Name: Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNAların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Keşfedin B lenfositlerinde antikor sınıf değiştirme ve plazma hücre farklılaşmasını HDAC inhibitörleri ile epigenetik düzenleme yöntemini. Bu teknik immunoloji araştırmalarında gen ifadesi modülasyonunu analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser NIH hibe AI 105813 ve AI 079705 (PC için) tarafından desteklenen, Lupus araştırma hedef tanımlama Lupus Grant ALR 295955 (PC için) için İttifak ve artrit Ulusal Araştırma Vakfı araştırma (HZ) verin. TS desteklenen Pediatri Tıp Merkezi, ikinci Xiangya hastane, Merkezi Güney üniversite, Changsha, Çin, tarafından Xiangya-UT okul tıp San Antonio tıbbi öğrenci ziyaret programı bağlamında.

protokol kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komiteler San Antonio, Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi hayvan bakımı kuralları izler.
 1. CSR, Plazma hücre farklılaşma ve HDI tedavi için fare B hücre stimülasyon <ol><li>dalak hücre süspansiyonlar hazırlanması Not: laminar akış kukuIeta fare hariç tüm adımları uygulayın ötenazi ve diseksiyonu.
	<ol><li>Belirli patojen-Alerjik C57BL/6J fare (8-12 hafta-in yaş) CO 2 inhalasyon tarafından Euthanize.</li>
		<li>Fare yukarı bakacak şekilde karın ile parçalanmış tahta üzerinde yatıyordu. Fare 18'lik, 1.5 - inç Hipodermik iğneler ile tüm dört metrelik pin.</li>
		<li>% 70 etanol bulanmış mendil kullanarak cilt sterilize.</li>
		<li>Autoclaved cerrahi araç (forseps ve diseksiyon makası) sadece dalak (karaciğer hemen altından karın sol tarafında) görselleştirmek için göğüs kafesi altındaki deri yoluyla kesmek için kümesinin kullanın.</li>
		<li>Başka bir steril forseps kullanın ve dalak yavaşça Forseps ile sıkma ve anatomi ile bağlanan tüm doku kapalı kesim tarafından mide daha fazla eğrilik altında yatıyor dalak ayıklamak için makas makas. Bağlantı doku kaldırdığınızdan emin olun.</li>
		<li>Tam RPMI1640 orta 1.000 µL içeren bir 1.5 mL microcentrifuge tüpüne dalak yerleştirin (RPMI 1640 orta takviye ile % 10 ısı inaktive fetal buzağı serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 µg/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin, 0,25 µg/mL Amfoterisin B ve 50 µM β-mercaptoethanol).</li>
		<li>50 mL polipropilen koni santrifüj tüpüne 70 µm hücre süzgeç koyun ve dalak microcentrifuge tüp hücre süzgeç üzerine dökün. 15 mL polipropilen koni santrifüj tüpü ucu hafifçe dalak süzgeç aracılığıyla püre için kullanın. 15-20 mL tam orta ile hücre süzgeç durulayın.</li>
		<li>350 x g 5 min ve atma süpernatant için de hücreleri aşağı spin.</li>
		<li>Kırmızı kan hücreleri dalak hücre süspansiyonlar kaldırın. Hücre Pelet ACK lizis arabelleği (dalak başına 5 mL) resuspend. Ara sıra sallayarak ile oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya ve tam orta 25 mL ile yavaşlaması.</li>
		<li>Spin 350 x g 5 min için de hücreleri aşağı ve süpernatant atın. Hücre Pelet tam orta 1 ya da 10 mL resuspend. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.</li>
	</ol></li> <li>B-hücre izolasyon Not: izole B hücreleri tarafından negatif seçim üretici takip &#39; s yönergeleri. Sigara-B hücreleri B hücreleri (CD4, CD8, CD11b, CD43, CD49b, CD90.2, Ly-6 C/G (Gr-1) ve TER119) ve manyetik parçacıklar streptavidin kaplı karşı yönetmen biotinylated antikorlar ile kaldırılması için hedeflenir.
	<ol><li>Hazırla 1 x 10 8 hücre/mL steril 5 mL (12 x 75 mm) polistiren tam ortamda bir 0,25-2 mL hücre süspansiyon yuvarlak alt tüp. Normal fare serum (50 µL/mL) için örnek ekleyin.</li>
		<li>Ekle 50 µL/mL yalıtım örnek için kokteyl. Hücreleri nazikçe pipetting tarafından mix yukarı ve aşağı 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya</li>
		<li>75 µL/mL streptavidin kaplı manyetik parçacıklar için örnek ekleyin. Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix 2 - 3 kat ve oda sıcaklığında 2.5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Tam RPMI 1640 orta ekleyin. Hücreleri yukarı ve aşağı 2 - 3 kez hafifçe pipetting tarafından mix.</li>
		<li>(Olmadan kapağı) tüp mıknatıs yerleştirin ve 2.5 dk. Pour kapalı bir yeni 15 mL konik tüp içine el değmemiş B hücreleri içeren süpernatant için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Bir hemasitometre ve Trypan mavi leke kullanarak canlı hücreleri saymak. Akış Sitometresi Analizi B220 ve CD19 gibi B-hücre yüzey işaretlerinin tarafından B hücreleri saflığı değerlendirmek.</li>
	</ol></li> <li>B-hücre stimülasyon ve HDI tedavi <ol><li>tam RPMI 1640 orta 10 6 hücre/mL x 0,3 son bir konsantrasyon, saflaştırılmış B hücrelerinde Resuspend.</li>
		<li>48-şey hücre kültür plaka hücre kültürü için kullanın. Her şey için saf B-hücre süspansiyon (10 6 hücre/mL x 0.3), Escherichia coli, Il-4 (5 ng/mL nihai toplama) ve 0 LPS (3 µg/mL son konsantrasyonu) veya 500 µM HDI (Valproik asit; 1 mL ekleyin VPA).</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 60 h qRT-PCR ve yüksek üretilen iş mRNA ve miRNA sıralama çözümleme veya Akış Sitometresi Analizi için 96 h için kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Akış Sitometresi Analizi CSR ve Plazma hücre farklılaşması <ol><li>Hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından kültür 96 h sonra her şey hücrelerden bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. Spin aşağı 350 x g 5 min bir tezgah üstü santrifüj kullanarak için de hücreleri ve süpernatant atın.</li>
		<li>Resuspend % 1 BSA ve 0,5 ng/mL floresein (FITC) - içeren HBSS arabelleği 100 µL hücrelerle konjuge keçi - fare IgM antikor (Ab) , 0.2 ng/mL allophycocyanin (APC) anti-konjüge fare Anti-fare Igg1 monoklonal Ab (mAb), 0.2 ng/mL phycoerythrin (PE)-Birleşik fare Anti-fare B220 mAb, 0.2 ng/mL PE-Cy7-Birleşik fare Anti-fare CD138 mAb ve 2 ng/mL 7-aminoactinomycin D (7-AAD).</li>
