Name: Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Öğrenin, desteklenmiş lipit iki tabakalı protein nano küme dizileri oluşturma yöntemini. Bu teknik, T hücre aktivasyonu ve adezyonunu incelemek için TIRF ve RICM mikroskobisiyle uyumludur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz hücresel uygulamalar hakkında verimli tartışmalar devam için Laurent Limozin Pierre Dillard ve Astrid Wahl teşekkür ederim. Ayrıca SEM gözlemleri ile yaptığı yardım için PLANETE temiz oda tesisinden Frederic Bedu teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen hibe sayılı 307.104 FP / 2007-2013 / ERC yoluyla Avrupa Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi.

1. Temizleme Kapaklı-slaytlar ve Gözlem Odaları <ol><li> Politetrafloroetilen (PTFE) gibi bir inert malzemeden yapılmış bir çok slaytlı tepsi üzerinde cam kapak-slaytlar düzenlemek. </li><li> bir yüzey aktif madde çözeltisi içinde slaytlar ile tepsi ve gözlem odasına (uygun olan kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen herhangi bir ürünü) daldırın. </li><li> (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde bir ultrasonik banyo, ultra ses dalgalarına maruz bırakın kullanılması. </li><li> ultra-saf su ile 5 kez (18.2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm) ile durulayın. </li><li> (20 ve 30 ° C arasında), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yüzey aktif madde çözeltisi içinde ultra ses dalgalarına maruz. </li><li> ultra saf su ile 10 kez durulayın. </li><li> Tekrarlayın iki kez 1.5 ve 1.6 adımları tekrarlayın. </li><li> en fazla bir hafta süresince oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) su içinde depolanmalıdır. </li></ol> Protein Nano nokta 2. Fabrikasyon <ol><li> boncuk birikmesi <ol><li> deposit 15 derecelik bir eğim ile tutulan (170 um kalınlığı 24 x 24 mm), silis boncuklar (% 2 v / v, 70 uL), bir kapak sürgü üzerinde damla damla süspansiyon. </li><li> 90 °, her 15 saniye ile cam saygısız Süspansiyon yaklaşık 1 dakika boyunca yayılmıştır olsun. </li><li> Sıvı ortam koşulları altında buharlaşmasına izin verin. </li><li> 2 güne kadar çevre koşullarında temiz bir cam ya da PTFE bölmesi içinde depolayın. </li></ol></li><li> Alüminyum birikmesi <ol><li> Bir alüminyum (% 99) ila yaklaşık 105 mm arasında bir mesafede döner bir masaya (RF) magnetron püskürtme ekipmanı 8, bir radyo frekansı içindeki slaytları (bölüm 2.1&#39;de elde edilmiş) yerleştirin: silikon (% 1) hedefi. </li><li> Bir turbo moleküler pompası kullanılarak 2.6 x 10 -4 Pa birikim bölmesinin aşağı pompa. Bu adım, olası gaz kirliliklerin uzaklaştırılması için önemlidir. </li><li> 0.8 Pa (6.6 mTorr) bir basınçta, 10 sccm&#39;lik bir akı ile saf argon atmosferi (5 N,% 99.999) tanıtılması. <br/&gt; Not: Gelen argon akışı bir kütle akış kontrol cihazı tarafından kontrol edilir ve süreç basınç bir manometre kullanılarak izlenir. Argon gazı akışı süreklidir ve giriş ve çıkış açıklığı valf arasında bir denge tarafından kontrol edilir. </li><li> RF güç jeneratörü açın. Not: Burada, 13.56 MHz frekansında 400-600 W radyofrekans gücü tipik bir aralık kullanılmıştır. RF jeneratörü kapasitif plazma birleştirme modunda bir denkleştirme ağı ile birlikte kullanılır. Yansıyan güç izlenir ve ağ adaptasyonu kullanılarak en aza indirilmiştir. </li><li> Plazma stabilize edildikten sonra, 2 dakika hedefinin yüzeyi olası yabancı maddelerin ayrılması için kapalı bir kapak tutmak için püskürtmeyle çökeltilmesi. </li><li> deklanşör açın ve 60 dakika 200 nm kalınlığında bir cam slayt alüminyum yatırmak için püskürtme devam etmesini sağlar. </li><li> Argon akışını kesme biriktirme odasından turbomolekuler pompa izole etmek için vanayı kapatın ve temiz n bölmesinin havalandırılmasıitrogen oda basıncı elde edildi. alüminyum kaplı slaytlar kurtarma. bir aya kadar çevre şartları altında temiz ve hava geçirmez bir şekilde sızdırmaz kılınmış bir cam ya da PTFE kutusuna, saklayın. </li></ol></li><li> Organosilan buhar biriktirme <ol><li> (20 ve 30 ° C arasında 50 W, 50/60 Hz), bir ultrasonik banyo içinde 30 s n için oda sıcaklığında ve ultra sonikasyon ultra saf su içinde aşama 2.2.6 hazırlanan alüminyum kaplı slayt bırakın. </li><li> bir desikatör altındaki (3-aminopropil) -triethoxysilane (APTES&#39;le) mevduat 0.5 mL. DİKKAT: APTES&#39;le kolayca buharlaşır ve toksik olan bir organosilan, bir. APTES sadece akış başlığı altında ve eldiven ile ele alınmalıdır. </li><li> kurutucunun içindeki bir seramik ızgara ve yerde (2.3.1 hazırlandı), cam slaytlar koyun. </li><li> bir zar pompası Kurutucuyu bağlayın ve 30 