Name: İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Öğrenin, idrar örneklerinde hücre-free DNA bütünlüğünü analiz ederek mesane ve prostat kanserlerinin erken teşhisini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu invaziv olmayan yöntem, ürolojik onkoloji araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, editöryal yardımları için Gráinne Tierney ve Silvia Bellissimo'ya teşekkür eder.

protokol IRST İnsan Araştırmaları Etik Komitesi kuralları takip eder. NOT: Bu protokol, biz bir UCF DNA bütünlüğü analizi gerçekleştirmek için idrar örneklerinden DNA izole edilmiştir. LNCaP ve MRC hücre çizgileri standart oluşturmak için kullanıldı. Örneğin belirli onkogenlerin DNA ekstraksiyonu (kontrol geni için spektrofotometre ve gerçek zamanlı PCR, STOX1) DNA miktar, ve gerçek zamanlı PCR gibi teknikler (Şekil 1) uygulandı. 1. İdrar Toplama ve İşleme <ol><li> Temiz, kuru, plastik bardak temiz bir-catch ilk sabah idrar örneği almak. idrar örneğinin en az 50 mL toplayın. </li><li> 3 saatlik bir süre için 4 ° C sıcaklıkta idrar korumak ve aynı sıcaklıkta laboratuvara gönder. </li><li> iki adet 50-ml konik tabanlı polipropilen tüpler içine laboratuar ve transfer girişte iki kez hemen evirerek her bir örnek karıştırın. </li><li> tüpleri santrifüj4 ° C sıcaklıkta ya da oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 850 x g&#39;de. </li><li> Dikkatle hücre peleti üzerinde yüzen kısımların en az 2 mL bırakarak iki adet 5 ml tüpler içine idrar yüzer üst kısmının 10 mL aktarın. Not: yüzer üst kısmı aktarma hücreler ya da hücre döküntülerinin kirlenme riskini azaltır. Üst ve alt parçalar arasında net bir tarif bulunmamaktadır. </li><li> pelet atın ve hemen kullanıma kadar -80 ° C süpernatant dondurmak. </li></ol> İdrar süpernatant ve Hücre Hatları 2. DNA İzolasyonu NOT: Bir hücre hattından DNA izole (örneğin, LNCaP mesane kanseri için prostat kanseri ya da MRC için) bir ticari kit kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek. aşağıdaki gibi idrar süpernatanından DNA izolasyonu değiştirilmiş ticari protokol kullanılarak yapılmalıdır: <ol><li> Oda sıcaklığında idrar yüzer bir kısım çözülme. &lt;/ Li&gt; <li> Vorteks ve idrar örneği karıştırın ve berrak bir 5 ml tüp içine idrar 1 mL süpernatan aktarın. -80 ° C&#39;de rezidüel idrar dondurun. </li><li> doğrudan numune için proteinaz K, 100 uL ekleyin. </li><li> örnek AL tamponu 1 ml ilave edilir ve pipetleme iyice karıştırın. </li><li> tüpleri kapatın ve 15 dakika süreyle 56 ° C&#39;de numune inkübe edin. </li><li> İnkübasyon sırasında, her bir örnek için bir sütun hazırlamak ve üreticinin talimatlarına göre yıkama tamponları, Aw1 ve Aw2, (% 100 etanol belirtilen miktarda ekleyebilirsiniz) hazırlar. </li><li> Lütfen, oda sıcaklığına kadar örnekleri getirin ve mutlak etanol 1 ml. Pipetleme tarafından tamamen karıştırın. </li><li> sütun aşama 2.7 &#39;de elde edilen karışımın 650 uL ilave edilir ve 1 dakika süre ile 6000 x g de o santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü sütun yerleştirin. Numune karışımının tüm (5 kez) kullanılır olmuştur yineleyerek 2.8 ve 2.9 adımları tekrarlayın. </li><li> Ekle 500# 181; sütunun jant ıslatmadan tampon Aw1 L. 1 dakika boyunca 6.000 xg&#39;de bunu santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin. </li><li> Sütunun çemberinin ıslatmadan tamponu Aw2 500 uL ekleyin. 