		<li>Floresans Birleşik antikorlar (Adım 1.4.2), oda sıcaklığında 30 dakika süreyle karanlıkta hücrelerle kuluçkaya</li>
		<li>HBSS % 1 BSA ile 1 mL hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>1500 x g 5 min bir benchtop santrifüj ve atma süpernatant kullanarak için de hücreleri aşağı spin.</li>
		<li>HBSS % 1 BSA ile 300 µL hücrelerde resuspend ve hücre süspansiyon yuvarlak alt polistren tüp aktarın. Işığa maruz önlemek için folyo ile tüp kapak.</li>
		<li>Bir tek hücre süspansiyon gerçekleştir Akış Sitometresi Analizi. Her tazminat örnek için 50.000 olaylar ve diğer örnekleri için 250.000 olayları toplamak. Ekipman yazılım kullanarak veri analiz.</li>
		<li>Bir darbe geometri kapı (FSC-Y FSC-A ve SSC-H SSC-A x x) kullanarak enkaz ve birini ortadan kaldırmak. Uygun şekilde ölü hücreleri dışlamak için arsa üzerinde 7-AAD kapısı.</li>
	</ol></li></ol> 2. Yüksek işlem hacmi mRNA-Seq <ol><li>sonra 60 h kültür, ayıklamak toplam RNA küçük RNA üretici takip kurtarabilirsiniz bir toplam RNA izolasyon kit kullanarak 2-4 × 10 6 hücrelerden &#39; s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.</li>
	<li>Üretici takip bir bioanalyzer kullanarak RNA bütünlüğünü &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Yüksek kaliteli toplam RNA'ın 500-1000 ng kullanın (RNA bütünlük numarası RIN &#62; 8.0) RNA-seq için ticari bir RNA ile kütüphane hazırlık örnek pÜretici takip temsilcisi kiti &#39; s yönergeleri.</li>
	<li>Bağdaştırıcıları onların anılan sıraya göre 6-bp dizin bölümlerini dayalı bireysel mRNA-seq kitaplıkları havuz ve kütüphaneler, 50 bp/sıra sıra. Üreticiye göre yüksek üretilen iş DNA sistemi kullanmak &#39; s protokolleri.</li>
	<li>Her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile sıralama çalıştırdıktan sonra demultiplex. Eşleme okuma ve Biyoinformatik analizi, Önceden Seviyelendirilmiş 11 olarak gerçekleştirmek.</li>
	<li>Tüm sıralama okuma TopHat2 varsayılan ayarları 14 kullanarak kendi başvuru genleri (UCSC fare genom yapı mm9) ile hizalayın. Gene tüm örneklerinde başına sayıları elde etmek için HTSeq-count kullanarak hizalama bam dosyalarından işlemek.</li>
</ol> 3. Yüksek işlem hacmi miRNA-Seq <ol><li>kullanımı 100 ng-1 µg yüksek kaliteli toplam RNA, hazırlanan gibi adım 2.1, ticari bir küçük RNA-seq kit kullanarak küçük RNA-seq Kütüphane hazırlık için.</li>
	<li>Ligate dejenere 3 &#39; bağdaştırıcısı 5 üzerine &#8242; başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. Dejenere 5 ligate &#39; bağdaştırıcısı üzerine 3 &#8242; başlangıç küçük RNA molekülleri bir ticari tüp ligasyonu kiti ile biter. RNA tarafından ters transkripsiyon cDNA için dönüştürmek ve PCR güçlendirme ticari kitleri ile tarafından küçük RNA-seq Kütüphane yükseltmek.</li>
	<li>% 6 TBE yerel sayfa jel son küçük RNA-seq kitaplığı belirlemek için kullanın. Bromophenol boya izleme mavi bant jel (0.5 - 1 cm) sonuna yaklaştıkça kadar jel 200 V 1 X TBE arabellek ile çalıştırmak.</li>
	<li>Jel cam plakanın kaldır ve leke etidyum bromür (0,5 µg/mL suda) ile 2-3 dk. Visualize jel bantları UV transilluminator veya başka bir jel dokümantasyon araç temiz bir kapta.</li>
	<li>Kesme dışarı temiz jilet kullanarak ~ 150 bp bant ve 1.7 mL tüp içine yerleştirin.</li>
	<li>Bir jel ekstraksiyon kiti için üreticinin yönergelerini kullanarak DNA ayıklamak.</li>
	<li>Ticari bir yüksek-duyarlı DNA tahlil son kitaplıkla ve konsantrasyon üreticileri başına bir ticari dsDNA tahlil ile boyutu dağıtımını kontrol &#39; yönergeleri.</li>
	<li>Güçlendirme ve bir sonraki sıralamanın başına üreticinin ticari bir yüksek üretilen iş DNA sıralama sistemi ile çalıştırmak için kitaplıklarına havuz &#39; s protokolleri.</li>
	<li>Demultiplex üretici başına her örnek için fastq dosyası oluşturmak için CASAVA ile &#39; s protokolleri.</li>
	<li>Her örnek küçük RNA-seq analiz için üretici başına küçük RNA hizalama için titreme kullanmanız &#39; s iletişim kuralları.
	<ol><li>Kaldırmak rRNA, astar, mitokondri gibi kirletici için hizalı ve benzeri okuma.</li>
		<li>MiRNA dizileri olgun verileri hizalama.</li>
		<li>Saç tokası döngü sıraları (öncü miRNA) verileri hizalama.</li>
		<li>Hizala veri için diğer küçük RNA (fRNA veritabanı kullanılır) dizileri 15.</li>
	</ol></li> <li>Sonra tüm örneklerini sayılabilir, farklı gruplar/örnekler arasındaki fark ifade miRNAs tanımlarsınız. Hedef seçilen mRNA'ların veya TargetScan 16, evren 17 ve PicTar gibi online miRNA hedef tahmin araçları kullanarak bir seçici miRNA tarafından hedef mRNA'ların miRNAs tahmin 18 .</li>
	<li>Fonksiyonel ek açıklama veya yolu analizi gereklidir, marifet yolu analizi (IPA) için tahmin edilen genlerin gönderin veya DAVID.</li>
</ol> 4. Kantitatif RT-PCR (qRT-PCR) mRNA'ların ve miRNAs <ol><li>mRNA qRT-PCR analizi <ol><li>ayıklamak RNA 0,2-5 × 10 üzerinden 6 hücreleri aşağıdaki küçük RNA kurtarabilirsiniz bir ticari toplam RNA izolasyon kit kullanarak Üretici &#39; s yönergeleri. Bir Dnaz dahil ben tedavi adım.</li>
		<li>Oligo-dT astar kullanarak bir ilk-strand cDNA sentez sistemiyle cDNA üzerinden toplam RNA sentez.</li>
		<li>QRT-PCR ile 2 x gerçek zamanlı PCR ana karışımı ile aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak uygun astar tarafından cDNA ölçmek: 15 95 ° C s, 40 devredir 10 94 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 30 s.</li>
		<li>Veri toplama sırasında 72 ° C uzantısı adım gerçekleştirmek ve 95'e 72 erime eğrisi çözümlemesi ° C.</li>
	</ol></li> <li>miRNA qRT-PCR analizi <ol><li>Aliquot RNA 4.1.1 adımda hazırlanan örneklerinden.</li>
		<li>Ters-uyarlamak RNA cDNA içine. Üretici takip bir ticari mikroRNA ters transkripsiyon setini kullanın &#39; s yönergeleri.</li>
		<li>Gerçek zamanlı PCR ile 250 nM olgun miRNA ileri astar birlikte evrensel bir ters astar ile SYBR yeşil gerçek zamanlı PCR ana hamuru kullanılarak mikroRNA gerçekleştirir.
