Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Bu prosedürün genel amacı, entegre olmayan epizomal vektörler kullanarak yetişkin insan periferik kan mononükleer hücrelerinden iPS hücreleri üretmektir. Bu protokol, hastalık izleme, ilaç taraması ve düzenli radyo tıbbı için iPS hücreleri üretmek isteyen kök hücre alanındaki bilim adamlarına yardımcı olabilir. Yeniden programlama protokolümüz çok basit, ancak son derece verimlidir.

Bu prosedürü takiben, kan hücresi yeniden programlama tekniğine kolayca hakim olunabilir. Başarılı bir yeniden programlama için plazmanın kalitesi de aynı derecede önemlidir. Kirleticiler yeniden programlama verimliliğini azaltabilir, bu nedenle epizomal plazmitleri saflaştırmak için Endofree kitlerinin kullanılmasını öneririz.

iPS hücreleri diğer hücrelere göre daha kırılgandır. Gen geçişi sırasında birden fazla hücre hazırlamak, özellikle erken geçişlerde büyük hücre ölümlerine neden olabilir. Bu prosedüre başlamak için, gerekli tüm kültür ortamını beraberindeki el yazmasına göre hazırlayın.

Daha sonra 10 mL taze PB numunesi ve on mL PBS tamponunu 50 mL'lik bir tüpte birleştirin ve iyice karıştırın. Kullanmadan önce PBS'yi oda sıcaklığına veya 37 santigrat dereceye getirin. Daha sonra, tüpün dibine 10 mL ficoll ekleyin.

Ficoll tabakasının PB ile karışmamasını sağlamak için bu işlem yavaş yavaş yapılmalıdır. Karışımı 400 x g'da düşük hızlanma ve yavaşlama ile 30 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, PB ÇUŞ'lar, PB plazması ile ficoll arasında bulunan beyaz tabakadadır. Devetüyü ficoll tabakasını bozmadan 10 mL PB plazmasını yavaşça aspire edin.

Daha sonra beyaz tabakayı dikkatlice 50 mL'lik yeni bir tüpe koyun. Beyaz tabakadan toplanan hücrelerin toplam hacmi yaklaşık üç ila altı mL olmalıdır. Bundan sonra, toplam hacmi 30 mL'ye getirmek için PBS ekleyin ve iyice karıştırın.

Daha sonra numuneyi on dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. On dakika sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 20 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. İyice karıştırın ve trombositlerin çoğunu çıkarmak için numuneyi 400 x g'da beş dakika

Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini bir ila iki mL IMDM'de yeniden süspanse edin. Hücreler hemen kültür için kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Kriyoprezervasyon için eşit miktarda kriyoprezervasyon ortamı ekleyin.

Hücreleri kriyoviyallere ayırın ve hemen 80 santigrat derece dondurucuya aktarın. Bu prosedürde, 15 mL'lik bir tüpte beş mL IMDM ortamı hazırlayın. Donmuş PB ÇUŞ'ları IMDM ortamı ile tüpe aktarmadan önce 37 santigrat derece su banyosunda hızla çözün.

Numuneyi 400 x g'da beş ila on dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini eritroid ortamda yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri bir hemositometre kullanarak mikroskop altında sayın.

Daha sonra, doku dışı bir kültürde kültür PB ÇUŞ'ları,% 5 Karbon Dioksit, nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede oyuk başına iki mL ortam ile muamele edilmiş altı oyuklu plaka. Bir gün üç ve beşinci gün, ortamı değiştirmeden her bir oyuğa doğrudan bir mL taze eritroid ortamı ekleyin. Altıncı günde, çekirdeklenme için PB ÇUŞ'ları hasat edin.

Nükleofeksiyondan bir gün önce, doku kültürü, 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.1 jelatin ile muamele edilmiş altı kuyucuklu plakayı ön kaplamaya tabi tutun. İnaktive edilmiş MEF besleyici hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda çözün ve hemen beş mL MEF ortamı içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Daha sonra, beş dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.

Daha sonra jelatini altı oyuklu plakadan çıkarın ve hücre peletini MEF ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, inaktive edilmiş MEF hücrelerini, önceden işlenmiş altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda iki mL MEF ortamında tohumlayın ve bunları %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin. Nükleofeksiyon gününde, MEF ortamını aspire edin ve bir mL eritroid ortamı ile değiştirin.