dakika düşük bir vakum oluşturmak için en yüksek güçte çalıştırın. </li><li> Kurutucunun vanayı kapatın ve pompayı kapatın. </li><li> desiccator ısıtın1 saat boyunca yaklaşık 50 ° C arasındadır. </li><li> desiccator açın ve slaytlar toplamak. </li><li> Oda sıcaklığında 48 saate kadar (20 ila 30 ° C) depolama için başka bir temiz desikatöre aktarın. </li></ol></li><li> proteinin, birinci tabakanın birikmesi - biyotinle etiketlenmiş sığır serum albümini (BSA-biyotin) <ol><li> PTFE destek üzerinde bölüm 2.3&#39;de hazırlanan slaytlar bir şekilde yerleştirin. </li><li> Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içinde çözülmüş 25 mg / ml BSA-biyotin Deposit 1 ml. Oda sıcaklığında (20 ila 30 ° C) 30 dakika boyunca bırakın. </li><li> PBS ile 10 kez yıkayın. Işık kaynağından uzakta 4 ° C&#39;de 24 saate kadar boyunca örnek saklayın. </li></ol></li><li> alüminyum maske çıkarılması <ol><li> Oda sıcaklığında (20 ° ila 30 ° C) aşırı gece (pH≈12 elde etmek için yaklaşık 100 ml PBS, 1 M NaOH damla damla ilave etmek suretiyle hazırlandı) PBS içinde bir NaOH çözeltisi içinde slaytlar inkübe edin. DİKKAT. NaOH korozif ve eldiven kullanarak ele alınmalıdır. </li><li> DurulamaUltra saf su içinde 10 kat. </li></ol></li></ol> Desteklenen lipid iki katmanlı 3. Çökelme (SLB) <ol><li> Langmuir yalak Temizleme <ol><li> bir pompa kullanılarak Langmuir oluğun PTFE muhafaza içinde su çıkarın. </li><li> kloroform içinde ıslatılmış, havsız dokunmamış tek havlu ile temizleyin. DİKKAT. Kloroform zehirlidir ve (ya da bir akış başlığı altında) bir maske ile ve uygun eldiven, iyi havalandırılan bir manipüle edilebilir olmalıdır. </li><li> ılık ultra-saf su (40 ila 50 ° C) ile temiz 4 kez. </li><li> Soğuk ultra saf su ile temizleyin en az 6 kere. </li></ol></li><li> birinci lipid tabakasının birikmesi <ol><li> Langmuir oluğun PTFE muhafaza PTFE tepsiler yerleştirin ve daha sonra, aşırı saf su ile doldurun. </li><li> 0 mN / m olarak ölçülmüştür basıncını ayarlamak için Langmuir aygıtın kontrol yazılımı. </li><li> (1 mg / ml lipid çözeltisi 30 uL yatırmak 1 gaz geçirmez bir cam / metal şırınga kullanınSu yüzeyinde 2-dioleoil-sn glisero-3-fosfokolin, kloroform (DOPC)). kloroform buharlaşır ve lipit molekülleri kendiliğinden bir tek tabaka oluşturur. </li><li> ulaşıldığında (DOPC 27 mN / m) istenen basınca kadar PTFE bir bariyer kapatarak lipit tek tabaka sıkıştırmak için kontrol yazılımı. </li><li> Motorlu bir kelepçe kullanılarak PTFE mahfaza içine bölüm 2.5.2&#39;de hazırlanan cam slayt daldırma için kontrol yazılımı. </li><li> dikey hava-su ara yüzüne, kelepçe, slayt tutun. / M 27 mN sabit bir basınç muhafaza edilirken, arayüz aracılığıyla yavaş yavaş (15 mm / dak) yükseltmek için kontrol yazılımı. </li><li> Oda sıcaklığında 24 saate kadar (20 ° ila 30 ° C) ya da derhal kullanmak için ya da depolama için, kuru bir ortamda bir yer. </li></ol></li><li> Geriye, ikinci lipit tabakanın birikmesi <ol><li> / M 27 mN istenen değerde Langmuir teknedeki yüzey basıncını muhafaza edin. kullanarak sıkıştırınLangmuir aparat ve / veya kontrol yazılımı arzu edilen basınç elde etmek için bir lipid az miktarda ekleyin. </li><li> yatay olarak su yüzeyinde, bölüm 3.2.6 hazırlanan lipit tek tabaka, taşıyıcı cam slaytlar yerleştirin. Her slayt PTFE tepsinin üstünde yüzen emin olun. </li><li> Aşağı cam slaytlar itin suda batırılır şekilde PTFE ya da metal cımbız kullanarak karşılık gelen PTFE tepsisine bir seferde bir kayar. iterken slaytlar devirme kaçının. </li><li> Ultra saf su slaytlar havaya maruz değildir emin ile dolu bir kristalizöre slaytlar içeren PTFE tepsileri aktarmak için PTFE ya da metal cımbız kullanarak. </li><li> bir gözlem haznesine, bir iki tabakalı kaplama cam slayt sualtı çalışma sırasında, transfer PTFE ya da metal cımbız kullanarak. NOT: gözlem odası kristalleştirici içindeki suyun altına yerleştirilir. gözlem odası özel yapılmış ve bir lastik contası, bir PTFE halka oluşurAlt yüzeyi daha önce lipit çift katman ile kaplanmış bir cam slayt yapılmış olan bir su sızdırmaz bir oda için sualtı monte edilebilir d çelik kılıfı. </li><li> Su altında çalışmaya devam ve suyun yaklaşık 1 ml bölmesi içinde tutulur sağlarken bölmeyi kapatın. </li><li> Su dışında monte odası al. su geçirmez ve kaçak serbest olduğundan emin olun. </li><li> ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak PBS ile bir gözlem odasına ultra saf suyun bir 1 mL değiştirin. kamara sıvısının asla yoksun olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> SLB engelleme adımı <ol><li> Bölüm 3.3.6 hazırlanan slayt içeren bir gözlem