		<ol><li>Tezcan 2 x PCR Master Mix, miRNA özgü ileri astar ve evrensel ters astar, oda sıcaklığında. Bireysel çözümler karıştırın.</li>
			<li>Hazırlamak bir reaksiyon karışım aşağıdaki gibi bir 25 µL-başına-da tepki birim (96-şey PCR levha kullanılır) için: 2 x PCR Master Mix 12.5 µL miRNA ileri astar (2,5 μM) 2.5 µL evrensel ters astar (2,5 μM) 2.5 µL RN ASE-Alerjik water5 µL</li> <li>tepki Mix bir 96-şey PCR plakasına eklemek 22,5 μL. Şablon cDNA (50 pg-3 ng) 2.5 µL bireysel plaka wells ekleyin.</li>
			<li>Sıkıca tutkal plaka film. 1 dk 1000 x g ve oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.</li>
			<li>Plaka gerçek zamanlı cycler yerleştirin ve Bisiklete binme aşağıdaki programı Başlat: 95 ° C 5 min, 40 devredir 15 94 ° c için s, 30 55 ° C s ve 72 ° C 30 s.</li>
		</ol></li> <li>Bir elektronik tabloyla qRT-PCR veri analizi için ΔΔCt yöntemini kullanın. İfade küçük nükleer/genelde RNA'ların Rnu6/RNU61/2, Snord61/SNORD61, Snord68/SNORD68 ve Snord70/SNORD70 ilgili miRNAs ifade normalleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>İstatistiksel analiz <ol><li>p değerleri ile eşleştirilmiş ve öğrenci unpaired belirlemek için istatistiksel analiz &#39; s t - bir elektronik tablo kullanarak test etmek ve p değerleri göz önünde &#60; 0,05 olarak önemli.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Allis, C. D., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+hallmarks+of+epigenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The molecular hallmarks of epigenetic control.</a> Nat Rev Genet. 17, 487-500 (2016).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23643790">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends Immunol. 34, 460-470 (2013).</li>
<li>Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+Peripheral+B-Cell+Differentiation+and+the+Antibody+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of Peripheral B-Cell Differentiation and the Antibody Response.</a> Front Immunol. 6, 631(2015).</li>
<li>Xu, Z., Zan, H., Pone, E. J., Mai, T., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoglobulin+class-switch+DNA+recombination%3A+induction%2C+targeting+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunoglobulin class-switch DNA recombination: induction, targeting and beyond.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 517-531 (2012).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 15, 160-171 (2015).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+translation+and+stability+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs.</a> Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).</li>
<li>White, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitors+upregulate+B+cell+microRNAs+that+silence+AID+and+Blimp-1+expression+for+epigenetic+modulation+of+antibody+and+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitors upregulate B cell microRNAs that silence AID and Blimp-1 expression for epigenetic modulation of antibody and autoantibody responses.</a> J Immunol. 193, 5933-5950 (2014).</li>
<li>Farh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+epigenetic+fine+mapping+of+causal+autoimmune+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants.</a> Nature. 518, 337-343 (2015).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr Protoc Mol Biol. , 11-13 (2010).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat Rev Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
<li>Luo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+analysis+using+the+Illumina+microRNA-Seq+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression analysis using the Illumina microRNA-Seq Platform.</a> Methods Mol. Biol. 822, 183-188 (2012).</li>
<li>Shen, T., Sanchez, H. N., Zan, H., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+selective+modulation+of+microRNAs+and+mRNAs+by+histone+deacetylase+inhibitor+in+B+cells+induced+to+uUndergo+class-switch+DNA+recombination+and+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals selective modulation of microRNAs and mRNAs by histone deacetylase inhibitor in B cells induced to uUndergo class-switch DNA recombination and plasma cell differentiation.</a> Front. Immunol. 6, 627(2015).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
<li>Kin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fRNAdb%3A+a+platform+for+mining%2Fannotating+functional+RNA+candidates+from+non-coding+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">fRNAdb: a platform for mining/annotating functional RNA candidates from non-coding RNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 35, D145-D148 (2007).</li>
<li>Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J. W., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+effective+microRNA+target+sites+in+mammalian+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+tools+for+microRNA+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucleic Acids Res. 36, D154-D158 (2008).</li>
<li>Anders, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((doRiNA%3A+a+database+of+RNA+interactions+in+post-transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">doRiNA: a database of RNA interactions in post-transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Res. 40, D180-D186 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu iletişim kuralı B hücre sınıf anahtarlama ve Plazma hücre farklılaşması ikna etmek için kapsamlı yaklaşım sağlar; epigenetik modülatörler tarafından Yani HDI etkisini analiz etmek; ve bu hücreler HDI etkisini mRNA ve miRNA ifadesine algılamak için. Bu yaklaşımların çoğu insan B hücreli işlev ve mRNA/miRNA ifade epigenetik faktör etkisini analiz etmek için kullanılabilir. QRT-PCR ve mRNA-seq/miRNA-seq yaklaşımlar fareler gibi HDIs epigenetik modülatörler ile tedavi dan izole B hücreleri analiz etmek için kullanılabilir...

