İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Bu yöntemin genel amacı, spesifik onkogen dizilerinde idrar hücresi içermeyen DNA'nın bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu yöntem, mesane ve prostat kanserinin erken non-invaziv teşhisi gibi ürolojik kanser alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yapılması ve analiz edilmesinin kolay olmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, ürolojik malignitelerin teşhisine kadar uzanır, çünkü normalde idrarda hücreleri ve serbest nükleik asitleri serbest bırakırlar. Bu yöntem idrar örnekleri hakkında bilgi verebilse de, serum veya plazma gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, idrar hücresi içermeyen DNA konsantrasyonu genellikle düşük olduğu için mücadele eder.

Bu yöntem için ilk olarak, mesane kanserinin non-invaziv erken teşhisi için basit bir yöntem bulmaya çalıştığımızda aklımıza geldi. Prosedüre başlamak için, üç saatten fazla olmamak üzere dört santigrat derecede saklanan 50 mililitrelik temiz bir ilk sabah idrar örneği alın. Numuneyi iki kez ters çevirin ve ardından numuneyi iki adet 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne bölün.

Numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 850 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, her tüp için, süpernatantın üst kısmının 10 mililitresini iki beş mililitrelik tüpe aktarın ve peletin üzerinde en az iki mililitre süpernatan bırakın. Peletleri atın ve süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Gerektiğinde ek idrar örnekleri için bu işlemi tekrarlayın. DNA saflaştırmasına başlamak için, her örnek için bir idrar süpernatantı alikotu çözülür. Çözülmüş numuneyi vorteksleyin ve tüpü iki kez ters çevirin.

Numunenin bir mililitresini beş mililitrelik bir tüpe koyun ve geri kalanını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üreticinin talimatlarına göre idrar örnekleri için uygun bir DNA saflaştırma kiti hazırlayın. Numuneye 100 mikrolitre proteinaz K ve bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve bir pipetle iyice karıştırın.

Numuneyi 56 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, yıkama tamponlarını bir döndürme sütununda hazırlayın. İnkübasyondan sonra, numunenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından bir mililitre mutlak etanol ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.

Numunenin 650 mikrolitresini kolona aktarın. Bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin. Toplama tüpünü değiştirin ve numunenin tamamı kolona yüklenene kadar bu işlemi tekrarlayın.

Daha sonra ilk yıkama tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve sütunu bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin. Toplama tüpünü değiştirin, ikinci yıkama tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve sütunu üç dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Kolonu temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve kalan yıkama tamponunu çıkarmak için üç dakika daha maksimum hızda santrifüjleyin.

Kolonu temiz bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kolona 50 mikrolitre elüsyon tamponu yükleyin ve tamponun yedi dakika boyunca kolona girmesine izin verin. Daha sonra sütunu bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin.

Elüatı tekrar kolona pipetleyin ve idrar hücresi içermeyen DNA'yı elde etmek için kolonu bir dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Standartları hazırlamaya başlamak için, önce bir saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı uygun bir hücre hattından izole edin. Hücre hattındaki saflaştırılmış her idrar örneğinden alınan DNA'yı, kit üreticisinin talimatlarına göre bir spektrofotometre ile ölçün.

UCF DNA'yı mikrolitre başına bir nanograma seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri bütünlük testi için hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Farklı konsantrasyonlarda altı, 100 mikrolitre standartları oluşturmak için hücre hattı DNA'sını seyreltin. Standartları eksi 20 santigrat derecede saklayın.

DNA bütünlük testine başlamak için UCF DNA örneklerini, standartları, uygun PCR primerlerini ve yeşil süper karışımı buz üzerinde çözün. Ardından 72 kuyulu rotor disk plakasını şerit tüplerle ayarlayın. İki, 10 mikrolitrelik standart alikot yerleştirin ve ardından her numuneyi kuyucuklara yerleştirin.

Negatif kontroller olarak 10 mikrolitre RNaz içermeyen iki kuyu hazırlayın. Doldurulmuş her kuyu için, her bir astardan bir mikrolitre, 12,5 mikrolitre yeşil süper karışım ve 6,5 mikrolitre RNaz içermeyen su karışımı hazırlayın. Doldurulmuş her bir kuyucuğa 15 mikrolitre karışım aktarın ve ardından kuyucukları 72 oyuklu bir rotor diskine aktarın.

PCR'yi üreticinin spesifikasyonlarına göre gerçek zamanlı bir cihazla gerçekleştirin. Cihaz yazılımını kullanarak, herhangi bir kopyanın bir veya daha fazla döngü eşiği değeri farkına sahip olup olmadığını kontrol edin. Bu numuneleri analizden atın ve kalan numuneler için medyan döngü eşiğini değerlendirin.

PCR ürün özgüllüğünü değerlendirmek için medyan döngü eşiği değeri 36 veya daha düşük olan her numune üzerinde erime analizi yapın. Ardından, her aplikon için mikrolitre başına nanogram cinsinden bir konsantrasyon belirlemek için standart eğriyi kullanın. İdrar hücresi serbest DNA izole edildi ve solid tümörlerde artmış DNA kopya sayısı gösteren dört bölgede DNA bütünlüğü değerlendirildi.

Her bir numunedeki DNA miktarının bütünlük testi için yeterli olduğunu doğrulamak için bir kontrol dizisi de değerlendirildi. Her gen için toplam serbest DNA konsantrasyonu ve varyasyon katsayıları hesaplandı. Bu yöntem mesane kanserini saptamak için %73 duyarlılık ve %84 özgüllük gösterirken, prostat kanseri için sadece %58 duyarlılık ve %44 özgüllük göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir iş günü içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen genlerin kopya sayısı indükleyicisi gibi ek soruları yanıtlamak için dijital PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücresiz DNA'yı idrardan çok basit bir şekilde nasıl izole edeceğinizi ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlarını kullanarak belirli ilgi alanlarının bütünlüğünü nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.