odasına sığır serum albümini, 100 ug / mL (BSA) tanıtılması ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) inkübe edilir. </li><li> çıkarılması ve PBS 10 kez 500 uL eklenmesiyle çift katman durulayın. iki tabakalı 4 ° C &#39;de 24 saat muhafaza edilebilir. </li></ol></li></ol> Ligantlar içeren 4. işlevselleştirilmesi <ol><li> 20 ve 30 ° arasında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bölüm 3.4.2&#39;de hazırlanan slayt (ihtiva haznesine 2 ug / mL&#39;de floresan veya floresan olmayan nötravidin (NAV, avidinin Deglikosile versiyonu pH 7 dolu değildir) ekleyin C). </li><li> ekleme ve PBS 10 kez 500 uL kaldırarak durulayın. </li><li> Bölüm 3.4.2&#39;de hazırlanan slayt içeren hazneye 2 ug / mL biyotinlenmiş anti-CD3 ekleyin. SLB ve noktaların çift işlevselleştirilmesi için (burada, iki tabakalı nitrilotriasetik asit (NTA), lipidlerin +% 1 DOPC yapılmıştır) 5 ug / mL, Fc-ICAM-1, His-etiketi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (20 ° ila 30 ° C) bekletin. </li><li> 10 kez ilave edilmesi ve 500 ul PBS kaldırarak durulayın </li><li> 10 kez ilave edilmesi ve hücre ortamının 500 uL kaldırarak hücre ortamıyla PBS (PBS +% 0.1 BSA) değiştirin. </li><li> CHAMBE hücre ortamının 200 mcL bırakınslayt r. </li><li> hücreler ilave edilmeden önce 37 ° C &#39;de 10 dakika süre ile odasına yerleştirin. </li></ol> 5. Hücre Birikimi (ayrıntılar için referans 7) <ol><li> Dikkatlice hazneye hücre süspansiyonunun 400 uL yatırmak. 37 ° C&#39;de 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakılır. </li><li> 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca paraformaldehit% 2 (PFA) ile hücreyi saptamak. sürekli çıkarma ve PBS 500 uL PBS ile PFA değiştirin. </li></ol> 6. Gözlem <ol><li> Proteo-lipit Nano desen ve SLB akışkanlığı <ol><li> BS TFT 506 + 582 + 659;, EM TBP 526 + 601, örneğin, burada EX TBP 483 + 564 + 642 (uygun aydınlatma dalga boyu (639 nm) ve filtre küpleri kullanarak görüntü epi-floresan modunda protein deseni, bir floresans mikroskobu kullanarak 688). Not: sinyalin yoğunluğu içinde ve nokta dışında protein miktarını tahmin etmek için ölçülebilir. uygun bir aydınlatma dalga boyu (330 nm) ve f kullanınResme ilter küp karanlık deliklere sahip aydınlık görünen iki tabakalı (BP 365/12, FT 395, LP 397). </li><li> Çift-katlı izleyici lipidlerin difüzyon katsayısına ölçmek için sürekli verilmedi ağartma (CPB) tekniği 13, 15 kullanın. Bu gözlem, tercihen sadece SLB birikimi sonra yapılır. Not: Difüzyon sabit ölçmek için, iki parametre KPB işlemi sırasında ölçülür: boya (gergin) ve ağartılmış alanı (tauD) etrafında oluşan halo floresan profilinin bozunma uzunluğunun belirli bir ağartma süresi. İlk KPB işlemi sırasında yanar alanın merkezinde floresan yoğunluğunun zaman evrim çizilmesi ile elde edilir. İkinci (kararlı durum ulaşıldıktan sonra 12 satır ve 5. görüntülerin ortalaması) aydınlatılan bölgenin kenarında yoğunluk profili çizilmesi ile elde edilir. eğriler, sarsıntısız ve tauD elde etmek üzere monte edilmiştir. difüzyon sabiti ta verilirUd 2 / gergin (D = <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th edition, Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cell+Receptor-Proximal+Signals+Are+Sustained+in+Peripheral+Microclusters+and+Terminated+in+the+Central+Supramolecular+Activation+Cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster.</a> Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).</li>
<li>Kaizuka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+segregating+T+cell+receptor+and+adhesion+molecules+during+immunological+synapse+formation+in+Jurkat+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse.</a> Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunological+Synapse%3A+A+Molecular+Machine+Controlling+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation.</a> Science. 285, 221-228 (1999).</li>
<li>Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-mediated+friction+determines+morphodynamics+of+spreading+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells.</a> Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+viral+antigen+processing+generates+peptide-specific+MHC+class+I+cell-surface+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-Tunable+Organic+Nanodot+Arrays%3A+A+Versatile+Platform+for+Manipulating+and+Imaging+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells.</a> Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).</li>