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 xg) bunu santrifüj. </li><li> flow-through içeren tüp atın ve yeni, temiz toplama tüpü ile değiştirin. </li><li> Adımı yineleyin 2.12 herhangi bir kalıntı yıkama tamponu çıkarmak için. </li><li> Temiz bir 1.5 mL tüp içine sütun yerleştirin. elüsyon tamponu AE 50 mcL ekleyin ve tampon ıslatır o sütunu sağlamak için 7 dakika bekleyin. </li><li> 1 dakika boyunca 8.000 xg&#39;de bunu santrifüj. </li><li> mini sütuna adım 2.15 den eluent Pipet ve DNA&#39;nın maksimum iyileşme sağlamak için 1 dakika boyunca maksimum hızda bunu santrifüj. </li></ol> 3. DNA sayısallaştırılması ve Seyreltme <ol><li> Bir spektrofotometre kullanılarak, bot DNA ölçümü gerçekleştirmekH hücre çizgisi ve idrar süpernatan örnekleri. üreticinin talimatlarına uygun olarak, bir tezgah üstü spektrometresi üzerindeki örnekte 2 uL kullanın. </li><li> 1 ng / ul konsantrasyon elde DNA bütünlüğü analize kadar -20 ° C &#39;de DNA depolamak için Lake Buena Vista DNA örnekleri seyreltilir. Not: DNA miktarı gerçek zamanlı PCR (en az 100 ng) ile devam etmek için yeterli değildir, yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirmek. </li><li> Farklı konsantrasyonlarda altı standartları elde etmek için hücre çizgisi örnekleri DNA seyreltilir: 0.001, 0.01, 0.1, 1, 0.5 ve 2 ng / ml, 100 uL hacimde (ST1, ST5, ST4, ST3, ST2, her biri ve ST6). DNA bütünlüğü analiz edilinceye kadar -20 ° C&#39;de hücre çizgisi DNA standartları saklayın. </li></ol> 4. DNA Bütünlük Testi - PCR <ol><li> primerler (konsantrasyon deneyi türüne bağlıdır), yeşil Supermix, hücre hattı, DNA standartları ve buz üzerinde UCF DNA, seyreltilmiş örnekler çözülme. </li><li> plaka f şerit tüpleri hazırlayınveya 72 oyuklu rotor diski. Kısım her bir standart ve seyreltilmiş örnek negatif kontrol için RNaz içermeyen su, 10 uL, iki kopya halinde 10 uL. </li><li> Her bir primerden 1 ul bir karışımını hazırlamak, (konsantrasyonları, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir), yeşil Supermix 12.5 uL, ve her bir örnek için RNaz içermeyen su 6.5 uL. 2 çoğaltır, 2 çoğaltır için negatif kontrol ve 2 ekstra numuneler için numune 2 çoğaltır 6 standartları, sayı: karışımı hazırlarken, aşağıdaki örneklerin sayısını kullanın. </li><li> her bir kuyunun içine karışımın Kısım 15 uL. pipetle veya tüpleri dönmeye etmeyin. </li><li> Tablo 1 &#39;de gösterilen PCR, aşağıdaki koşullar ile bir protokol başlatın. NOT: 29 x 2 numuneleri + 6 x 2 standartlarına + negatif kontrol x 2 = 72 (UCF DNA değeri): UCF DNA değeri için, 29 DNA örnekleri 72-kuyu rotor diskini kullanarak her gerçek zamanlı deney için işlendi. NOT: UCF DNA bütünlüğü analizi için protokol de olabilir(Başka bir cihaz kullanırken, ROX boya eklenmesi gerekebilir) başka PCR gerçek zamanlı cihazı kullanılarak yapıldı. </li></ol> 5. DNA Bütünlük Testi - Veri Analizi ve Yorumlanması Not: Daha önce 7-9 (Şekil 2) tarif edildiği gibi, her bir örnek için UCF DNA, bir değer, her bir PCR gen değerlendirilmesi için standart bir eğri yapı ile ve standart eğri interpolasyon kullanarak gerçek zamanlı cihazı algılama sistemi yazılımı ile elde edilmiştir. <ol><li> çoğaltır değerlendirin; Örnek bir fark ile çoğaltır ≥1 Ct atılmalıdır ve bir ikinci deneyde yeniden değerlendirildi. </li><li> Her numune için medyan Ct hesaplayın ve 36 ≤ bir Ct değeri örnekleri göz önünde bulundurun. </li><li> erime analizi kullanılarak PCR ürünlerinin özgüllüğünü değerlendirin. </li><li> standart eğri ile enterpolasyon her amplikon konsantrasyonunu değerlendirmek; Her amplikon için konsantrasyon değeri (ng / ml) edinin.</li>
</ol>