Epigenetik işaretleri veya DNA metilasyonu, Histon ardından değişiklikler ve kodlamayan RNA'ların (mikroRNA'lar da dahil olmak üzere), gibi faktörler, hücre işlevi gen ifade1değiştirerek modüle. Epigenetik değişiklikler immünglobulin sınıf--düğme DNA rekombinasyon (CSR), somatik Hipermutasyon (SHM) ve bellek B hücreleri veya plazma hücreleri antikor ve antikor böylece oransal, farklılaşma gibi B lenfosit fonksiyon düzenleyen yanıt-e doğru2,3. CSR ve SHM eleştirel Etkinleştirme indüklenen sitidin birdeaminaz (yardım, Aicdakodlanmış), son derece B hücreleri T-bağımlı ve T-bağımsız antijenleri4yanıt indüklenen olduğu gerektirir. Sınıf-açık/hypermutated B hücreleri daha fazla 1 (Blimp1, Prdm1kodlanmış)5plazma hücrelerine antikorlar olgunlaşma B lenfosit kaynaklı protein eleştirel bağımlı bir biçimde büyük miktarda salgılar ayırt etmek. B hücreleri anormal epigenetik değişiklikleri Alerjik reaksiyon veya otoimmünite1,4yol açabilir anormal antikor/antikor yanıt neden olabilir. Nasıl epigenetik faktörleri anlama, miRNAs gibi B hücre içsel modüle gen ekspresyonu sadece aşı geliştirme için önemli değildir, ama aynı zamanda potansiyel anormal antikor/antikor yanıt mekanizmaları ortaya çıkarmak için önemlidir.
Histon asetilasyon ve deasetilasyonu değişimleri genellikle Histon asetiltransferaz (şapka) ve Histon deacetylase (HDAC) tarafından katalize Histon proteinleri üzerinde lizin arasında vardır. Bu değişiklikler Kromatin artan veya azalan erişilebilirlik kurşun ve daha fazla izin vererek veya bağlama transkripsiyon faktörleri veya proteinler DNA ve tadilat gen ifade5,6, için 7 , 8. HDAC inhibitörleri (HDI) bir sınıf HDACs fonksiyonu ile müdahale bileşikleri vardır. Burada, HDI (VPA) iç gen ifade profil B hücreleri ve onun mekanizma HDAC Yönetmeliği gidermek için kullanılan.
miRNAs çeşitli aşamalarından oluşturulan küçük, kodlamayan RNA'ların yaklaşık 18-22 nükleotid uzunluğunda vardır. miRNA ana bilgisayar genlerin transkripsiyonu ve saç tokası birincil mikroRNA (PRI-miRNAs) oluşturur. Onlar nerede PRI-miRNAs daha da habercisi miRNAs (pre-miRNAs) işlenir sitoplazma, ihraç edilmektedir. Son olarak, olgun miRNAs pre-miRNAs bölünme meydana gelir. miRNAs onların hedef mRNA'ların6,7' nin 3' Çevrilmeyen bölgesi içindeki tamamlayıcı dizileri tanıdım. Çoğu susturmak aracılığıyla miRNAs yayılması, farklılaşma ve Apoptozis10,11gibi hücresel aktivite düzenleyen. Birden fazla miRNAs aynı mRNA hedefleyebilir ve bir tek miRNA potansiyel olarak birden çok mRNA'ların hedefleyebilirsiniz beri miRNA ifade profil bireysel değerini ve miRNAs toplu etkisini anlamak için bir içerik görünümünü olması önemlidir. miRNAs B-hücre gelişimi ve periferik farklılaşma, hem de B hücreli sahne özgü farklılaşma, antikor yanıt ve otoimmünite1,4,9dahil olduğu gösterilmiştir. 3' UTR'nin Aicda ve Prdm1, miRNAs8tarafından hedeflenen birkaç doğrulanmış veya tahmin edilen evrimsel korunmuş siteleri vardır.
Epigenetik modülasyon Histon sonrası transkripsiyon değişiklik ve miRNAs, dahil olmak üzere, hücre tipi ve hücre sahne özel düzenleme desen gen ifade9görüntüleyin. Burada, HDI aracılı modülasyon miRNA ve mRNA ifade, CSR ve Plazma hücre farklılaşması tanımlamak için yöntemleri açıklanmaktadır. Bunlar B hücreleri CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi için ikna için protokol B hücreleri HDI ile tedavi etmek için; ve qRT-PCR, miRNA-seq ve mRNA seq10,11,12,8,13tarafından miRNA ve mRNA ifade analiz etmek için.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6 fareler</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro RPMI 1640 Orta (Mod.) L-Glutamin ile 1X (Boyut: 6 x 500mL; L-Glutamin ile)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT 10-040-CV&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH300</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Antibiyotik Antimikotik Solüsyon 100 mL</td><td>Fisher Scientific - Hyclone</td><td>SV3007901&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Merkaptoetanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-420-3250ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>21008-952&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke %0.04</td> <td>GIBCO/Life Technologies/Inv</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lizis Tamponu&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>BW10-548E&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Parlak Çizgi Sayma Odası</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mıknatıs Kök</td><td>Hücre Teknolojileri</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Kapaklı Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1A</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Fare B hücresi İzolasyon Kiti</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>19854</td><td></td></tr><tr><td>BD İğne Sadece 18 Ölçer 1.5 inç KISA EĞİK 100 / kutu&nbsp;</td><td>BD Biyobilimler</td> <td>& nbsp; </td><td></td>305199</tr><tr><td>PE / Cy7 anti-fare CD138 (Syndecan-1) Antikoru</td><td>BioLegend & nbsp;</td><td>142513 (25 ug)</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 B220 antikoru</td><td>BioLegend</td><td>103222</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD (1 mg)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-fare/insan CD45R/B220 antikoru</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td></td></tr><tr><td>Fare APC-IgG1 200 & mikro; g</td><td>Biolegend</td><td>406610</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare IgM Antikoru Biolegend</td><td></td><td>406506</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-fare / insan CD45R / B220 Antikor</td><td>Biyoefsane</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>PE Anti-İnsan / Fare CD45R (B220) (RA3-6B2)</td> <td>Biyoefsane</td><td>103208</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-21-022-CM</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini, Fraksiyon V, Isı Çarpması Uygulanmış&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>LPS 25mg (Escherichia coli 055: B5'ten lipopolisakkaritler)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>L2880-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant fare IL-4 (taşıyıcısız)</td> <td>BioLegend</td><td>574302 (boyut: 10 ug)</td><td></td></tr> <tr><td>Valproik asit sodyum tuzu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>SterilGARD e3 Sınıf II Tip A2 Biyogüvenlik Kabini</td><td>The Baker Company</td><td>SG404</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Kapasiteli Erişimli CO2 İnkübatörü&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Dijital Kontrollü Su Banyoları: Model 205</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-5Q</td><td></td></tr><tr><td>5mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Corning CentriStar 15ml Santrifüj Tüpleri&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>05-538-59A</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL Mikrotüp, şeffaf</td><td>Genesee</td><td>22-282</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Kolay Okuyucu Plastik Santrifüj Tüpleri 50ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>ELMI SkySpin CM-6MT</td><td>ELMI</td><td>CM-6MT</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M</td><td>ELMI</td><td>6M</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 6M.06</td><td>ELMI</td><td>6M.06</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Taşınabilir Pipet Yardımı XP Pipet Kontrol Cihazı</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>25 mL serolojik pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>5 mL serolojik pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>898130-896</td><td></td></tr><tr><td>48 kuyulu plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-86</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 6 Tezgah Üstü Santrifüj, Soğutmasız</td><td>Beckman Coulter</td><td>366802</td><td></td></tr><tr><td>GH-3.8A Rotor, Yatay, ARIES Smart Balance</td><td>Beckman Coulter</td><td>366650</td><td></td></tr><tr><td>Allegra 25R Tezgah Üstü Santrifüj, Soğutmalı</td><td>Beckman Coulter</td><td>369434</td><td></td></tr><tr><td>TA-15-1.5 Rotor, Sabit Açılı</td><td>Beckman Coulter</td><td>368298</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific AccuSpin Micro 17</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Analog Vorteks Karıştırıcı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep kiti</td><td>Zymo Research</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform (Koruyucu/Moleküler Biyoloji Olarak Yaklaşık% 0.75 Etanol)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Rnaz İçermeyen Dnaz seti (50)</td> <td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spektrofotometreler</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Birinci iplikli Sentez Sistemi RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>175013897</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 96 Kuyulu Yarı Etekli PCR Plakaları, 25</td><td>Fisher</td><td>14-230-244</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' Yapışkan Contalar</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB-1001</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ Optik Modülü</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9744</td><td></td></tr><tr><td>iCycler Şasi</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8701</td><td></td></tr><tr><td>Optik Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-9752</td><td></td></tr><tr><td>BD LSR II Akış Sitometri Analizörü</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td></td></tr><tr><td>S200 Odaklanmış ultrasonicator</td><td>Covaris</td><td>S200</td><td></td></tr><tr><td>Illumina için SPRIworks Parça Kitaplığı Sistemi I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A288267</td><td></td></tr><tr><td>cBot Küme Oluşturma İstasyonu</td><td>illumina</td><td>SY-312-2001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000 Genom Dizileyici</td><td>Illumina</td><td>SY-401-1001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Küçük RNA Kütüphanesi Hazırlık Kiti</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Küçük RNA Dizileme Kiti v3</td><td>Bioo Scientific</td><td>5132-05</td><td></td></tr><tr><td>2200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td></td></tr></tbody></table>