<li>Deeg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+activation+is+determined+by+the+number+of+presented+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">T cell activation is determined by the number of presented antigens.</a> Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).</li>
<li>Delcassian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+ligand+spacing+influences+receptor+triggering+in+T+cells+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells.</a> Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).</li>
<li>Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+and+efficient+T+cell+activation+with+stimulatory+aCD3+nanoarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays.</a> Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).</li>
<li>Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-clustering+of+ligands+on+surrogate+antigen+presenting+cells+modulates+T+cell+membrane+adhesion+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization.</a> Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).</li>
<li>Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometric+protein-patch+arrays+on+glass+and+polydimethylsiloxane+for+cell+adhesion+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+lett%22%5BJournal%5D)">Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies.</a> Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).</li>
<li>Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+and+intermembrane+distance%3A+case+study+of+avidin+and+E-cadherin+mediated+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion.</a> Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).</li>
<li>Sengupta, K., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la026146o">Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid.</a> Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).</li>
<li>Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independently+controlling+protein+dot+size+and+spacing+in+particle+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography.</a> Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).</li>
<li>Massou, S., et al. <a target="_blank" href="http://adsabs.harvard.edu/abs/2009ApSS..256..395M">Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates.</a> Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).</li>
<li>Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+in+adhesion+cluster+formation+during+initial+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion.</a> Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).</li>
<li>Arnold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cell+polarization+and+migration+by+a+gradient+of+nanoscale+variations+in+adhesive+ligand+spacing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing.</a> Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+spreading+and+focal+adhesion+dynamics+are+regulated+by+spacing+of+integrin+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands.</a> Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Schvartzman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolithographic+Control+of+the+Spatial+Organization+of+Cellular+Adhesion+Receptors+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level.</a> Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).</li>
<li>Mossman, K., Groves, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+supported+membranes+as+tools+for+quantitative+studies+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.Soc.Rev%22%5BJournal%5D)">Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse.</a> Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).</li>
<li>Furlan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+CD45+both+positively+and+negatively+regulates+T+cell+receptor+phosphorylation+in+reconstituted+membrane+protein+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters.</a> J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).</li>
<li>Hsu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand+mobility+modulates+immunological+synapse+formation+and+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation.</a> PloS One. 7 (2), e32398(2012).</li>
<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen protokol içindeki kritik adım desteklenen bir lipit çift katman protein nano nokta veya noktalar çevresindeki alan arka-dolgu oluşumu ile ilişkilidir. Protein nano nokta ile ilgili olarak, ilk kritik bir adım boncuk maske hazırlanmasıdır. kapak slayt temizleme kritiktir. Slaytlar, ya da oksijen plazma ile kuartz küvetler temizlenmesi için önerilen bir deterjan çözeltisi ile temizlenmesi gerekir. etanol ya da izo-propanol tedavisinde daldırma gibi diğer temizleme teknikleri yeterince hidrofilik cam ...