<ol><li>Francis, G., Stein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Cell-Free+Tumour+DNA+in+the+Management+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Mol.Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating Cell-Free Tumour DNA in the Management of Cancer.</a> Int.J.Mol.Sci. 16 (6), 14122-14142 (2015).</li>
<li>Bryzgunova, O. E., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nucleic+Acids+in+Urine%3A+Sources%2C+Structure%2C+Diagnostic+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Naturae%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nucleic Acids in Urine: Sources, Structure, Diagnostic Potential.</a> Acta Naturae. 7 (3), 48-54 (2015).</li>
<li>Szarvas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+analysis+of+tumor+and+urinary+DNA+to+detect+bladder+cancer%3A+urine+supernatant+versus+urine+sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.Rep%22%5BJournal%5D)">Deletion analysis of tumor and urinary DNA to detect bladder cancer: urine supernatant versus urine sediment.</a> Oncol.Rep. 18 (2), 405-409 (2007).</li>
<li>Togneri, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+of+urothelial+bladder+cancer+revealed+in+urinary+cfDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Hum.Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity of urothelial bladder cancer revealed in urinary cfDNA.</a> Eur.J.Hum.Genet. , (2016).</li>
<li>Zonta, E., Nizard, P., Taly, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+Integrity%2C+Applications+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.Clin.Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA Integrity, Applications for Cancer Research.</a> Adv.Clin.Chem. 70, 197-246 (2015).</li>
<li>Hao, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+DNA+in+serum+as+a+biomarker+for+diagnosis+and+prognostic+prediction+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free DNA in serum as a biomarker for diagnosis and prognostic prediction of colorectal cancer.</a> Br.J.Cancer. 111 (8), 1482-1489 (2014).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+Cell-Free+DNA+Integrity+Analysis+for+Early+Detection+of+Prostate+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.Markers%22%5BJournal%5D)">Urine Cell-Free DNA Integrity Analysis for Early Detection of Prostate Cancer Patients.</a> Dis.Markers. 2015, 574120(2015).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+prostate+cancer+diagnosis%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.Res.Int%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early prostate cancer diagnosis: a pilot study.</a> Biomed.Res.Int. 2013, 270457(2013).</li>
<li>Casadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+cell-free+DNA+integrity+as+a+marker+for+early+bladder+cancer+diagnosis%3A+preliminary+data%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.Oncol%22%5BJournal%5D)">Urine cell-free DNA integrity as a marker for early bladder cancer diagnosis: preliminary data.</a> Urol.Oncol. 31 (8), 1744-1750 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br.J.Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Ishkanian, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+array+CGH+identifies+novel+regions+of+genomic+alteration+in+intermediate-risk+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">High-resolution array CGH identifies novel regions of genomic alteration in intermediate-risk prostate cancer.</a> Prostate. 69 (10), 1091-1100 (2009).</li>
<li>Oxley, J. D., Winkler, M. H., Gillatt, D. A., Peat, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Her-2%2Fneu+oncogene+amplification+in+clinically+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.Clin.Patho%22%5BJournal%5D)">Her-2/neu oncogene amplification in clinically localised prostate cancer.</a> J.Clin.Patho. 55 (2), 118-120 (2002).</li>
<li>Nord, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+amplifications+are+associated+with+high+grade+and+recurrences+in+stage+Ta+bladder+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int.J.Cancer%22%5BJournal%5D)">Focal amplifications are associated with high grade and recurrences in stage Ta bladder carcinoma.</a> Int.J.Cancer. 126 (6), 1390-1402 (2010).</li>
<li>Tabach, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+the+20q+chromosomal+arm+occurs+early+in+tumorigenic+transformation+and+may+initiate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Amplification of the 20q chromosomal arm occurs early in tumorigenic transformation and may initiate cancer.</a> PLoS One. 6 (1), e14632(2011).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

