Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Bu tekniğin genel amacı, hücre biyolojisi uygulamaları için hassas yüzey mikroskobu teknikleriyle uyumlu, desteklenen bir lipid çift tabakasında bir dizi protein nano kümesi üretmektir. Bu yöntem, hücre biyofiziği alanındaki temel soruların, özellikle de ligandların nano kümelenmesinin T hücresi aktivasyonunu ve adezyonunu nasıl etkilediğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, standart biyofiziksel laboratuvarda kolayca tekrarlanabilir olması ve TIRF ve RICM gibi gelişmiş yüzeye duyarlı mikroskopi tekniği ile uyumlu olmasıdır.

Bu teknik, immünoloji hakkında bilgi sağlamak için tasarlanmış olsa da, hücre biyolojisi, onkoloji ve doku mühendisliğinde potansiyel uygulamaları olan diğer hücre tiplerine uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, cam kapak slaytlarını ve gözlem odalarını metin protokolünde belirtildiği gibi temizleyin. Ardından, 70 mikrolitre% 2 silika boncuk süspansiyonunu 15 derecelik bir eğimde tutulan bir kapak sürgüsüne damla damla bırakın.

Süspansiyonlar kururken camı bir dakika boyunca her 15 saniyede bir 90 derece çevirin. Sıkıca paketlenmiş bir tek katmanlı boncuk oluşturmak ve çok katmanlı ve yağ kümelerinin oluşumunu önlemek çok önemlidir. Bu nedenle, damla çözeltisinin konsantrasyonu ve hacminin yanı sıra lamın hidrofilikliğinin de optimize edilmesi gerekir.

Sıvı buharlaştıktan sonra, slaytı bir radyo frekansı magnatron püskürtme cihazının içinde, bir alüminyum silikon hedeften 105 milimetre uzakta bulunan döner bir masaya yerleştirin. Bundan sonra, biriktirme odasındaki basıncı negatif dördüncü paskal'a 2,6 kat 10'a düşürmek için bir turbo-moleküler pompa kullanın. Dakikada 10 standart santimetreküp akı ve 0.8 paskal basınç ile saf bir argon atmosferi tanıtın.

Ardından, radyo frekansı güç jeneratörünü açın. Plazma stabilize edildikten sonra, hedef yüzeydeki olası kirleri gidermek için deklanşörü kapalı tutarken iki dakika boyunca püskürtün. Deklanşörü açın ve slayt üzerinde 200 nanometre kalınlığında bir alüminyum tabakası bırakmak için püskürtmenin 60 dakika devam etmesine izin verin.

Sonra argon akışını kesin. Turbo moleküler pompayı biriktirme odasından izole etmek için sürgülü vanayı kapatın. Bundan sonra, ortam basıncına ulaşmak için hazneyi temiz nitrojenle havalandırın.

Alüminyum kaplı sürgüyü hazneden kurtarın. Geri kazanılan slaytı oda sıcaklığında ultra saf suya daldırın ve 30 saniye boyunca 50 watt ve 50 hertz'de ultra sonikat yapın. Ardından, bir desikatörün altına 0,5 militer APTES yatırın.

Cam slaytı seramik bir ızgara üzerine yerleştirin. Izgarayı desikatöre yerleştirin. Kurutucuyu bir membran pompasına bağlayın.

Ardından, düşük bir vakum oluşturmak için pompayı 30 dakika boyunca maksimum güçte çalıştırın. Desikatörün valfini kapatın ve pompayı kapatın. Bir saat boyunca 50 santigrat dereceye ısıtın.

Bundan sonra, kurutucuyu açın ve slaydı toplayın. Toplanan slaydı bir PTFE desteğine yerleştirin. PBS'de çözünmüş mililitre biyotin başına 2 mililitre 25 mikrogram biriktirin.

Slaytın oda sıcaklığında 30 dakika dinlenmesine izin verin. Daha sonra PBS ile 10 kez durulayın. Slaytı, gece boyunca oda sıcaklığında bir sodyum hidroksit ve PBS çözeltisi içinde inkübe edin.

Bundan sonra, slaytı 10 kez ultra saf suyla durulayın. Langmuir oluğunu temizledikten sonra, PTFE tepsileri oluğun PTFE muhafazasına yerleştirin. Ardından ultra saf suyla doldurun.

Ölçülen basıncı metre başına sıfır milinewton'a ayarlayın. Gaz geçirmez bir cam metal şırınga kullanarak, su yüzeyinde milimetre başına 1 miligram 30 mikrolitre DOPC ve kloroform çözeltisi biriktirin. Lipid tek tabakasını sıkıştırmak için istenen metre başına 27 milinewton basınca ulaşılana kadar PTFE bariyerini kapatın.