genom çapında modülasyon mikrorna ve mrna'ların b hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme dna rekombinasyon ve plazma hücre farklılaşması içinde analiz hdac inhibitörü-aracılı

Genome-wide Analysis of HDAC Inhibitor-mediated Modulation of microRNAs and mRNAs in B Cells Induced to Undergo Class-switch DNA Recombination and Plasma Cell Differentiation

Antikor yanıt somatik Hipermutasyon (SHM), sınıf-anahtarı DNA rekombinasyon (CSR) ve Plazma hücre farklılaşma da dahil olmak üzere birkaç kritik B hücre-içsel süreçleri gerçekleştirilir. Son yıllarda epigenetik değişiklikler veya faktörlere Histon deasetilasyonu ve mikroRNA (miRNAs), B hücreli genetik programlar şekil antikor yanıt,'epigenetik faktörler disfonksiyon neden tespit edilmiştir iken etkileşimde gösterilmiştir antikor yanıt. B hücreleri epigenetik modülatörler cevaben genom çapında miRNA ve mRNA ifade analiz B hücreli işlev ve antikor yanıtı epigenetik Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Burada, biz KSS ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi B hücreleri inducing, Histon deacetylase (HDAC) inhibitörleri (HDIs) ile bu B hücreleri tedavi ve mRNA ve mikroRNA ifade analiz için bir protokol göstermek. Bu protokol için doğrudan yeni nesil mRNA sıralama (mRNA-seq) ve miRNA-seq teknolojileri, nasıl yapılacağını eşleme okur genom ve nicel ters transkripsiyon (qRT) kullanarak Tamamlayıcı DNA (cDNA) dizileri analiz-PCR. Bu yaklaşımlar ile CSR ve Plazma hücre farklılaşması geçmesi indüklenen B hücrelerde HDI, epigenetik bir regülatör, seçmeli olarak miRNA ve mRNA ifade modüle ve CSR ve Plazma hücre farklılaşması değiştirir, tanımladınız.

Bizim iletişim kuralını kullanarak saf LPS ile yerleştirilen B hücreleri (3 µg/mL) ve Il-4 (5 ng/mL) CSR Igg1 için % 30-40 ve Plazma hücre farklılaşma ~ %10 96 h neden olabilir için. Plazma hücre farklılaşması % ~ 2'ye düştü iken HDI (500µM VPA) ile tedavi sonrası CSR Igg1 için 10-%20 Için azalmıştır (şekil 1). CSR HDI aracılı inhibisyonu daha düşük sayıda sonrası rekombinasyon Iμ-Cγ1 ve olgun VHDJHtarafından doğruladı-tamamlanmış CSR işaretlerinden ...

Epigenetik faktörler gen ekspresyonu modüle ve B hücre işlevi düzenleyen genetik programlarla etkileşim kurabilirsiniz. İçinde vitro B hücreli stimülasyon, qRT-PCR ve yüksek-den geçerek mikroRNA-sıra ve mRNA-sıra yaklaşımlar birleştirerek, B hücreleri miRNA ve gen ifadesinde epigenetik modülasyon analiz edebiliriz.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Antibody responses are accomplished through several critical B cell-intrinsic processes, including somatic hypermutation (SHM), class-switch DNA ...