UCF DNA bütünlüğü analizi idrar DNA bütünlüğünü değerlendirmek için yeni bir non-invaziv bir yöntemdir. Son zamanlarda mesane 9 ve prostat kanserleri 7,8 erken teşhisi için önerilmiştir. avantajları ve UCF DNA bütünlüğü testi dezavantajları bir dizi birlikte geleceği ile burada tartışılır. yaklaşımın ana avantajı ucuz, non-invazif bir yöntem ve moleküler biyoloji teknikleri sadece temel bilgi gerektiren biyomarkerların potansiyel bir kaynağı olarak idrar incelemek için ...

Hücresiz bir DNA ya apoptotik ya da nekrotik mekanizma ile kan ve hücre ölümüne bağlı idrarda tespit edilebilir. Kandaki hücre-serbest DNA çok çeşitli hastalıklarda tanısal ve prognostik amaçlarla özellikle kanser 1 çalışılmıştır. Ancak, daha az idrar hücre içermeyen (UCF) DNA&#39;nın rolü hakkında bilinmektedir. UCF DNA glomerüler filtrasyon sistemi aracılığıyla ya da bu vücut sıvısı 2 (örn ürotelyal hücreler veya prostat hücreleri) ile doğrudan temas içine gelen hücrelerden kan geçen kaynaklanabilir. Biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA kullanımı esas olarak idrar yolu hücrelerinden 3,4 doğrudan gelen UCF DNA yüksek yüzdesi böbrek, mesane ve prostat kanserinin erken tanısı için incelenmiştir. Küçük UCF DNA ve izole ve karakterize etmek için en iyi yöntemler hakkında bilinmektedir. Değerlendirme tümör hücreleri normal hücrelerden daha uzun DNA fragmanlarını serbest hipotezi göz önüne alındığındahücresiz DNA bütünlüğünü Kan dolaşımı, 5 DNA kökenini aydınlatmak için bir girişim olarak ele alınmıştır. Bazı çalışmalar kanda hücresiz DNA bütünlüğü kanseri 6 birçok türleri iyi bir tanı testi temsil eder ve aynı hipotez idrar 7-9 ile ilişkili olarak önerilmiştir olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, mesane ve prostat kanserinin tespiti için potansiyel bir uygulama ile UCF DNA bütünlüğü analizi için yeni bir yöntem tarif eder. Özellikle, UCF DNA bütünlüğü daha uzun 250 bp prostat ve mesane kanseri dahil olmak üzere katı tümörlerin, artan bir DNA kopya numarası olduğu bilinen 4 bölgelerde test edildi fragmanları: c-MYC (8q24.21), HER2 (17q12.1 ), BCAS1 (20q13.2) ve Ar (Xq12) 10-14. Belirli onkogenler yerine rastgele diziler, kanser hastalarının hücresiz fraksiyonu bularak olasılığını arttırmak için seçilmiştir. ana avantajlarından biri,bu yöntem, esnek olduğu ve diğer bölgelerde tümör tipi ve özellikleri temelinde seçilebilir olmasıdır.

