Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır

Bu protokolün genel amacı, primer doğal öldürücü hücrelerde başarılı gen transdüksiyonuna olanak tanıyan teknolojiler geliştirmektir. Bu yöntem, doğal öldürücü veya NK hücreleri gibi efektör lenfositler üzerinde genetik modifikasyonun etkisi gibi İmmünoterapi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, primer fare veya insan NK hücrelerinde ilgilenilen bir genin verimli bir şekilde eksprese edilmesidir.

Metin protokolüne göre Lentiviral vektörleri hazırlayıp titre ettikten sonra, B hücreleri ve makrofajlardan oluşan yapışkan popülasyonları azaltmak için tek hücreli dalak süspansiyonlarını naylon yün kolonlardan geçirerek fare primer NK hücrelerini saflaştırın. NK hücrelerini içeren yapışmayan popülasyonu kültüre etmek için RPMI1640 tam besiyerinde mililitre başına 1,000 ünite İnterlökin-2 kullanın. Kültürün dördüncü gününde, yapışmayan T ve NKT hücrelerini uzaklaştırmak için besiyerini 20 mililitre RPMI1640 tam besiyeri ve mililitre başına 1,000 ünite IL-2 ile değiştirin.

Yedinci günde, %95'ten fazla CD3 negatif ve NK1.1 pozitif popülasyona sahip preparatlar kullanarak, murine NK hücrelerinin saflığını akış sitometrisi ile MK hücreye özgü markörler yardımıyla kontrol edin. Periferik kan mononükleer hücrelerini veya PBMC'leri izole etmek için, yarı oranında seyreltilmiş 35 mililitre hücreyi 50 mililitrelik konik bir tüp içindeki 15 mililitrelik yoğunluk gradyanının üzerine dikkatlice katmanlar halinde ekleyin. Gradyanı, salınımlı kova rotorunda 400 ×g ve 20 °C'de 30 dakika boyunca frenleme yapmadan santrifüj edin.

Metin protokolüne göre insan primer NK hücreleri saflaştırıldıktan sonra, mililitre başına iki mikrogram anti-CD3 ve mililitre başına iki mikrogram anti-CD56 antikorları ekleyerek hücrelerin saflığını belirleyin. Hücreleri 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. Hücreleri iki kez yıkamak için PBS kullanın.

Ardından, hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin. NK hücre popülasyonu, hücre yüzeyinde CD56 için pozitif ve CD3 için negatif olacaktır. Fare veya insan primer NK hücrelerini, 24 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, mililitre başına 0,5 x 10⁵ hücre olacak şekilde, 5, 10 ve 20 NLY değerlerinde GFP Lentivirüs süpernatantı ile birlikte süspande edin.

Ardından polybrene, protamin sülfat veya dekstran varlığında, plakları 1,000 ×g'de 60 dakika boyunca santrifüj edin. Sonrasında, süpernatantı uzaklaştırmadan hücreleri %5,2 karbondioksit içeren 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca kültüre edin.

Hücreler 10 mililitre PBS ile yıkandıktan sonra, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için IL-2 içeren iki mililitre RPMI1640 medyumunu kullanın. Hücreleri toplamanızdan bir gün önce, 96 kuyucuklu yüksek protein absorpsiyonlu polistiren plakaları mililitre başına 2,5 mikrogram anti-MKG2D monoklonal antikorları ile kaplayın ve plakaları oda sıcaklığında veya buzdolabında gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, her kuyucuğu üç kez yıkamak için 100 µL PBS kullanın. Önce plaklara nazikçe vurarak transdükte edilmiş NK hücrelerini toplayın, ardından 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 100 µL hücre ekleyin. Aktivasyondan 16 ila 18 saat sonra, süpernatantları toplamak için çok kanallı bir pipet kullanın.

Ardından, bir ELISA kitinden elde edilen rekombinant sitokinle bir standart eğrisi oluşturun ve süpernatanttaki İnterferon Gamma gibi sitokinleri nicel olarak belirleyin. NK hücre canlılığını test etmek için, transduksiyondan dört gün sonra, hücreleri iki kez 10 milliliters soğuk PBS ile yıkayın. Sonrasında, hücreleri toplayın ve onları boyamak için XM5 7-aminoactinomycin D kullanın.

Transforme edilmiş NK hücreleri arasındaki nekrotik hücre yüzdesini belirlemek için akış sitometrisi kullanın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Bu şekil, rekombinant IL-2 ile inkübe edilen ve ardından GFP Lentivirus ile transduse edilen insan NK hücrelerinin, polibrene veya protamin sülfat eklemesine kıyasla, kültüre dekstran eklendiğinde daha yüksek bir transdüksiyon verimliliğine ulaştığını ve viral titreyi artırdığını göstermektedir. Burada görüldüğü üzere, fare NK hücrelerinde de benzer sonuçlar gözlemlenmiş; polibrene veya protamin sülfata kıyasla dekstranın, Lentiviral vektörlerin verimliliğini artırdığı kanıtlanmıştır.

Bu deneyde, transdükte edilmiş primer NK hücrelerinin sitotoksik kapasitesi, hedef hücreler olarak K562 ve YAC-1'e karşı bir CR-salınım testi ile incelenmiştir. NK hücrelerinin dekstran ile transdüksiyonu, transforme edilmiş NK hücrelerinin öldürme potansiyelini transdükte edilmemiş NK hücrelerine kıyasla olumsuz yönde değiştirmez. Burada, transdükte edilmiş insan primer NK hücreleri 24 saat boyunca K562 ile birlikte kültürlenmiş ve İnterferon Gama'yı ölçmek için süpernatanlar toplanmıştır.

Sonuçlar, dekstranın transdüksiyona uğramış NK hücrelerinin sitokin üretme yeteneği üzerinde hiçbir etkisinin olmadığını göstermektedir. Ayrıca, bağımsız bir doğrulama, plakla bağlanmış anti-NKG2DA10 monoklonal antikorlarla aktive edilen dekstran işlemine tabi NK hücrelerinin hala Interferon Gamma sitokini üretebildiğini göstermiştir. Bu prosedürü uygularken, transdüksiyona uğramış hücrelerin santrifüj edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu prosedürü takiben, gen iletimini nasıl geliştirebileceğiniz gibi ek soruları yanıtlamak için transfeksiyon gibi diğer yöntemler derinlemesine uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, İmmünoloji alanındaki araştırmacıların NK hücrelerinde gen manipülasyonunu keşfetmelerinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, NK hücrelerinin nasıl transdüse edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.