Organ Kültür ve Fare Wolffian Kanallarının Tüm Dağı Immunoflorasan Boyama

Bu organ kültürünün ve tüm montaj immünofloresan yönteminin genel amacı, Wolffian indüksiyon sarma ve geliştirme sürecini daha iyi görselleştirmek ve anlamaktır. Bu yöntem, gelişim biyolojisi alanındaki organ şeklinin, yapısının ve işlevinin gelişiminde rol oynayan mekanizmalar hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olacaktır. Bu tekniğin başlıca avantajları, in vivo sistemleri taklit etmesi ve niş faktörlerden yoksun hücre kültürü çalışmalarına göre daha doğru bilgi sağlamasıdır.

Gebe kaldıktan sonraki 15. gün öğleden önce, hamile bir fareyi emici kağıt mendil üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve karnın ventral tarafına% 70 etanol püskürtün. Forseps kullanarak, hayvanın ventral tarafındaki alt karın derisini kaldırın ve ürogenital açıklıktan göğüs kafesine uzanan yanal bir kesi yapmak için cerrahi makas kullanın. İdrar kesesini rahim ağzının hemen üzerindeki forseps ile kavrayın ve rahim içine bir kesi yapın.

İdrar kesesini tutarak, uterusu paratenigal bağlantıdan ayırmak için uterus geniş ligamentine ve utero tubal bileşkeye bir kesi yapın. Uterusu buz gibi soğuk HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve fazla kanı çıkarmak için dokuyu hafifçe çalkalayın. Durulanmış uterusu buz üzerinde taze buz soğuk HBSS içeren bir Petri kabına aktarın ve embriyoları çıkarmak için uterus duvarını kesin ve hasat edilirken buz üzerinde taze HBSS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirin.

Yeni bir tabakta etanolle ıslatılmış steril bir kağıt mendil parçasına yan tarafında bir embriyo yerleştirin. Ve hayvanın alt karnı boyunca çapraz bir kesi yapmak için steril bir bıçak kullanın. Embriyoyu vertebral kolon boyunca steril bir sünger tabanına sabitleyin ve embriyoyu diseksiyon stereo mikroskobu altında hareket ettirin.

Ventral orta hat boyunca dikkatlice kesin ve karaciğeri ve bağırsakları çıkarın. Ürogenital sistem artık görünür olmalıdır. Vas deferens'te bir kesi yapın, üretral ekini kapatın.

Ardından bir kesi yapıldı: testisleri ve Wolffian kanallarını toplamak için Wolffian kanalının alt kısmının gubernakuluma bağlanması düşünüldü. Dokular toplanırken buz üzerinde taze HBSS içeren yeni bir Petri kabına yerleştirilmesi. Embriyonik gonadal sırtları kültürlemek için, önce 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasına oyuk başına 300 mikrolitre ortam ekleyin.

Daha sonra, yeni bir Petri kabına küçük bir damla steril HBSS ekleyin ve parlak yüzeyi HBSS'ye bakacak şekilde damlanın üzerine 0,8 mikrometrelik bir polikarbonat parça aşındırma membranı yerleştirin. Zarın pürüzlü tarafı yukarı bakacak şekilde dokuyu nemli tutmak için zarı her zaman HBSS damlasının üstüne yerleştirin. Temiz forseps kullanarak, dokular birbirine değmeden zarın pürüzlü tarafına iki genital çıkıntı yerleştirin.

Ve fazla HBSS'yi çıkarmak için steril bir mendil kullanın. Genital çıkıntıları zara aktarırken, Wolffian kanallarının kistik büyümesini önlemek için transferden sonra zardaki fazla HBSS'yi çıkarmaya dikkat ederek, forsepsin iki kolu arasından numuneyi alın. Daha sonra, kulak ortamı arayüzünün dokularını 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte kültürlemek için zarı 24 oyuklu plakanın bir oyuğuna yerleştirin ve üç gün boyunca her gün toplam ortam değişikliği yapın.

