Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Bu deneyin genel amacı, dosetaksele dirençli meme kanseri hücrelerinde mikrotübül dinamik kararsızlığını ölçmektir. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki mikrotübül dinamik kararsızlığı ile ilgili fizyolojik koşullar altında ve çeşitli ilaç tedavilerini takiben önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, canlı hücrelerde mikrotübül dinamiklerini incelemek için basit, güvenilir ve fizyolojik olarak uygulanabilir bir protokol sağlamasıdır.

Prosedüre başlamadan önce, meme kanseri hücrelerini 37 santigrat derecede 10 santimetre kültür kaplarında tam kültür ortamında ve% 5 karbondioksiti uygun birleşme derecesine kadar büyütün. Deneyden bir gün önce, 24 milimetre poli L-lizin kaplı cam kapak kapaklarını %70 alkolle durulayın ve fişleri gece boyunca UV ışığına maruz bırakın. Ertesi sabah, altı kuyulu bir plakanın her bir oyuğuna bir kapak fişi yerleştirin.

Daha sonra kültürleri PBS ile yıkayın ve her tabaktaki hücreleri 0.5 mililitre tripsin EDTA ile ayırın. Hücreler plakanın altından kalkmaya başladığında, tripsini beş mililitre taze kültür ortamı ile nötralize edin ve hücreleri sayın. Daha sonra her bir kapak fişine yaklaşık bir kez 10 beşinci hücre ekleyin, plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri en az 36 saat boyunca inkübatöre geri koyun.

Hücrelerin mikrotübül dinamiklerini analiz etmek için, girdap olmadan homojen bir çözelti sağlamak için GFP etiketli alfa tübülin stok çözeltisini birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, her bir oyuktaki kültür ortamını, 40 mikrolitre etiket tübülini içeren iki mililitre taze ortamla değiştirin. İşaretleyicinin kültür ortamı ile tamamen karışmasını sağlamak için plakayı hafifçe çalkalayın ve plakayı 24 saat daha inkübatöre geri koyun.

Ertesi gün, kültür ortamını dosetaksel içeren taze ortamla değiştirin ve plakayı 30 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Hücreler inhibe edilirken, ters çevrilmiş floresan mikroskobunu açın ve numune tutucuyu 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ardından 60X 1.42 NA yağ objektif lensini seçin ve ilk kapak fişini numune tutucuya takın.

Numuneyi bir mililitre taze 37 santigrat derece dosetaksel içeren ortamla örtün ve açıkça görülebilen mikrotübül yapılarına sahip yüksek GFP etiketli alfa tübülin floresan yoğunluğu sergileyen bir düz hücre kümesi bulun. Kümedeki hücrelerden birinin çevresel alanına odaklanın ve görüntü alma frekansında uygun pozlama süresini ayarlayın. Dosetakselin ilk alikotunu ekledikten tam olarak 50 dakika sonra, mikrotübül dinamiklerini iki dakika boyunca kaydetmeye başlayın ve her iki saniyede bir fotoğraf elde edin.

Tüm görüntüler elde edildiğinde, her bir dosetaksel konsantrasyonunun üç oyuğundan toplam beş hücrenin görüntüleri yakalanana kadar, bir sonraki hücreyi az önce gösterildiği gibi görüntüleyin. Her bir inhibitör konsantrasyonu için tüm görüntüler elde edildiğinde, mikroskop sistemi ve tıklama işlemi içinde dekonvolüsyon programını açın. Ardından, deconvolve'u seçin ve görüntü dosyasını giriş penceresine sürükleyin.

Görüntüyü dekonvove etmek için yap'a tıklayın ve dekonvolved görüntü dosyasını mikroskop yazılımı içinde açın. Dosyayı tıklayın ve film olarak kaydedin. Film formatını AV ve animasyon stilini ileri olarak ayarlayın.

Sıkıştırma kalitesini %100'e ve kare hızını saniyede beşe ayarlayın. Ardından zaman içinde animasyon kutusunu işaretleyin ve videoyu oluşturmak için yap'ı tıklayın. Bu temsili deneyde, normal ve dosetaksele dirençli meme kanseri hücreleri dosetaksel ile tedavi edildi ve sadece gösterildiği gibi görüntülendi, ancak tedavinin mikrotübül büyümesi ve kısalması üzerindeki etkileri, dosetaksele dirençli olmayan hücrelerde en belirgin

Gerçekten de, 0.5 mikromolar dosetaksel tedavi koşulları altında mikrotübül büyüme ve kısalma hızının ölçülmesi, ebeveynin tübülin dinamiklerinin güçlü bir inhibisyonunu ortaya koymaktadır, ancak dosetaksele dirençli hücrelerin değil. Bir kez ustalaştıktan sonra, teknikler uygun şekilde gerçekleştirilirse tüm süreç 60 saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, yüksek GFP tübülin floresan yoğunluğuna sahip düz hücreleri seçmeyi ve GFP floresansının solmasını önlemek için hem uyarma floresansının yoğunluğunu hem de maruz kalma süresini azaltmayı unutmamak önemlidir.

Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, hücre ve kanser biyolojisi alanlarındaki araştırmacıların, çeşitli mikrotübül hedefleme ajanlarının normal ve kanserli hücreler üzerindeki etkilerini değerlendirmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, çeşitli koşullar altında canlı hücrelerde mikrotübül dinamik kararsızlığının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.