<table><tbody><tr><td>QIAamp DNA Mini Kiti &nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Yeşil Supermix, 100 x 50 & L rxns, 2.5 mL (2 x 1.25 mL)</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>IDT özel DNA oligoları&nbsp;</td><td>IDT&nbsp;</td><td></td><td>HPLC saflaştırma, 100nMole DNA oligo</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> DNA Rotor-Gene 6000 Corbett'i <td>ölçmek için başka spektrofotometrik yöntemler de</td></tr> kullanılabilir Başka <tr><td></td><td></td><td>bir Gerçek Zamanlı PCR cihazı,</td>50 mL tüpler için bir santrifüj olan mikrosantrifüj de kullanılabilir <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka makinesi-80</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& derece; C dondurucu-20</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>derece C dondurucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 & # 956; L pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &# 956; L pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &# 956; L pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956; L pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipet uçları (10; 20; 200; 1.000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor-Disk 72 Rotor</td><td>Corbett</td><td>9018899</td><td></td></tr><tr><td>Şerit Tüpler ve Kapaklar, 0,1 mL (250)</td><td>Qiagen</td><td>981103</td><td></td></tr><tr><td>Toplama Tüpleri (2 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19201</td><td></td></tr><tr><td>Tampon AL (264 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K (10 mL)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr></tbody></table>

İdrar Örneklerinin hücre-free dna bütünlüğü analizi

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

plazma ya da serum içinde hücresiz DNA devrede olmasına yaygın birçok kanser türü için biyolojik belirteçler, uygun bir kaynağı olduğu gösterilmiş olmakla birlikte, çok az çalışma idrar hücresiz (Lake Buena Vista) DNA potansiyel kullanımı üzerinde de yoğunlaşmıştır. uzun DNA, prostat veya mesane kanseri ve sağlıklı bireyler olan hastaların ayırt edebilen bir erken tanı markeri olarak değerlendirildi UCF DNA bütünlüğü potansiyel rolü, normal apoptotik hücreler son derece parçalanmış DNA üretmek hipotez ve kanser hücrelerinden serbest bırakılmasına başlatılıyor. C-myc, BCAS1, HER2 ve Ar: Bir Lake Buena Vista DNA bütünlüğü analizi 250 bp daha uzun dört dizilerin dört gerçek zamanlı kantitatif PCR analizleri bazında önerilmiştir. Sık sık, mesane ve prostat kanserleri artan bir DNA kopya numarası dizileri analiz için seçilmiştir, ancak yöntem esnektir ve bu genler, entegrasyon bölgesinin diğer genler ile ikame edilebilirdinlenme. biyomarkerların kaynağı olarak UCF DNA&#39;nın potansiyel yarar zaten böylece UCF DNA karakterizasyonu üzerine ileri çalışmalar için önünü, ürolojik maligniteler için ortaya konmuştur. UCF DNA bütünlüğü testi non-invaziv, hızlı ve kolay uygulanabilir, analiz gerçekleştirmek için gerekli idrar sadece birkaç mililitre olma avantajına sahiptir.

Tüm numuneler 1.51 ila 138 ng / uL bir dizi gösteren analiz için toplam serbest DNA konsantrasyonu spektrofotometrik olarak ölçülebilir oldu. Beş kontrol numuneleri verilerin yeniden üretilebilirlik için kullanılmıştır: iki bağımsız gerçek zamanlı deneyleri, c-myc, HER2, BCAS1, AR ve STOX1 yapıldı. Varyasyon (CV) katsayılar, daha sonra, iki bağımsız deneyin arasında yeniden iyi bir derecede (Tablo 2), her gen (Tablo 2)...

