştirilirse tüm süreç 60 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yüksek GFP tübülin floresan yoğunluğuna sahip düz hücreleri seçmeyi ve GFP floresansının solmasını önlemek için hem uyarma floresansının yoğunluğunu hem de maruz kalma süresini azaltmayı unutmamak önemlidir.Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, hücre ve kanser biyolojisi alanlarındaki araştırmacıların, çeşitli mikrotübül hedefleme ajanlarının normal ve kanserli hücreler üzerindeki etkilerini değerlendirmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli koşullar altında canlı hücrelerde mikrotübül dinamik kararsızlığının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.

live-imaging-to-study-microtubule-dynamic-instability-taxane

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kemik metastazı deneysel bir fare modeli lusiferaz meme tümör hücreleri ifade intrakardiyak teslim edildikten sonra kurulmuştur. Biyoparlaklık ve mikro BT görüntüleme ile tümör gelişimi ve osteolitik lezyon sonuçlandı boyuna takip edildi.

Biyoparlaklık ve Micro CT Görüntüleme Tümör Metastazlari ve osteolitik Lezyonlar İzleme

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Transgenik raportör fareler ve enjekte edilebilir floresan etiketler kullanarak, uzun süreli intravital eğirme diski konfokal mikroskobu, ApcMin/+ kolorektal kanser modelinde miyeloid hücre davranışının bağırsak adenomuna doğrudan görselleştirilmesini sağlar.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme Süm Min / + Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Burada, anti-kanser terapötiklerine yanıt olarak tek hücreleri uzunlamasına izlemek için uzun süreli hızlandırılmış mikroskopi yöntemini açıklıyoruz.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Omurgalı beyin dokusunu invaze eden glioblastoma (GBM) hücrelerinde mikrotübül dinamiklerinin canlı görüntülenmesine izin veren bir teknik sunuyoruz. Floresan etiketli GBM hücrelerinin ortotopik enjeksiyonunun, yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme ile şeffaf bir zebra balığı beynine bağlanması, in situ kanser invazyonu sırasında sitoiskelet dinamiklerinin ölçülmesini sağlar.

Zebra Balığı Beynini İstila Eden Glioblastoma Hücrelerinde Mikrotübül Dinamiğinin Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, dekonvolüsyon mikroskobu kullanarak doketaksel dirençli meme kanser hücrelerinde mikrotübül dinamik dengesizliğini canlı görüntüleme yöntemiyle nasıl ölçeceğinizi. Bu protokol, ilaç tedavileri altında hücre biyolojisi araştırmaları için güvenilir bir araç sunar.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Daha fazla video keşfet