<html> Hücre yapışması, hücre dışı matris üzerinde veya başka bir hücre üzerinde kendi meslektaşı bağlanabilen olan hücre zarı üzerinde mevcut olan özel hücre yapışma molekülleri (CAMlar) proteinleri aracılığıyla gerçekleşir. Yapışan hücreler üzerinde, her yerde integrin ve cadherin dahil olmak üzere en yapışma molekülleri, kümelerin 1 şeklinde bulunurlar. Antijen sunan hücreler ile T lenfositler (T hücreleri) etkileşmesi (APC) iki hücre arasındaki ara yüzeyde oluşan reseptör kümelerinin önemi özellikle çarpıcı bir örnek teşkil etmektedir - genellikle bir immünolojik sinaps adı. CSMAC (daha büyük bir orta moleküllü bir küme oluşturmak için platformlar 2, 3, 4 sinyal olarak görev yapar ve en sonunda merkezi T hücresi formu mikron çaplı kümelerinin yüzeye APC T hücre reseptörleri (TCR&#39;ler) ile ilk temas oluşturan üzerine )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Son zamanlarda, bu APC tarafında gösterilmiştir, TCR&#39;nin ligandların da 8 kümelenir. APC ilgili protein ile fonksiyonel bir yapay yüzeyi tarafından taklit edilir T hücre-APC etkileşiminin, hibrid sistem dağıtım, bağlamında, sinaptik arayüzü 2, 3, 4, 5, 6, 7 anlaşılmasını büyük olan . Bu bağlamda, hedef hücrenin bir veya daha fazla yönlerini yakalamak APC mimetik yüzeyleri tasarlamak için son derece önemlidir. ligandlar desteklenen lipid çift tabakaları aşılanmış Örneğin, bunlar, çift-katlı düzleminde difüze APC yüzeyi üzerinde durumu taklit ve aynı zamanda oluşmasına izin verebilircSMAC 6, 7. Benzer bir şekilde, APC üzerinde kümeleri polimerler 9, 10, 11, 12, 13, 14 bir denizde ligandların yaratırlar tarafından taklit edilmiştir. Ancak, bu iki özellik şu ana kadar kombine edilmemiştir. Burada difüzyon lipidler ile bir lipit çift katmanı ile çevrelenir, anti-CD3 (TCR kompleksinin hedefleyen bir antikor) nano-noktaları oluşturmak için yeni bir teknik açıklanmaktadır. Iki tabakalı Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer tekniği 7, 15, 16 kullanılarak yatırılır ve eğer arzu edilirse, belirli bir protein ile işlevselleştirilebilir - örneğin, T hücresi integrin ligandı (ICAM1 olarak adlandırılır). Buna ek olarak, anti-CD3 protein noktalar could başka bir antikor ya da CAM ile değiştirilebilir. T hücre yapışma çalışmaları için platform olarak ileride kullanılmak üzere proteinler seçilmiş olmakla birlikte, burada açıklanan bir strateji herhangi bir protein ve hatta DNA için uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>Cam lameller</td><td>Yardımcı, Karl Hecht KG&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gözlem odası</td><td>Ev yapımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkali yüzey aktif madde konsantresi (Hellmanex)</td> <td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicator</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kristalleştirici&nbsp;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nötravidin</td><td>Termo Fischer Bilimi</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Su MQ&nbsp;</td><td>ELGA, Veolia Fransa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silika boncuk</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansil-PE</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>Gaz geçirmez şırınga&nbsp;</td><td>Dominique Dustcher , Fransa</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Film dengesi</td><td>NIMA</td><td>Orta Mikroskop</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss, Almanya</td><td>TIRF-III sistemi</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Hedef&nbsp;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Radyo Frekansı Magnetron püskürtme Sistemi ve egrave; ben&nbsp;</td>ALCATEL, Fransa <td></td><td></td><td>tarafından modifiye edilmiş SMC 600 aracı</td></tr></tbody></table>