İdrar örneklerinin hücresiz süpernatan fraksiyonunda DNA bütünlüğünü analiz etmek için bir yöntem önerilmiştir. Yöntem, ürolojik malignitelerin erken teşhisi için uygundur ve mesane kanserinin erken teşhisi için doğruluğu kanıtlanmıştır.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Bu yöntemin genel amacı, spesifik onkogen dizilerinde idrar hücresi içermeyen DNA'nın bütünlüğünü değerlendirmektir. Bu yöntem, mesane ve prostat kanserinin erken non-invaziv teşhisi gibi ürolojik kanser alanındaki önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yapılması ve analiz edilmesinin kolay olmasıdır.Bu tekniğin etkileri, ürolojik malignitelerin teşhisine kadar uzanır, çünkü normalde idrarda hücreleri ve serbest nükleik asitleri serbest bırakırlar. Bu yöntem idrar örnekleri hakkında bilgi verebilse de, serum veya plazma gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler, idrar hücresi içermeyen DNA konsantrasyonu genellikle düşük olduğu için mücadele eder.Bu yöntem için ilk olarak, mesane kanserinin non-invaziv erken teşhisi için basit bir yöntem bulmaya çalıştığımızda aklımıza geldi. Prosedüre başlamak için, üç saatten fazla olmamak üzere dört santigrat derecede saklanan 50 mililitrelik temiz bir ilk sabah idrar örneği alın. Numuneyi iki kez ters çevirin ve ardından numuneyi iki adet 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne bölün.Numuneyi dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 850 kez G'de santrifüjleyin. Daha sonra, her tüp için, süpernatantın üst kısmının 10 mililitresini iki beş mililitrelik tüpe aktarın ve peletin üzerinde en az iki mililitre süpernatan bırakın. Peletleri atın ve süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın.Gerektiğinde ek idrar örnekleri için bu işlemi tekrarlayın. DNA saflaştırmasına başlamak için, her örnek için bir idrar süpernatantı alikotu çözülür. Çözülmüş numuneyi vorteksleyin ve tüpü iki kez ters çevirin.Numunenin bir mililitresini beş mililitrelik bir tüpe koyun ve geri kalanını eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üreticinin talimatlarına göre idrar örnekleri için uygun bir DNA saflaştırma kiti hazırlayın. Numuneye 100 mikrolitre proteinaz K ve bir mililitre lizis tamponu ekleyin ve bir pipetle iyice karıştırın.Numuneyi 56 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, yıkama tamponlarını bir döndürme sütununda hazırlayın. İnkübasyondan sonra, numunenin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin ve ardından bir mililitre mutlak etanol ekleyin ve pipetleyerek iyice karıştırın.Numunenin 650 mikrolitresini kolona aktarın. Bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin. Toplama tüpünü değiştirin ve numunenin tamamı kolona yüklenene kadar bu işlemi tekrarlayın.Daha sonra ilk yıkama tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve sütunu bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin. Toplama tüpünü değiştirin, ikinci yıkama tamponundan 500 mikrolitre ekleyin ve sütunu üç dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Kolonu temiz bir toplama tüpüne yerleştirin ve kalan yıkama tamponunu çıkarmak için üç dakika daha maksimum hızda santrifüjleyin.Kolonu temiz bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kolona 50 mikrolitre elüsyon tamponu yükleyin ve tamponun yedi dakika boyunca kolona girmesine izin verin. Daha sonra sütunu bir dakika boyunca 6000 kez G'de santrifüjleyin.Elüatı tekrar kolona pipetleyin ve idrar hücresi içermeyen DNA'yı elde etmek için kolonu bir dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin. Standartları hazırlamaya başlamak için, önce bir saflaştırma kiti kullanarak DNA'yı uygun bir hücre hattından izole edin. Hücre hattındaki saflaştırılmış her idrar örneğinden alınan DNA'yı, kit üreticisinin talimatlarına göre bir spektrofotometre ile ölçün.UCF DNA'yı mikrolitre başına bir nanograma seyreltin ve seyreltilmiş numuneleri bütünlük testi için hazır olana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Farklı konsantrasyonlarda altı, 100 mikrolitre standartları oluşturmak için hücre hattı DNA'sını seyreltin. Standartları eksi 20 santigrat derecede saklayın.DNA bütünlük testine başlamak için UCF DNA örneklerini, standartları, uygun PCR primerlerini ve yeşil süper karışımı buz üzerinde çözün. Ardından 72 kuyulu rotor disk plakasını şerit tüplerle ayarlayın. İki, 10 mikrolitrelik standart alikot yerleştirin ve ardından her numuneyi kuyucuklara yerleştirin.Negatif kontroller olarak 10 mikrolitre RNaz içermeyen iki kuyu hazırlayın. Doldurulmuş her kuyu için, her bir astardan bir mikrolitre, 12,5 mikrolitre yeşil süper karışım ve 6,5 mikrolitre RNaz içermeyen su karışımı hazırlayın. Doldurulmuş her bir kuyucuğa 15 mikrolitre karışım aktarın ve ardından kuyucukları 72 oyuklu bir rotor diskine aktarın.PCR'yi üreticinin spesifikasyonlarına göre gerçek zamanlı bir cihazla gerçekleştirin. Cihaz yazılımını kullanarak, herhangi bir kopyanın bir veya daha fazla döngü eşiği değeri farkına sahip olup olmadığını kontrol edin. Bu numuneleri analizden atın ve kalan numuneler için medyan döngü eşiğini değerlendirin.PCR ürün özgüllüğünü değerlendirmek için medyan döngü eşiği değeri 36 veya daha düşük olan her numune üzerinde erime analizi yapın. Ardından, her aplikon için mikrolitre başına nanogram cinsinden bir konsantrasyon belirlemek için standart eğriyi kullanın. İdrar hücresi serbest DNA izole edildi ve solid tümörlerde artmış DNA kopya sayısı gösteren dört bölgede DNA bütünlüğü değerlendirildi.Her bir numunedeki DNA miktarının bütünlük testi için yeterli olduğunu doğrulamak için bir kontrol dizisi de değerlendirildi. Her gen için toplam serbest DNA konsantrasyonu ve varyasyon katsayıları hesaplandı. Bu yöntem mesane kanserini saptamak için %73 duyarlılık ve %84 özgüllük gösterirken, prostat kanseri için sadece %58 duyarlılık ve %44 özgüllük göstermektedir.Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa bir iş günü içinde yapılabilir. Bu prosedürü takiben, ilgilenilen genlerin kopya sayısı indükleyicisi gibi ek soruları yanıtlamak için dijital PCR veya yeni nesil dizileme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hücresiz DNA'yı idrardan çok basit bir şekilde nasıl izole edeceğinizi ve gerçek zamanlı PCR yaklaşımlarını kullanarak belirli ilgi alanlarının bütünlüğünü nasıl inceleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