Kültürün dördüncü gününe gelindiğinde, kıvrılmamış Wolffian kanalları oldukça kıvrımlı tüplere dönüşmüş olacak. Dokuları tüm mount immünofloresan için sabitlemek için, kültürlenmiş gonadlar ve Wolffian kanalları ile zarları buz gibi soğuk PBS içeren yeni Petri kaplarına aktarın. Membranlar PBS üzerinde yüzecektir.

Zarları batırmak için forseps ucunu kullanın. Ve kültürlenmiş gonadal dokuları% 4 paraformaldehite aktarın. Fiksasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında hafifçe sallayarak PBS ve Triton X'te 10 dakikalık üç yıkama ile durulayın.

Daha sonra, dokuları kademeli bir etanol serisinde, her daldırma için dört santigrat derecede ve dakikada 30 dönüşte 10 dakika boyunca kurutun. Numuneleri daldırmalar arasında değiştirmek için, dehidrasyonun son iki dakikasında dokuların yerleşmesine izin verin. Daha sonra dokulara dokunmadan mümkün olduğunca fazla alkolü çıkarın ve bir sonraki yüksek etanol konsantrasyonunu ekleyin.

Son dehidrasyondan sonra, dokuları az önce gösterildiği gibi ters dereceli bir etanol serisinde rehidre edin. Daha sonra mendilleri PBS artı Triton X'te oda sıcaklığında 20 dakika boyunca dört kez yıkayın. Ve her yıkama için dakikada 30 dönüş.

Dokuları oda sıcaklığında bir saat boyunca lekeleme tamponu ile bloke edin, ardından dört santigrat derecede bir gece inkübasyon ve ilgilenilen birincil antikorda dakikada 30 rotasyon yapın. Ertesi gün, dokuları PBS ve yağsız süt tozunda oda sıcaklığında 30 dakika ve her yıkama için dakikada 30 tur boyunca dört kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, dokuları uygun ikincil antikorla oda sıcaklığında bir saat boyunca, yavaşça sallanarak ve ışıktan korunarak etiketleyin.

Ardından mendilleri yalnızca PBS artı ara'da üç kez yıkayın. Ve numuneleri immünofloresan mikroskobu ile analiz edin. Geliştirme sırasında, Wolffian kanalı önemli değişikliklere uğrar, burada basit ve düz bir tüp oldukça karmaşık ve sarmal bir kanala dönüştürülür.

Wolffian kanalı morfogenezinde yer alan moleküler mekanizmaları incelemek için, kültür ortamı, farklı sinyal yollarını hedefleyen inhibitörler ve aktivatörler ile desteklenebilir. Örneğin, bu Wolffian kanalı, bir ila sinyal veren spesifik bir inhibitörün varlığında üç günlük kültürden sonra kıvrılmadan kaldı. Görünüşe göre sarma ile ilgili bir yol.

Wolffian kanallarının tüm montaj immün boyaması, sitokeratin-8'in ekspresyonunu ve PH3 pozitif proliferatif hücrelerin ve üç günlük kültür dokularının varlığını ve ayrıca yeni izole edilmiş 18.5 gün gebe kalma sonrası tüm monte edilmiş dokularda beta katenin ekspresyonunu ortaya çıkarır. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa embriyo başına yaklaşık beş ila 10 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü izleyerek, farmakolojik ajanlar veya hormonlar, bu ajanların belirli gonadal dokular üzerindeki doğrudan etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için kültür organları üzerinde test edilebilir.

Bu işlemi denerken, genital çıkıntıları doğrudan forseps ile kavramamayı unutmamak önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, üreme sisteminin doğuştan anormallikleri ve anomali gelişiminde yer alan mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, gentil sırtların nasıl kültürleneceğini ve tam montajlı immünofloressahnenin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Paraformaldehit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu malzemeyi tutarken her zaman kişisel koruyucu ekipman giyilmesi gerektiğini unutmayın.