Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Bu deneysel protokolün genel amacı, baş ve boyun skuamöz kanserinde perinöral invazyonu etkileyen çok sayıda tedavi koşulunu hızlı bir şekilde değerlendirmek, çok yüksek test başarı oranları ve tekrarlanabilirliği sağlamaktır. Bu yöntem, baş ve boyun onkolojisi alanında, baş ve boyun kanseri hücresi perinöral invazyonunu etkileyen faktörlerin neler olduğu gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, çok sayıda testin nispeten kısa bir süre içinde bir fareden hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirilebilmesidir.

Dorsal kök ganglionu veya DRG diseksiyon prosedürüne başlamadan önce, V-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın en az 40 oyuğuna taze oda sıcaklığında orta ekleyin. Ardından, kuyruğun kökünden farenin başına kadar omurga boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak için bir çift ince makas kullanın. Ve sakral omurganın altındaki dokuyu enine bölün, omurganın her iki tarafını da kafatası tabanına kadar inceleyin.

Numuneyi mikroskop altına aktarın ve omurganın servikal ucunu düşük güçte gözlemleyin. Beyaz omurilik, değişken miktarlarda perispinal kaslar ve yumuşak doku ile çevrili kemikli bir halkanın ortasında belirgindir. Mikroskobik yaylı makas kullanarak, ilk iki ila üç omur gövdesinin sırtını veya üst yönünü ayırın.

Ardından, omur gövdesi diseksiyonunun orta hatta gerçekleşmesini sağlamak için bu ilk kemikli kesimi açmak için makasın yay hareketini kullanın. Sakral omurgaya doğru küçük artışlarla devam edin, omurgayı vertebral cisimlerin ventral veya alt yönünde aynı kesiklerle ikiye bölün. Bir hemispine bir kenara koyarak, omurganın diğer yarısını omurilik yerinde olacak şekilde steril bir plaka üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde aktarın.

Ve hemispinin her iki ucunu polistiren diseksiyon platformuna sabitlemek için iki adet 18 gauge iğne kullanın. Daha sonra, daha dar, servikal uçtan başlayarak, omuriliği yaklaşık dört vertebral seviyeden nazikçe soyun. Duyusal sinirlerin DRG'ye girdiği bölgede, çevredeki fasyayı mikroskobik forsepslerle nazikçe kavrayın ve DRG'yi serbest bırakmak için bu fasyayı ve diğer sinir dokusunu kesmek için mikroskobik yaylı makas kullanın.

Artırılmış büyütme altında, dokuyu serbest bırakmak için periferik siniri DRG'ye mümkün olduğunca yakın kesmek için yaylı makası kullanın ve proksimal dalları kesin. Ardından, herhangi bir başıboş sinir lifinin veya fasiyal ataşmanların DRG'sini kesin ve izole edilen dokuyu 96 oyuklu V-alt plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Yarı katı matris damlacıklarını hazırlamak için, bir cam kuyu tabanlı plakayı buzdan çalışma mikroskobu altında bir buz bloğuna aktarın.

En fazla 10 mikrolitrelik bir pipetin ucunu 45 derecelik bir açıyla doğrudan camın üzerine yerleştirin ve 1,5 mikrolitrelik bir matris damlacığını camın üzerine dikkatlice dağıtın. Matris plakaya geçerken pipet ucunu yavaşça camdan uzaklaştırın. Plakanın dört köşesinin her birine bir damla matris bırakın ve plakayı yaklaşık bir dakika boyunca oda sıcaklığındaki bir yüzeye aktarın.

Matris hafifçe sertleştiğinde, plakayı buz bloğuna geri koyun ve DRG'yi sol elinizle nazikçe almak için kapalı mikroskobik forseps kullanın. Sağ elinizi kullanarak, sinir dokusunu dikkatlice 21 gauge iğnenin ucuna aktarın ve DRG'yi matris damlacığının ortasına nazikçe yerleştirmek için iğneyi kullanın. DRG, iğne ile merkezi konumlandırma için matrisin içine kolayca salınmalıdır.

Dört damlacığın her birine bir DRG parçası yerleştirdikten sonra, plakayı üç dakika boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. DRG'nin tamamı gömüldüğünde, plakaları teker teker hafif bir açıyla tutun ve plakalara yavaşça %10 FBS ile takviye edilmiş dört mililitre DMEM ekleyin, böylece ortam matris DRG üniteleriyle yalnızca kademeli olarak temas eder. Plakaları 48 ila 72 saat daha inkübatöre geri koyun.

Nöritler matrisin kenarına kadar olan yolun en az% 75'ine ulaştığında, matris DRG birimlerini çıkarmadan ortamı kuyulardan aspire edin. Daha sonra, düzgün bir tetikleyiciye sahip 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, her bir matris DRG testinin üzerine mililitre ortam başına üç kez 10 ila beşinci hücreye iki damla yerleştirin. Ve plakaları inkübatöre geri koyun.

Bir saat sonra, cam tabanlı plakanın yan duvarı boyunca% 10 FBS ile dört mililitre DMEM ekleyin ve plakaları bir sonraki mikroskobik değerlendirmeye kadar inkübatöre geri koyun. Matris damlacıkları içinde diseksiyon ve yerleştirilmelerinden sonra, testin görünümü burada gösterilen matris gömülü DRG'ye benzemelidir. DRG'nin mükemmel bir şekilde yuvarlak olmadığını, ancak matris damlacığı içinde ortalandığını ve nöritlerin 360 derece büyümesine izin verdiğini unutmayın.

Kaplamadan hemen sonra, baş ve boyun skuamöz kanser hücreleri, matrisin etrafında çevresel bir halka oluşturur ve sonraki iki ila üç gün boyunca nöritler boyunca genişler. Tek başına matris içeren boş kontrol damlacıkları üzerine kaplanmış hücreler, matrislerin etrafında aktif olarak bölünür, ancak tepeye girmez veya uzanmaz. Kanser hücrelerinin perinöral istilasının niceliğini belirlemek için, tahlillerin görüntüleri bir dikey ve bir yatay çizgi ile dört çeyreğe bölünür.

Daha sonra, her kadranda gözlenen her perinöral invazyon uzantısı için bir dizi nokta puanlanır ve farklı kanser hücre hatları arasındaki nöritler boyunca kanser hücresi büyümelerinin karşılaştırılmasına olanak tanır. Bir kez ustalaştıktan sonra, dorsal kök gangliyon izolasyon tekniği, uygun şekilde uygulanırsa iki saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, dorsal kök gangliyonlarının aşırı kullanımını en aza indirmek önemlidir, çünkü ezilme yaralanması test başarısızlığının en yaygın nedenidir.

Bu prosedürü takiben, perinöral invazyon mekanizmaları incelenebilir ve potansiyel olarak bu tip yumuşak doku invazyonuna karşı hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, dorsal kök gangliyonlarını bir fareden nasıl ayıracağınızı iyi anlamalı ve perinöral invazyonu incelemek için bir tahlil oluşturmalısınız.