Daha sonra, motorlu bir kelepçe kullanarak, hazırlanan cam sürgüyü PTFE muhafazasına batırın. Sürgüyü cl'de tutunamp hava-su arayüzüne dik olarak. Metre başına 27 milinewtonluk sabit bir basıncı korurken, sürgüyü arayüzden dakikada 15 milimetre hızında kaldırın.

Ardından, cam sürgüyü bir PTFE tepsinin üzerindeki su yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Ardından, metal cımbız kullanarak sürgüyü PTFE tepsisine doğru itin ve ultra saf suya batırın. Slaytı içeren PTFE tepsisini ultra saf suyla dolu bir kristalleştiriciye aktarmak için cımbızı kullanın.

Kaplanmış slaytı su altında bir gözlem odasına aktarın. Bundan sonra, içinde yaklaşık 1 mililitre su sıkıştığından emin olarak hazneyi kapatın. Diğer bir hassas adım, numune odasının su altında monte edilmesidir.

Ve biriken çift katmanların havası ile temastan kesinlikle kaçınılmalıdır, bu nedenle bunu sağlamak için büyük miktarda su kullanın ve tüm montaj işleminin su altında gerçekleşebilmesini sağlayın. Monte edilmiş hazneyi sudan çıkarın, haznenin su geçirmez olduğundan ve sızıntı olmadığından emin olmak için kontrol edin. 500 mikrolitre PBS ekleyin, ardından hazneden 500 mikrolitre sıvıyı çıkarın.

Haznedeki bir mililitre ultra saf suyu PBS ile tamamen değiştirmek için bu işlemi 10 kez tekrarlayın. Daha sonra, gözlem odasına mililitre sığır serum albümini başına 100 mikrogram ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Bundan sonra, hazneden 10 kez 500 mikrolitre çıkarıp ekleyerek iki tabakayı durulayın. Ardından, ligandlarla işlevselleştirin, hücreleri biriktirin ve metin protokolünde belirtildiği gibi proteolipidik nanopatern ve SLB akışkanlığını gözlemleyin. Bu protokolde, alüminyumun kontrollü bir şekilde biriktirilmesiyle ikincil bir metal maske oluşturmak için bir boncuk maskesi kullanılır.

Daha sonra boncuk maskesi çıkarılır ve geriye delikli bir alüminyum tabakası kalır. Daha sonra, APTES adı verilen bir organo-amino silin, buhar fazında biriktirilir, ardından sulu fazda BSA-Biotin biriktirilir. Daha sonra, nanometrik protein yamaları ortaya çıkaran alüminyum çıkarılır.

Son olarak, noktalar arası boşluk, desteklenen bir lipit çift tabakası ile geri doldurulur. Daha sonra nano noktaların ve desteklenen lipid çift tabakasının epifloresan görüntüleri alınır. Bileşik bir görüntü, protein noktalarının etrafında benzersiz bir şekilde biriken lipit çift tabakası ile mükemmel tamamlayıcılık gösterir, ancak üzerlerinde değil.

Yeni birikmiş desteklenen bir lipid çift tabakasının epifloresan görüntüsünde, protein noktaları parlak bir lipit denizinde koyu lekeler olarak görünür. Bununla birlikte, 50 saniye boyunca sürekli foto ağartmadan sonra, görüntü, alan diyaframı ile sınırlanan bölgenin içinde lipitlerin hareketli olduğunu gösteren bir hale gösterir. Alan diyaframının kenarı boyunca ortalama yoğunluk profilinin analizi ve bu yoğunluğun ağartma işlemi sırasında zamanla azalması, difüzyon sabitinin saniyede beş mikrometre kare olduğunu ortaya koymaktadır.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde iki günde yapılabilir. Alüminyum biriktirme sırasında çok temiz koşulları korumak ve biriktirme eğrisini dikkatli bir şekilde kalibre etmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, desenli slayt daha da işlevsel hale getirilebilir.

Örneğin, çift tabakaya başka bir biyomolekül ekleyerek. Bunu, T hücresi aktivasyonunu incelemek için antijen bitki yiyen hücreleri taklit etmek için kullanıyoruz. Bu nedenle, geliştirilmesinden sonra, bu teknik farklı kitlelerin ilgisini çekmelidir.

Örneğin, doku mühendisleri bunu yapay dokular yetiştirmek için iskele olarak kullanmak isteyebilir ve onkologlar bunu kanser hücrelerinin eklenmesi hakkında temel sorular sormak için bir platform olarak kullanabilirler. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmiş bir mikroskopi tekniği ile uyumlu, desteklenen lipid çift tabakasında bir protein nano kümeleri alanının nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bunu T hücrelerini incelemek için kullanırken, bu substratın, kontrollü patern proteolipidik membran ile her türlü hücrenin etkileşimini incelemek için tercih edilen platform olma potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz.