Name: Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Öğrenin fare ve insan birincil NK hücrelerinde dextran destekli lentiviral gen aktarımı yöntemini. Bu teknik immünoterapi araştırmalarında genetik modifikasyon verimliliğini artırır ve sitotoksik fonksiyonları korur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lucia Sammarco ve onun Lulu'nun limonata standı ilham, motivasyon ve destek için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen NIH R01 AI102893 ve ncı R01 CA179363 (S.M.) tarafından desteklenmiştir; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Vakfı (S.M.); HRHM Program MACC Fonu (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Aile Vakfı (S.M.); Gardetto ailesi (S.M.); Hyundai bilim adamları (M.S.T.) programı; Hyundai umut gezici (S.R.); MACC Fonu (M.S.T. ve S.M.); Çocuk Araştırma Enstitüsü, MCW (S.R.); ve Kathy Duffey Fogerty Ödülü (M.J.R.).

Tüm hayvan iletişim kuralları insani ve ahlaki muamele-in hayvan takip ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tıbbi College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI Biyomedikal Araştırma Merkezi (BRC) içinde tarafından kabul edildi. İnsan periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) kullanımı kurumsal inceleme Kurulu (IRB) kan Merkezi Wisconsin, Milwaukee, WI kan Araştırma Enstitüsü tarafından kabul edildi.
1. fare, hücre satırları ve vektörel çizimler
<ol><li>C57BL/6 fareler ticari satıcıları tarafından elde etmek. Patojen-Alerjik koşulları fare kolonilerde korumak ve 6 ve 12 hafta yaş arası kadın ve erkek fare kullanın. De-tanımlanan insan PBMCs IRB tarafından onaylanan kaynaklardan elde edilir.</li>
	<li>% 20-30 v/v isoflurane propilen glikol fareler anestezi için (1, 2-propanediol, USP sınıf) karışımı hayvanlarla anestezi. Fareler anestezi altında iken kuruluğu önlemek için gözlerinin veteriner merhem uygulamak.</li>
	<li>Hayvanlara ötenazi için anestezi indüksiyon sonra servikal çıkığı gerçekleştirin.<ol>
<li>Fareler Bankası kuyruk tek elle sıkıca kavra tarafından dizginlemek. Sağlam sopa-tipi kalem veya başparmak ve ilk parmak boyunda, arkası karşı diğer el kafatası tabanında yer.</li>
		<li>Çıkık üretmek için el baş hayvan iletmek ve kuyruk temel tutan el ile geriye dönük kablolarıylaberaber bastır frenleyici itin. Servikal doku ayrılması için duygu tarafından çıkığı etkinliğini doğrulamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Odası/kafes en az 5 min için hayvanları koruyup onları sadece solunum aktivite yoktur veya algılanabilir bir kalp atışı eksikliği olduğunda kaldırmak.</li>
	<li>K562 ve yas-1 hücreleri ticari satıcıları tarafından elde etmek ve RPMI1640 içinde proje % 10 içeren orta ısı FBS inaktive. Düzenli olarak Mikoplazma bulaşma olasılığını dışlamak için bu hücre hatları test.</li>
</ol>2. hazırlık ve titrasyon lentiviral vektörlerin
<ol><li>Kültür 5 × 106 293T hücreleri bir çözüm olarak RPMI1640 orta %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, ile 20 mL % %5 7.5 sodyum bikarbonat çözüm ve % 0.001 içeren bir T75 cm2 şişeye gecede Β-mercaptoethanol. %5.2 CO2ile infüzyon 37 ° C kuluçka şişeye koyun.</li>