bir desteklenen lipit iki tabakalı içinde ligand nano küme diziler

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Şu anda hücre biyolojik çalışmalar için pasifize yüzeyinin denizinde yapışkan proteini adaların sıralı dizi oluşturulurken önemli bir ilgi vardır. Geçmiş yıllarda, bu canlı hücreler kendilerine sunulan moleküllerin biyokimyasal doğaya hem de bu moleküller sunulmaktadır yolu değil, tepki giderek daha açık hale gelmiştir. Birçok biyoloji laboratuvarlarında artık standart nedenle protein mikro desenleri olan oluşturma; Nano-desenler de daha erişilebilir. Bununla birlikte, hücre-hücre etkileşimleri bağlamında, desene bir ihtiyaç sadece proteinleri değil, aynı zamanda, lipid ikili tabakaları vardır. Böyle ikili proteo-lipit desenleme şimdiye kadar kolayca erişilebilir olmamıştır. Biz cam üzerinde desteklenen bir protein nano nokta oluşturmak ve desteklenen bir lipit çift katman (SLB) ile arası nokta alanı doldurmak için genellikle bir yöntem önermektir, basit bir teknik sunar. izleyici foto-ağartma itibaren floresan lipidleri SLB dahil, biz iki tabakalı in-pl hatırı sayılır gösterdiğini kanıtlarane akışkanlığı. floresan gruplarla protein noktalar fonksiyonlandırmak görüntünün onları ve düzenli bir altıgen kafes içinde sıralanır olduğunu göstermek için bize izin verir. Tipik nokta boyutu yaklaşık 800 nm&#39;dir ve burada gösterilen aralık 2 mikrondur. Bu alt-tabakalar, hücre yapışması, göç ve mekano-algılama çalışmaları için yararlı platformlar hizmet etmesi beklenmektedir.

Fluoresans görüntüleri noktaların aralık ve boyutunu ölçmek için analiz edilmiştir. Tipik aralık olduğu bulunmuştur 1,900 ± 80 nm ve tipik nokta boyutu 600 ± 100 nm (Şekil 1 g) idi. aralık maskesi için kullanılan boncuk boyutuna göre ayarlanır. nokta boyutlu boncuk büyüklüğü gibi kaplama koşulları tarafından belirlenir. SLB SLB görüntüleme kanalı görülen delikler ve NAV görüntüleme kanal görülen noktalar arasındaki tam tamamlayıcılık ile onlara benzersiz protein noktalar...