cell-free-dna-integrity-analysis-in-urine-samples

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Sunulan tanısal FL-DNA kiti kolorektal kanser lezyonlarının varlığı güvenilir olasılığını belirlemek için zaman kazandıran ve kullanıcı dostu bir yöntemdir.

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Burada 8-OXO-7, 8-dihydro-2'-deoknguanozin (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1, n6-dAdo) ve 1,n2-lezyonların hassas ve doğru ölçülmesini yöntemleri açıklanmaktadır etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) DNA 'da. Yöntemler, ortam ince partikül maddenin (PM2,5) dokularda (akciğer, karaciğer ve böbrek) maruz kalan A/J fareler üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi için uygulanmıştır.

Kütle spektrometresi ile üç DNA lezyonlarının ölçülmesi ve ortam Ince partikül madde maruz fareler dokularda düzeylerinin değerlendirilmesi

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Kuyruklu yıldız tahlili, DNA hasarını tespit etmenin popüler bir yoludur. Bu çalışma, kuyruklu yıldız testinin temsili varyantlarında slaytları çalıştırmaya yönelik bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, numune sayısını önemli ölçüde artırırken, tahlil çalışma süresini, slayt manipülasyonlarının sayısını ve jellere zarar verme riskini azalttı.

Hücresel DNA Hasarını Değerlendirmek için Yüksek Verimli Bir Kuyruklu Yıldız Testi Yaklaşımı

Sıvı biyopsi, onkoloji translasyonel çalışmalarına yaklaşımımızda devrim yarattı ve örnek toplama, kalite ve depolama, başarılı klinik uygulaması için çok önemli adımlardı. Burada, çoğu translasyonel araştırma laboratuvarında uygulanabilecek aşağı akış dolaşımsız DNA uygulamaları için standartlaştırılmış ve doğrulanmış bir protokolü açıklıyoruz.

Aşağı Akış Dolaşımsız DNA Uygulamaları için Standartlaştırılmış Bir Sıvı Biyopsi Preanalitik Protokolü

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Öğrenin, idrar örneklerinde hücre-free DNA bütünlüğünü analiz ederek mesane ve prostat kanserlerinin erken teşhisini nasıl gerçekleştireceğinizi. Bu invaziv olmayan yöntem, ürolojik onkoloji araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Daha fazla video keşfet