	<li>Tripsin (0.025%)/EDTA (1 mM) fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS). kullanarak 293T hücre hasat Tripsin/EDTA 5 mL PBS içinde ekleyin ve Şişeler 10 dk 37 ° C'de T75 cm2 şişe 293T hücrelerden dekolmanı izin vermek için bir kuluçka için kuluçkaya.<ol>
<li>Müstakil hücreleri toplamak ve iki kez tripsin tüm izlerini kaldırmak için PBS ve EDTA içinde yıkayın. Bir hemasitometre içeren hücreleri saymak ve mL başına bir milyon hücre hücre sayıya ayarlayabilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PsPAX2 3.95 µg, pMD2G 1.32 µg ve pLEP-GFP-Puro (in-house BRI oluşturulan EF1alpha organizatörü pWPI pLenti CMV-GFP-Puro bir CMV organizatörü yerine gelen klonlama tarafından) 5,26 µg 293T hücreleri18 transfect19.<ol>
<li>1 mL 150 mm NaCl artı 0.6 mg/mL polyethylenimine 63 µL hazırlamak (PEI; 25.000 kD, doğrusal). İyice karıştırın ve sonra plazmid ekleyip karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya ve hücrelere ekleyin.</li>
		<li>16 h sonrası transfection, eski yerine koymak ile taze orta transfection orta artı 4.5 mM sodyum bütrat. Virüs 48 saat sonrası transfection içeren süpernatant hasat ve 5000 × g de gecede Santrifüjü tarafından konsantre. Malzemeler tabloya bakın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seri dilutions gerçekleştirerek 293T hücreleri kullanarak viral titreleri belirlemek ve Akış Sitometresi 72 h sonrası iletim20tarafından tahlil. Viral titreleri ölçmek için bir tedbir olarak yeşil flüoresan protein (GFP) deyimi kullanın.</li>
</ol>3. arıtma ve fare birincil NK hücreleri genişlemesi
<ol><li>Fare birincil NK hücreleri21arındırmak. Kısaca, tek hücreli dalak süspansiyonlar B hücreleri ve makrofajlar oluşan yapisan nüfus tüketmek için naylon yün sütunların üzerinden geçmek.</li>
	<li>1000 U/mL İnterlökin (Il) RPMI1640 orta -2 ile %10 FBS, 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 1 mM sodyum pyruvate, % %5 7.5 sodyum bikarbonat ile fare NK hücreleri içeren naylon yün sütundan yapışık olmayan nüfus eluted kültür çözüm ve % 0.001 β-mercaptoethanol (RPMI1640 tam orta).</li>
	<li>Orta şişeler olmayan-yapışık T ve NKT hücreleri kaldırmak için bu kültür gün 4 değiştirin; Şişeler için yapıştırılan kalan büyük ölçüde NK hücreleri hücrelerdir. Taze RPMI1640 tam orta ve 1000 U/mL şişe doldurmak için IL-2 20 mL ekleyin.</li>
	<li>Hazırlıklar CD3 fazla % 95 ile kullanarak NK hücre özgü işaretleri20 günde 7 Akış Sitometresi tarafından fare NK hücre kültürleri saflığı kontrol-NK1.1+ nüfus.</li>
</ol>4. arıtma ve insan birincil NK hücreleri genişlemesi
<ol><li>PBMCs yoğunluk gradient sağlıklı insan gönüllü buffy kat üzerinden tarafından izole et. Kısaca, dikkatli bir şekilde yarı-(HBSS ile) seyreltilmiş hücre yoğunluğu geçişin bir 50 mL kurallı tüp üzerinde 15 mL 35 mL katman. Vasıl 400 × g için sallanan bir kova Open End fren olmadan 20 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Antikor tabanlı ticari negatif seçim kitleri üreticinin protokolüne göre insan birincil NK hücreleri arındırmak için kullanın.</li>
	<li>Yalıtım, NK hücre hazırlıklar saflığı ayirt analizleri tarafından belirler. NK hücre hazırlıkları 20 dk. yıkama 2 µg/mL anti-CD3 ve 4 ° C'de 2 µg/mL anti-CD56 antikorlar ile hücreleri ile iki kez PBS NK hücre popülasyonlarının CD3 yokluğu ve CD56 varlığı hücre yüzeyinde tarafından belirlenen leke.</li>
	<li>4 ° C'de 20 dk antikorlar ile hücre hazırlıkları kuluçkaya, PBS ile yıkayın ve bir Akış Sitometresi analiz. NK hücre hazırlıklar kullanmak ile % 85'den fazla gen iletim için saflık20deneyleri.</li>
</ol>5. lentivirus ile fare ve insan birincil NK hücreleri iletim
<ol><li>Fare veya insan birincil NK hücreleri bir 24-şey plaka 0,5 × 105/mL orta GFP lentivirus enfeksiyonu (MOI) 5, 10 ve 20 çokluğu süpernatant huzurunda ve Pb varlığında, askıya alma (8 µg/mL), PS (8 µg/mL) veya dextran (8 µg/mL).</li>
	<li>60 dk 1000 × g de tabak santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant decanting olmadan kültür hücreleri gecede (16-18 h) %5.2 ile infüzyon 37 ° C kuluçka CO2.
</li>
	<li>Yıkama PBS ile 10 mL ve tam RPMI1640 kültür orta IL-2 huzurunda 2 ml resuspend (300 U/mL).</li>
	<li>İnsan test ve fare birincil NK Hücre-aracılı sitotoksisite karşı K562 ve yas-1, sırasıyla 51Krom (Cr) gerçekleştirerek-yayın deneyleri, çeşitli efektör için hedef hücre oranları22.<ol>
<li>Kısaca, bir milyon hedef hücreleri 50 µCi radiolabeled sodyum kromat 51Cr ver. 4-h kuluçka sırada, onlar alımı 51Cr hücresel proteinler içine. İnkübasyon sonunda herhangi bir unincorporated etiketi kaldırmak için hücreleri yıkayın.</li>
		<li>51Cr mutlak, spontan ve deneysel sürümü hedef hücrelerden miktarına göre belirli tümör hücre lizis hesaplayın. Not: Pentaplicate deneyler üzerinden belirli lizis yüzdesi hesaplama yapıldı aşağıdaki denklemi kullanarak: % belirli lizis = ((51Cr ortalama deneysel açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın) / (Cr51demek maksimal açıklaması - 51Cr ortalama spontan yayın)) nerede "51Cr ortalama spontan yayın" 51yokluğunda NK hücreleri, hedef hücrelerden serbest Cr ve "51Cr ortalama maksimal yayın" 51Cr х 100, hedef hücre lizis üzerine 2 N hidroklorik asit (HCl) tarafından serbest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transduced NK hücreleri gün 7 şişe hafifçe dokunarak hasat.<ol>
<li>Plaka bağlı anti-NKG2D (A10) mAb titre konsantrasyonları ile hasat hücreleri gecede anti-NKG2D mAb 2,5 µg/mL konsantrasyonları ile 96-de, yüksek oranda protein-emici polistren levha kaplama tarafından aktif hale getirin.</li>
		<li>Her yıkama PBS 100 µL üç kez önce birincil NK hücreleri ilavesi ile iyi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitokinler IFN γ gibi ölçmek için 16 ve 18 s etkinleştirme sonrası arasında bir çok kanallı pipet kullanarak kültür supernatants toplamak. Standart eğrileri enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kitleri ile sağlanan rekombinant sitokinler kullanarak oluşturun.</li>
	<li>Annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) Boyama23 kullanarak NK hücre canlılığı test ve Akış Sitometresi kullanarak dönüştürülmüş NK hücreleri arasında nekrotik hücre yüzde belirlemek.<ol>
<li>Bu tahlil gerçekleştirmek için fare ve insan NK hücreleri iletim sonra dört gün hasat iki kez 10 mL 500 × g 5 min için de soğuk PBS ile yıkayın ve bir Annexin-V (PE) kuluçkaya / 7-AAD kiti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verileri çözümlemek için uygun Akış Sitometresi yazılımını kullanın. Canlı hücre nüfus seçin ve viral iletim24bir ölçüsü olarak GFP (FITC kanal) ifade analiz.</li>
</ol>

<ol><li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+despite+immunosurveillance%3A+immunoselection+and+immunosubversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).</li>
<li>Arina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+liaisons+of+natural+killer+lymphocytes+in+immunology+and+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).</li>
<li>Manilay, J. O., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+their+role+in+graft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and their role in graft rejection.</a> Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).</li>
<li>Raulet, D. H., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Self-tolerance of natural killer cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).</li>
<li>Chouaib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+outcome+of+leukemia+by+natural+killer+cell-based+immunotherapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies.</a> Front Immunol. 5, 95(2014).</li>
<li>Dulphy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underground+Adaptation+to+a+Hostile+Environment%3A+Acute+Myeloid+Leukemia+vs.+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, 94(2016).</li>
<li>Tran, J., Kung, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+mediate+stable+and+efficient+gene+delivery+into+primary+murine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells.</a> Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).</li>
<li>Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+human+natural+killer+cell+line%2C+NKL%2C+using+the+Amaxa+nucleofection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system.</a> J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).</li>
<li>Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+gene+transfer+into+natural+killer+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection.</a> J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).</li>
<li>Becknell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+of+human+natural+killer+cells+with+an+EBV%2Fretroviral+hybrid+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector.</a> J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).</li>
<li>Jiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+regulation+of+phosphoinositide+3-kinase-dependent+NK+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function.</a> J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).</li>
<li>Burshtyn, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+residues+amino-terminal+of+cytoplasmic+tyrosines+contribute+to+the+SHP-1-mediated+inhibitory+function+of+killer+cell+Ig-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors.</a> J. Immunol. 162, 897-902 (1999).</li>
<li>Schroers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+human+T+lymphocytes+and+natural+killer+cells+by+Ad5%2FF35+chimeric+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors.</a> Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).</li>
<li>Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+primary+natural+killer+cells+overcomes+inhibitory+signals+and+induces+specific+killing+of+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells.</a> Blood. 106, 376-383 (2005).</li>
<li>Denning, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+transductional+efficiency+of+lentiviral+vectors%3A+effect+of+sera+and+polycations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations.</a> Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).</li>
<li>Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+gene+transduction+and+expansion+of+human+T+lymphocytes+for+clinical+immunogene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PLoS. ONE. 4, e6529(2009).</li>
<li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+Fyn-ADAP+via+the+Carma1-Bcl-10-MAP3K7+signalosome+exclusively+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells.</a> Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li>
<li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-%7Bbeta%7D-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li>
<li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).</li>
<li>Toyoshima, K., Vogt, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+and+inhibition+of+avian+sarcoma+viruses+by+polycations+and+polyanions%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions.</a> Virology. 38, 414-426 (1969).</li>
<li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bi-specific+CD3+x+NCAM+antibody%3A+a+model+to+preactivate+T+cells+prior+to+tumour+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir maddi çıkar çatışması iddia.