Bu deneyin genel amacı, B lenfositlerinin antikor sınıf değiştirme ve plazma hücresi farklılaşmasına girmesini sağlamak; ayrıca B hücrelerindeki HDAC inhibitörü mRNA ve mikroRNA ekspresyonu aracılığıyla gerçekleşen modülasyonu ve epigenetik düzenlemeyi analiz etmektir. Bu yöntem, immünoglobulin sınıf değiştirme ve plazma hücresi farklılaşmasının epigenetik modülasyonu gibi B hücresi antikor yanıtı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, B hücresi fonksiyonlarını modüle etmek ve mikroRNA'lar ile mRNA'ların epigenetik düzenleyiciler tarafından nasıl değiştirildiğini tanımlamak için basit bir yöntem sunmasıdır.Belirli patojenlerden arındırılmış bir C57BL6J fareyi ötanize edip cildi metin protokolüne uygun olarak sterilize ettikten sonra, göğüs kafesinin hemen altındaki cildi keserek karın bölgesinin sol tarafında, karaciğerin hemen altında yer alan dalağı görünür hale getirmek için otoklavlanmış pens ve diseksiyon makası kullanın. Organı çıkarmadan önce dalağı nazikçe klempleyin ve tüm bağlantı dokularını kesin. Ardından dalağı, 1 000 µL komple RPMI 1640 medyum içeren 1.5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.Ardından, 50 mililitrelik polipropilen konik santrifüj tüpüne 70 mikronluk bir hücre süzgeci yerleştirin ve mikro santrifüj tüpündeki dalağı hücre süzgecinin üzerine boşaltın. Dalağı süzgeçten nazikçe geçirmek için 15 mililitrelik polipropilen konik santrifüj tüpünün ucunu kullanın. Daha sonra süzgeci 15 ila 20 mililitre tam besiyeri ile durulayın.Hücreleri 350 x G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanatı atın. Hücre peletini yeniden süspande etmek için bir mililitre ACK lizis tamponu kullanın ve bir dakika boyunca inkübe edin.Ardından, dalak süspansiyonundan eritrositleri uzaklaştırmak için dört mililitre ACK ekleyin ve süspansiyonu oda sıcaklığında, ara ara çalkalayarak dört dakika daha inkübe edin. Daha sonra, lizis reaksiyonunu durdurmak için 25 mililitre komple besiyeri ekleyin. Hücreleri 350 x G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı atın ve hücre peletini yeniden süspande etmek için bir mililitre komple besiyeri ekleyin. Ardından bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Steril beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpte, komple besiyeri içerisinde mililitre başına 1 x 10⁸ hücre yoğunluğunda 0,25 ila iki mililitrelik bir hücre süspansiyonu hazırlayın.Numuneye normal sıçan serumu ekleyin. Ardından, tüpe mililitre başına 50 µL izolasyon kokteyli ekleyin. Daha sonra hücreleri iki üç kez nazikçe pipetleyerek karıştırın ve numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.Tüpe mililitre başına 75 µL streptavidin kaplı manyetik partikül ekleyin. İki ila üç kez nazikçe pipetaj yapın ve örneği oda sıcaklığında iki buçuk dakika inkübe edin. Tam RPMI 1640 besiyeri kullanarak hacmi 2,5 mL'ye tamamlayın ve karıştırmak için iki ila üç kez nazikçe pipetaj yapın.Açılmış tüpü mıknatısa yerleştirin ve oda sıcaklığında iki buçuk dakika boyunca inkübe edin. Ardından, etkileşime girmemiş B-hücrelerini içeren süpernatanı yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hücreleri saymak için trypan blue ve bir hemositometre kullanın.Saflaştırılmış B hücrelerini, mililitre başına 0.3 x 10⁶ hücre nihai konsantrasyonunda komple RPMI 1640 ortamında tekrar süspande edin. Ardından, 48 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, 0.3 x 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda bir mililitre saflaştırılmış B hücresi, 3 µg/mL E. coli kaynaklı LPS, 5 ng/mL IL4 ve ya 0 ya da 500 µM HDI ekleyin. Hücreleri, qRT-PCR ile yüksek verimli mRNA ve miRNA sekanslama analizi için 60 saat veya akış sitometrisi analizi için 96 saat boyunca 37 °C'de ve %5 CO2 altında inkübe edin.96 saatlik kültürün ardından, her kuyucuktaki hücreleri birkaç kez pipetleyerek yukarı aşağı çekip yerinden ayırın. Hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, bir masaüstü santrifüj kullanarak hücreleri 350 x G'de beş dakika boyunca çöktürün.Ardından, süpernatanı uzaklaştırın. HBSS tamponu ile şu reaktiflerden oluşan bir kokteyl hazırlayın: %1 BSA, mililitre başına 0,5 nanogram konjuge keçi anti-fare IgM antikoru, mililitre başına 0,2 nanogram konjuge sıçan anti-fare IgG1 monoklonal antikoru, mililitre başına 0,2 nanogram konjuge sıçan anti-fare B220 monoklonal antikoru, mililitre başına 0,2 nanogram PE-Cy7-konjuge sıçan anti-fare CD138 monoklonal antikoru ve mililitre başına iki nanogram 7-AAD. Hücreleri oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, hücreleri yıkamak için %1 BSA içeren 1 ml HBSS kullanın. Hücreleri 1.500 x G'de beş dakika boyunca çöktürmek için bir masaüstü santrifüj kullanın. Süpernatantı attıktan sonra, hücreleri yeniden süspandirmek için %1 BSA içeren 300 µL HBSS kullanın ve hücre süspansiyonunu yuvarlak tabanlı bir polistiren tüpe aktarın.Işığa maruz kalmasını önlemek için tüpü folyo ile kaplayın. mRNA'nın QRT PCR analizini gerçekleştirmek için DNAse 1 uygulama adımını ekleyin. Ardından, üretici talimatlarını izleyerek, 0,2 ile 5 x 10⁶ hücreden RNA ekstrakte etmek için küçük RNA'ları geri kazanabilen ticari bir toplam RNA izolasyon kiti kullanın.cDNA sentezini tamamlayıp mRNA üzerinde QRT PCR gerçekleştirdikten sonra; oda sıcaklığında çözdürülmüş cyber green real time PCR master mix, 2x PCR master mix, 250 nanomolar miRNA spesifik ileri primer ve bir evrensel geri primer kullanarak mikroRNA için RT PCR uygulayın. Metin protokolüne uygun olarak 25 mikrolitrelik bir reaksiyon karışımı hazırladıktan sonra, 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına 22,5 mikrolitrelik alikotlar ekleyin. Ardından, her bir kuyucuğa 2,5 mikrolitre kalıp cDNA ekleyin.Plaka filmini sıkıca kapatın. Ardından plakayı oda sıcaklığında 1.000 x G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Plakayı gerçek zamanlı döngüleyiciye yerleştirin ve metin protokolünde yer alan döngü programını başlatın.Bu videoda gösterilen protokol kullanılarak, PS NIL4 olmadan 96 saat boyunca inkübe edilen saflaştırılmış B hücreleri, %30 ila %40 oranında IgG1'e CSR ve yaklaşık %10 oranında plazma hücresi diferansiyasyonu indükleyebilir. HDI uygulaması sonrası, IgG1'e CSR %10 ila %20'ye düşerken, plazma hücresi diferansiyasyonu yaklaşık %2'ye gerilemiştir. HDI aracılı CSR inhibisyonu, rekombinasyon sonrası I mu C gamma 1 ve mature VHDJHC gamma 1 transkript sayılarındaki azalma ile daha da doğrulanmıştır. QRT PCR ile ölçüldüğünde, CSR SHM için kritik olan Aicda ile plazma hücresi diferansiyasyonu için önemli olan Prdm1 ve Xbp1 ekspresyonunun VPA tarafından inhibe edildiği gösterilmiştir.PS Nil4 olmadan stimüle edilen B hücrelerinin mRNA sekanslamasıyla ölçüldüğünde, yüksek düzeyde eksprese edilen bu mRNA'ların yalnızca %0,3'ü HDI tarafından iki kattan fazla yukarı regüle edilmiş ve Aicda, Prdm1 ve Xbp1 dahil olmak üzere yüksek düzeyde eksprese edilen mRNA'ların yalnızca %0,36'sı HDI tarafından %50'den fazla azaltılmıştır. HDI veya Nil ile tedavi edilen B hücrelerindeki miRNA profillemesinin miRNA sekanslama analizi, HDI'ların Aicda ve Prdm1'i hedefleyen miRNA'ları seçici olarak yukarı regüle ettiğini göstermiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik dört buçuk ile beş saat arasında tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, steril bir çalışma ortamının korunması gerektiğini hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, B hücrelerinin sınıf değiştirme ve plazma hücresi farklılaşmasına nasıl yönlendirileceği ve bu fonksiyonların epigenetik regülatörler aracılığıyla nasıl modüle edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

