İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

Hücre dışı matriks izolasyonu ve ex vivo vazodilatasyon için bu prosedürlerin genel amacı, kemirgenlerde IRF5 inhibitör peptit tedavisini incelemektir. Bu yöntem, hücre dışı matriksteki değişikliklerin hastalığın ilerlemesini nasıl artırabileceğini veya azaltabileceğini yanıtlamaya yardımcı olabilir. Vazodilatasyon çalışmalarının temel avantajı, tüm sinyalizasyon bileşenlerini dikkate almak zorunda kalmadan in vivo süreçler hakkında bize bir fikir vermesidir.

Kardiyak ekstraselüler matriksin izolasyonu, arka bacak veya akciğer gibi diğer organlara da uygulanabilir. İlk olarak, sıkı derili farede fibrillin birin kopyalanmasına odaklanmaya başladığımızda bu fikre sahiptik ve değişen hücre dışı matris ve hücre davranışının etkisini fark ettik. Fareyi uyuşturduktan ve ameliyata hazırladıktan sonra, bir makas kullanarak cildi açın.

Göğüsten çene kemiğine lateral doğru, çenenin ön kısmına doğru alttaki dokuyu rahatsız etmeyecek şekilde dikkatlice kesilmesi. Daha sonra etrafındaki yumuşak dokuyu çıkararak fasiyalis arteri inceleyin. Bunu yaparken atardamara zarar vermemeye dikkat edin.

Açıkta kalan dokuyu paspas tamponunda yıkayın, böylece sağlıklı kalırlar. Fasiyalis arter tamamen açığa çıktıktan sonra, arterin kesileceği yerin distalindeki ilk bifurkasyonun proksimalini kavrayın. Daha sonra, ana arterden kesin ve forseps ile fasiyal arteri tutun.

Fasyalisten çıkan iki dalı kesin ve ardından çatallanmaya ulaşılana kadar çevre dokuyla bağlantıları keserken damarı nazikçe kaldırın. Çatallanma sırasında, damarı serbest bırakmak için her iki yavru arteri kesin ve ihtiyaç duyulana kadar sulu kalacağı bir paspas tamponu kabına aktarın. Vazodilatasyonu ölçmek için önce damarları kanüllemeye hazırlanın.

Terminal çapı 125 ila 175 mikron olan cam pipetleri paspas tamponuyla doldurun. Ayrıca çözelti rezervuarlarını paspaslarla doldurun. Şimdi izole edilmiş damarları kanüle edin.

Oftalmik sütür kullanarak cam pipetlere bağlayın. Pipetlerde hava kabarcıkları oluşmasını önlediğinizden emin olun. Ardından, kap odalarını video kamera eklentisi ile ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin.

Kapların ekran ölçümü için videoyu video kumpas ölçüm sisteminden geçirin. Şimdi iki aşamalı bir işlem kullanarak kaplara basınç uygulayın. İlk olarak, paspaslarla doldurulmuş rezervuarları, 20 milimetre cıva basıncı için kabın üzerinde bir yükseklikte kaldırın.

Paspasların bulunduğu hattı gemiye açın. Kap basınçlandıkça, bağların etrafında ve kabın uzunluğu boyunca sızıntı belirtileri olup olmadığına bakın. Herhangi bir sızıntı bulunmazsa, 60 milimetre cıva basıncı üretmek için rezervuarları yükseltin.

Ardından kaplarda sızıntı olup olmadığını tekrar kontrol edin. Basınç sızıntı olmadan korunduktan sonra, kabı bu basınçta 30 dakika dengeleyin. Dengelendikten sonra, bir ilgi bileşiğine yanıt olarak vazodilatasyonu ölçün.

İlk olarak, U46619 ekleyerek gemiyi yarım ila dörtte üç oranında daraltın. Çözeltinin stabilize olması için damarları altı dakika boyunca yıkamasına izin verin. Ardından, test bileşiğini yavaş yavaş asetilkolin gibi banyo çözeltisine ekleyin.

Her iki dakikada bir, banyodaki test çözeltisinin konsantrasyonunu 000001 azı dişinden başlayarak ve 001 azı dişe kadar 10 artırın. Vazodilatasyondaki değişiklikler sinyalizasyon hakkında soruları gündeme getirdi. Ama bizim odak noktamız kalp.

Hayvanların kullanımını azaltmak için, dışarıdan başlatılan sinyalizasyona odaklanmak için kardiyak hücre dışı matrisi izole etmeyi seçtik. Anestezi uygulanmış bir fareden kalbi toplayarak başlayın. 15 mililitre hipertonik yüzde bir sodyum dodesil sülfat yüklü bir behere aktarın.

Solüsyonu 18 saat boyunca oda sıcaklığında bir karıştırma plakası üzerinde hafifçe karıştırarak tutun. Ertesi gün, çözeltiyi 30 dakika boyunca 15 mililitre yüzde 5 triton X100 ve ardından 15 dakika boyunca 15 mililitre PBS ile değiştirin. Daha sonra ECM'yi ve sıvı nitrojeni 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde dondurun.

Dondurulduktan sonra, dokuyu önceden soğutulmuş bir havan ve havaneli içine aktarın ve bir toz haline getirin. Tozu, viskoz bir çözelti içinde 1:100 konsantrasyonda ilave antibiyotik ile PBS'de süspanse edin. Süspansiyonu yüksek bir sonikasyon ayarında bir buz banyosunda 30 ila 60 saniye boyunca sonikleştirin.

ECM proteini artık izole edilmiştir ve soğuk kalmalıdır. Proteini kullanmadan önce, bir Bradford Testi kullanarak konsantrasyonunu ölçün. IRF5D peptidi, normal IRF5'ten büyük ölçüde farklı olan inhibitör bir peptiddir.

IRF5D sadece 17 amino aside sahiptir ve IRF5'in fosforilasyon bölgesine bağlanır. Bu, fosforilasyonu ve homojenizasyonu önler, böylece IRF5 aktif durumunun oluşumuna müdahale eder. Heterozigot sıkı cilt fareleri, üç hafta boyunca deri altından IRF5D ile tedavi edildi.

Nötrofil ve CD64 sayısı, görüş alanı başına ortalama boyanmış hücre sayısında immünohistokimya ile belirlendiği gibi azaltıldı. IRF5D tedavileri, fosfat tamponu ile tedavi edilenlere kıyasla, IRF5D ile tedavi edilen heterozigot sıkı cilt farelerinde asetilkolinin neden olduğu fasyalis arterlerinin vazodilatasyonunu iyileştirdi. Transgenik farelerin kalp dokusundan türetilen kültürlenmiş miyositlerde, sıkı derili heterozigot farelerden alınan kültürlerde kontrol farelerine göre daha fazla IRF5 pozitif hücre vardı.

Her iki kültürün de IRF5D ile muamelesi, IRF5 pozitif çekirdeklerin azalmasına neden oldu. Bu videoyu izledikten sonra, bir kalbi nasıl hücreden arındıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birçok organa aktarılabilir ve çeşitli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir Ve matrisi aşırı sindirmemenin önemli olduğunu unutmayın.

Ayrıca fascialis arterinin nasıl diseke edileceği ve asılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık 60 dakika sürmelidir ve hemen hemen her vasküler yatakta kullanılabilir. Endotelin ne kadar kırılgan olduğunu hatırlamak, diseksiyon sırasında dikkatli olmak önemlidir.

Sağlıklı düz kas ve hasarlı endotel olması nadir değildir.