Katyonik polimer Ajan fare ve insan birincil NK hücreleri lentiviral iletim verimliliğini artırır gibi bu çalışmada dextran o kullanımını gösterir. Ayrıca, Türkçe veya PS, gibi Katyonik diğer ajanlar insan birincil NK hücreleri viral vektörler teslimini üzerinde fark edilebilir bir etkisi olması. Daha önce Türkçe insan T hücreleri17gen iletim çoğaltmak olabilir kanıtlanmıştır. Bu sonuçlar, ancak, ne Türkçe ne de PS benzer bir verimlilik insan birincil NK hücreleri üzerinde var öneririz. Bu çalışma...

Doğal öldürücü (NK) doğuştan gelen bağışıklık sistemi1büyük lenfositik nüfusu hücrelerdir. NK hücreleri karşı tümörler ve enfeksiyonlar2,3,4ana bilgisayar bağışıklık yanıtının ilk satır savunucuları olarak işlev. NK hücreleri de güçlü sitokinler ve kemokinler5salgılanmasını aracılığıyla tolerans gelişimi merkezi bir rol oynamaktadır. Hedef ve tümör hücreleri ortadan kaldırmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle, donör elde edilen insan NK hücreleri kanser6,7için bir adoptive immünoterapi olarak değerlendirmek için birden fazla klinik çalışmalar yürütülmektedir. Aksine T hücreler, NK hücreleri gelişim biyolojisi henüz iyi karakterize8olmak zorundadır. Bu bilgi kısmen genler ilgi fare veya insan birincil NK hücreleri göndermek verimli teknikleri yokluğu nedeniyle eksikliğidir. Bu nedenlerden dolayı hücre hatları yerine Primer hücre en NK hücre çalışmaları yapılmıştır. Bu nedenle, birincil NK hücreleri genler ilgi ile transduce güvenilir ve etkin bir iletişim kuralı için ihtiyaç çok önemlidir.
Bu çalışmada genel amacı lenti - veya Retrovirüsler birincil insan veya fare NK hücreleri transduced tutarlı ve güvenilir bir yöntem formüle etmek oldu.
Büyük ölçüde birincil NK hücreleri geçici dönüşümü kullanarak bu sorunu çözmeye çalıştığınız önceki çalışmalar yapılmıştır. Bu plazmid transfection9,10, Epstein - Barr virüsü (EBV) içerir / retroviral hibrid vektör11, vaksinia vektörler12,13ve14Ad5/F35 chimeric adenoviral vektörel çizimler. Bu teknikler mütevazı verimliliğini rağmen iletim geçici doğasını onlara genetiği değiştirilmiş NK hücreleri uzun süreli kullanımı için uygun olmayan hale getirir. Bir kaç son yıllarda yapılan çalışmalarda retroviral vektörler NK hücreleri, enfeksiyon gen ifade11,15kabul edilebilir bir düzeyde sağlamak için birden fazla döngüleri gerektiren transduce için kullandık. Retroviral vektörler aksine, lentiviral vektörler konak hücre nükleer alma makine viral öncesi entegrasyonu karmaşık çekirdek translocate için kullanabilirsiniz. Bu virüs birincil NK hücreleri dahil olmayan bölme hücrelerdeki çoğaltma büyük bir sınırlayıcı faktördür.
Farklı hücre yüzey reseptörleri ve viral parçacıkların arasındaki etkileşimler viral alımını hücre içine izin verir. Viral zarf proteinleri ve onların soydaş ana bilgisayar reseptörleri arasındaki ilk nişan bu iki arasında mevcut potansiyel negatif ücretleri nedeniyle sınırlı olabilir. Polybrene (Pb), protamine sülfat (PS) veya dextran, gibi Katyonik polimerler ek hücre yüzey reseptörleri için olumlu bir ücret vermek ve böylece viral zarf bağlama çoğaltmak birçok iletim teknikleri arkasındaki mantığı olduğunu proteinler. Bu hücreler16tarafından füzyon verimlilik ve viral parçacıkların alımını artırır. Her ne kadar Türkçe veya PS gen transferi T hücreleri17artırabilir rapor edildi, bunların uygulama birincil NK hücreleri iletim verimliliği herhangi bir etkisi yoktu. Ayrıca, birincil NK hücreleri kullanarak bu Ayıraçlar arasında karşılaştırmalı bir analiz gerçekleştirilmedi. Bu çalışmada, üç Katyonik polimerler iletim verimliliği karşılaştırıldı. Bu üç Katyonik polimerler arasında sadece dextran önemli fare ve insan birincil NK hücreleri içine etkili viral iletim artırır, sonuçlar gösterir.

<table><tbody><tr><td>Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90-64-91-9</td><td></td></tr><tr><td>polibren (Pb)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>protamin sülfat (PS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>p3369</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ATALANTA</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Corning</td><td>MT25000CI</td><td></td></tr><tr><td>İnterferon gama (IFN -&gama; )</td><td>eBioscience</td><td>14-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>Propidium lodding boyama çözeltisi</td><td>BD</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>PHOENIX</td><td>NDC 57319-559-05</td><td></td></tr><tr><td>NK hücre negatif seçim kiti</td><td>Kök Hücre</td><td>19855</td><td></td></tr><tr><td>Yac-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Fareler</td><td>Jakson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>T75 şişeleri</td><td>Cornnig</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>antikor bazlı negatif seçim kitleri</td><td>Kök Hücre</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>51 Krom (Cr) salım tahlilleri</td><td>perkin elmer'in</td><td>NEZ030'u</td><td></td></tr><tr><td>ELISA kitleri</td><td>Ebioscience</td><td>00-4201-56</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat</td><td>Sigma</td><td>5887-5G</td><td></td></tr><tr><td>Doğrusal polietilenimin</td><td>polibilimleri</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

dextran fare ve insan birincil nk hücreleri lentiviral iletim verimliliğini artırır