Daha sonra kültür plakasını %5 karbondioksitli nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede 10-30 dakika önceden dengeleyin. 1.5 mL steril bir tüpte Sox2'ye iki mikrogram PEV OCT4, bir mikrogram PEV MYC, bir mikrogram PEV KLF4 ve 0.5 mikrogram PEV Bcl-XL ekleyin. Kontaminasyonu önlemek için tüpü 50 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve ardından oda sıcaklığına soğutun.

Daha sonra numuneye 57 mikrolitre nükleofeksiyon tamponu ve 13 mikrolitre ek tampon ekleyin. Yedi dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme ile beş mL'lik bir tüpe altıncı kültürlenmiş PBMNC'lere iki kez on hasat edin. Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve plazmit ve nükleofeksiyon tampon karışımını hücre peletine ekleyin.

Daha sonra tüpü parmağınızla hafifçe vurarak iyice karıştırın. Daha sonra, hücre süspansiyonundaki DNA'yı kit tarafından sağlanan küvete aktarın ve küveti kapatın. Nükleofeksiyon cihazında U-008 programını seçin.

Ardından, küveti tutucuya yerleştirin ve Tamam'a basın. Daha sonra küveti tutucudan çıkarın. Her küvete 0.5-1 mL önceden ısıtılmış eritroid ortamı ekleyin ve hücreleri hemen önceden dengelenmiş MEF plakasına aktarın. Bazı örnekler için, bir mil kandan binlerce koloni elde edebilirsiniz.

Daha fazla kültür için tek bir koloni seçmek isterseniz, sadece 1 milyon hücre ile fazladan bir tane daha tohumlamanız gerekebilir. Hipoksi odasını inkübatöre yerleştirmeden hemen önce, kültür kuyucuklarında hücrelerin eşit bir şekilde dağılmasını sağlamak için odayı birkaç kez hafifçe sallayın. Ardından plakayı bir hipoksi odasına aktarın.

Hazneyi dakikada 20 Litre hızında bir ila iki dakika boyunca karışık bir gazla yıkayın. Daha sonra, hazneyi kapatın ve numuneyi 37 santigrat derecede kültürleyin. Nükleofeksiyondan sonraki ikinci günde, her bir oyuğa doğrudan iki mL iPSC ortamı ekleyin.

Nükleofeksiyondan sonraki dördüncü günde, üç mL ortamı çıkarın ve iki mL taze iPSC ortamı ekleyin. Bu aşamada, canlı hücrelerin çoğu besleyici katmana bağlanmıştır. Nükleofeksiyondan sonraki altıncı günden sonra, 500 mikrolitre kullanılmış ortam bırakarak ve 14-18. günlere kadar 0.25 milimolar sodyum bütirat ile desteklenmiş iki mL taze E8 ortamı ekleyerek ortamı iki günde bir değiştirin.

Burada periferik kan hücrelerinin yeniden programlanması için protokolün bir şeması gösterilmiştir. Bu görüntü, kasede duran AP'yi gösteriyor ve bu, PB ÇUŞ'ların nükleofeksiyonundan sonraki 14. günde tipik bir ESC benzeri iPSC kolonisini gösteriyor. Burada, TRA-1-60 veya SSEA4'ü ifade eden beşinci pasajdaki iPSC'lerin temsili FACS diyagramları verilmiştir.

İşte NANOG ve OCT4 eksprese eden iPSC kolonilerinin temsili konfokal görüntüleri. Buradaki görüntüler, üç mikrop katmanını da içeren terratoma H&E boyamasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen iPS hücrelerinin nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bir kez ustalaştıktan sonra, üç hafta içinde büyük miktarlarda iPS hücresi üretilebilir, bu nedenle uygulamalı zaman üç saatten az olacaktır. Verimli kan hücresi yeniden programlaması için basit, epizomal bir vektör sistemi geliştirdik. Bu uygun fiyatlı sistemin, özellikle sınırlı kaynaklara sahip küçük laboratuvarlarda kolayca benimsenebileceğine inanıyoruz.

İnsan kanı ve plazması ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.