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Bu tekniğin genel amacı, hücre biyolojisi uygulamaları için hassas yüzey mikroskopisi teknikleriyle uyumlu olan, desteklenmiş bir lipid çift tabakası içinde protein nano-kümeleri dizisi oluşturmaktır. Bu yöntem, hücre biyofiziği alanındaki temel soruların, özellikle ligandların nano-kümelenmesinin T hücresi aktivasyonu ve adezyonunu nasıl etkilediğinin yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, standart biyofizik laboratuvarlarında kolayca tekrarlanabilir olması ve TIRF ile RICM gibi gelişmiş yüzey hassasiyetli mikroskopisi teknikleriyle uyumlu olmasıdır.Bu teknik immünoloji hakkında bilgi sağlamak için tasarlanmış olsa da, hücre biyolojisi, onkoloji ve doku mühendisliğinde potansiyel uygulama alanlarına sahip diğer hücre tiplerine de uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde cam lamelleri ve gözlem odacıklarını temizleyin. Ardından, 15 derecelik bir eğimle tutulan bir lamel üzerine %2'lik silika boncuk süspansiyonundan 70 µL'yi damla damla damlatın.Süspansiyon kururken camı bir dakika boyunca her 15 saniyede bir 90 derece çevirin. Boncuklardan sıkıca paketlenmiş bir tek katman oluşturmak ve çoklu katmanların ve yağ kümele

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Çekirdeklerinde kendi kendine birleşmiş nanoyapılar içeren lipid parçacıklarının kinetik stabilizasyonu için karbon nanotüplerin akıllı bir uygulamasını rapor ediyoruz. Lipid parçacıklarının hazırlanması, ilaç dağıtımı gibi biyomedikal uygulamalarda kullanımlarına izin veren oldukça düşük konsantrasyonlarda karbon nanotüpler gerektirir.

Karbon Nanotüpler tarafından Stabilize İçeriden Kendinden monte Lipid Parçacıklar uyduruk hazırlanması

Bir depolanabilir, taşınabilir lipit iki katmanlı oluşum sistemi göstermektedir. Dondurulmuş bir membran ön-madde çevre sıcaklığına getirildiğinde bir lipid iki-tabakalı zar üzerinden% 80 başarı oranı ile 1 saat içinde oluşturulabilmektedir. Bu sistem iyon kanalları ile ilişkili zahmetli süreçler ve uzmanlık azaltacaktır.

Bir polidimetilsiloksan İnce Film Kullanarak Otomatik çift katlı lipid Membran Oluşumu

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu protokol, dev unilamellar lipid vezikülleri ile birlikte kayan kinesin motilitesini kullanarak lipid nanotüp ağlarının üretilmesi için bir süreci açıklamaktadır.

Kayan Kinesin Motilite Testi Kullanılarak Çok Bileşenli Lipid Nanotüp Ağlarının Üretilmesi

Biz bakır ile lipid bilayer doping tarafından su / hava arayüzü bir hibrid lipid membran üretmek için bir protokol rapor (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthayanilocne (CuPc) molekülleri. Ortaya çıkan hibrid lipid membran lipid/CuPc/lipid sandviç yapısına sahiptir. Bu protokol diğer fonksiyonel nanomalzemelerin oluşumuna da uygulanabilir.

Su/Hava Arabiriminde Hidrofobik Organik Moleküllerle Doped Hibrid Lipid Membranların Kendi Kendine Montajı

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Burada, yapay lipid membranlarda yüksek uzay-zamansal hassasiyetle ışık regüle edilmiş ve geri dönüşümlü protein modelleri oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, mavi ışık altında ortak proteini Nano'ya (vahşi tip SspB) bağlanan model zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilen protein iLID'in (geliştirilmiş ışıkla indüklenebilir dimer) lokalize fotoaktivasyonundan oluşur.

Model Membranlarda Dinamik Işık Kaynaklı Protein Modelleri

Öğrenin, desteklenmiş lipit iki tabakalı protein nano küme dizileri oluşturma yöntemini. Bu teknik, T hücre aktivasyonu ve adezyonunu incelemek için TIRF ve RICM mikroskobisiyle uyumludur.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Daha fazla video keşfet