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Doğal öldürücü (NK) hücreye belirli genlerin iletim verimli büyük bir mücadele vardı. Başarılı transductions geliştirme, farklılaşma ve NK hücreleri fonksiyon ilgi gen rolü tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Kanserli hastalarda chimeric antijen reseptör (CARs) ile ilgili son gelişmeler eksojen genler efektör lenfositler için teslim etmek etkili bir yöntem ihtiyacını vurgular. Lentiviral-aracılı gen transductions birincil insan veya fare NK hücreleri içine verimliliği önemli kısıtlayıcı bir faktör olduğu önemli ölçüde düşük kalır. Son gelişmeler polybrene gibi Katyonik polimerler kullanılarak geliştirilmiş gen iletim verimliliği T hücreleri gösterir. Ancak, bu ürünlerin NK hücreleri iletim verimliliği artırmak başarısız oldu. Bu iş o dextran dallı glukan polisakkarit gösterir önemli ölçüde iletim insan ve fare birincil NK hücreleri artırır. Bu son derece tekrarlanabilir iletim yöntemi klinik gen teslim uygulamalar ve böylece NK hücre tabanlı kanserli hastalarda. büyük ölçüde artırabilirsiniz insan birincil NK hücreleri transducing için yetkili bir araç sağlar

Dextran birincil insan ve fare NK hücreleri lentiviral vektörü verimli gen transferi neden olmaktadır.
İnsan NK hücreleri izole ve PBMC (bir saflığı % 85'inden fazlası ile) saf ve gecede rIL-2 300 U/mL ile inkübe. Bu birincil NK hücreleri sonra çeşitli ilişkilendirmenin çeşitliliği enfeksiyon, GFP lentivirus ile transduced (MOI; 3, 10 ve 20 IU hücre başına) 8 µg/mL Türkçe, PS veya dextran huzurunda 24-şey tabak içinde. Hücreler içi...

Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Bu protokolün genel amacı, primer doğal öldürücü hücrelerde başarılı gen transdüksiyonuna olanak tanıyan teknolojiler geliştirmektir. Bu yöntem, doğal öldürücü veya NK hücreleri gibi efektör lenfositler üzerinde genetik modifikasyonun etkisi gibi İmmünoterapi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer fare veya insan NK hücrelerinde ilgilenilen bir genin verimli bir şekilde eksprese edilmesidir.Metin protokolüne göre Lentiviral vektörleri hazırlayıp titre ettikten sonra, B hücreleri ve makrofajlardan oluşan yapışkan popülasyonları azaltmak için tek hücreli dalak süspansiyonlarını naylon yün kolonlardan geçirerek fare primer NK hücrelerini saflaştırın. NK hücrelerini içeren yapışmayan popülasyonu kültüre etmek için RPMI1640 tam besiyerinde mililitre başına 1,000 ünite İnterlökin-2 kullanın. Kültürün dördüncü gününde, yapışmayan T ve NKT hücrelerini uzaklaştırmak için besiyerini 20 mililitre RPMI1640 tam besiyeri ve mililitre başına 1,000 ünite IL-2 ile değiştirin.Yedinci günde, %95'ten fazla CD3 negatif ve NK1.1 pozitif popülasyona sahip preparatlar kullanarak, murine NK hücrelerinin saflığını akış sitometrisi ile MK hücreye özgü

dextran-enhances-lentiviral-transduction-efficiency-murine-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz plazmid DNA hücresinin olgunlaşması neden olmaksızın veya siRNA birincil insan monosit türevli dendritik hücreler transfecting etkin bir yolu olarak optimize edilmiş yüksek verimli nucleofection protokol sunuyoruz. Biz daha başarılı bir şekilde hedef gen, mRNA ve protein seviyeleri hem de Rig-I siRNA susturulması için kanıt sağlar.

Hücre olgunlaşması olmadan Dendritik Hücreler Verimli Transfeksiyon için optimize edilmiş Protokolü

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Lentiviruses genin fonksiyonu keşfetmek için çok değerli bir araştırma aracı; Ancak, araştırmacılar bilinen pantropic lentivirüs kodlama ya da şüphesi onkogenler üretimi önlemek için isteyebilirsiniz. Alternatif olarak, biz ecotropic reseptör mSlc7a1 ifade etmek için modifiye insan hücreleri üzerinde ecotropic lentivirüs kullanmak için daha güvenli bir protokol mevcut.

Biyogüvenlik Geliştirilmiş Polimer complexed Ecotropic lentivirüs İnsan Hücreleri, İletimi

Bu video, doğal öldürücü (NK) hücrelerde katyonik polimer aracılı viral transdüksiyon için bir testi göstermektedir. Hücreler, bir floresan proteini kodlayan transgenik lentivirüs vektörleri ile inkübe edilir. Katyonik bir polimerin eklenmesi, virüsün hücrelere bağlanmasını ve RNA'sını floresan proteini eksprese ederek konakçı genomuna entegre etmesini sağlar. Floresan, polimerin neden olduğu transdüksiyon artışını değerlendirmek için ölçülür.

Katyonik Polimer Kullanılarak Doğal Öldürücü Hücrelerde Viral Transdüksiyonun Arttırılması

Burada, retroviral transdüksiyon ve tetrasiklin yokluğunda bir lentiviral vektör (IV) bileşenleri ifade edebilen bir hücre çizgisi oluşturmak için concatemeric transfeksiyon kullanın. Bu AG GFP kodlar ve dendritik hücreler üzerinde reseptörü için spesifik olan bir glikoprotein, SVGmu ile pseudotyped edilir.

Bir Tetrasiklin düzenlenmiş Hücre Hattı Özellikle dendritik hücreler Hedef Yüksek titre Lentiviral vektörler üretir

Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Bu protokol, çift negatif timositlerin fare timumundan izolasyonunu, ardından daha fazla fonksiyonel analiz için delta benzeri 4 eksprese eden kemik iliği stromal hücre hattı ko-kültür sisteminde (OP9-DL4) retroviral transdüksiyon ve ko-kültürü tanımlar.

T Hücreli Lösemide Onkogenleri İncelemek için Delta Benzeri 4 Eksprese Eden Stromal Hücreler Üzerinde Murin Timositlerinin Ko-Kültürü ve Transdüksiyonu

Mevcut protokol, hafif sitotoksisiteye sahip CD3-/CD45+CD56+ hücrelerinin, hem 3D hem de 2D kültür koşulları altında insan genişlemiş potansiyel kök hücrelerinden (hEPSC'ler) nasıl ayırt edileceğini göstermektedir. Bu, karmaşık mikro çevrenin tahrip edilmeden rutin fenotipik doğrulamaya izin verir.

İnsan Genişletilmiş Potansiyel Kök Hücrelerden Doğal Öldürücü Hücrelerin Üretilmesi

Periton dokusunda yerleşik makrofajlarda gen fonksiyonunun araştırılması için in vivo, lentiviral vektörler kullanılarak adım adım bir protokol gösteriyoruz.

Farelerde İn Vivo Periton Boşluğu Dokusunda Yerleşik Makrofajların Verimli Gen ve MikroRNA Modülasyonu için Lentiviral Vektör Hazırlığı

Öğrenin fare ve insan birincil NK hücrelerinde dextran destekli lentiviral gen aktarımı yöntemini. Bu teknik immünoterapi araştırmalarında genetik modifikasyon verimliliğini artırır ve sitotoksik fonksiyonları korur.

Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

Daha fazla video keşfet