genome-wide-analysis-hdac-inhibitor-mediated-modulation-micrornas

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.

Izoform özel Gen Hedefler Belirlemek için ChIP kullanarak genom analizi

Antijen maruz kalma ardından, aktive B hücreleri alt popülasyonlar farklı efektör fonksiyonları ile antikor isotypes üretmek için sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) olarak bilinen bir süreç geçmesi. Bu raporda açıklanan protokol KSS uyarılan ve nasıl analiz edilebilir...

Sınıf Anahtarı Rekombinasyon murin B Hücreleri Saf İndüksiyon ve Değerlendirme

Bu protokolde, yeni sentezlenen veya yeni ortaya çıkan DNA ile ilişkili proteinleri ve histon modifikasyonlarını incelemek için yeni bir BrdU-ChIP-Slot-Western tekniğini açıklıyoruz.

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Mevcut Yöntem birden çok yüzeylerde UHPLC-MS analizi tarafından Histon uyku (HDAC) HeLa hücreleri izoformu özgü inhibitörleri tanımlanmasını sağlar. Bu yaşam HDAC1 ve HDAC6 etkinliği yansıtmak üzere geliştirilen bir antikor-Alerjik yöntemdir tek-izoformu boş hücre deneyleri aksine hücre çevre.

Eş zamanlı ölçüm HDAC1 ve HDAC6 faaliyete HeLa hücreleri kullanarak UHPLC-MS

Bu çalışma olgun bir fare T-hücresi hattı kullanarak kromatin immüno çökeltme (ChIP) için bir protokolü açıklamaktadır. Bu protokol, spesifik histon marklarının belirli promotör alanlarında veya genom çapında dağılımını araştırmak için uygundur.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Burada, tomurcuklanma Maya Saccharomyces cerevisiaeüzerinden değiştirilmiş Histon Kromatin immunoprecipitation için bir protokol açıklayın. Immunoprecipitated DNA kantitatif PCR için daha sonra bereket ve Histon translasyonel modifikasyonlar genom boyunca yerelleştirilmesini sorguya eskiden.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Çok adımlı kültür sistemleri kullanarak, biz in vitro bir B hücre plazma hücre farklılaşması modeli için rapor.

Uzun ömürlü plazma hücreleri insan Normal bellek B hücrelerine vitro farklılaştırma modelinde

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Burada , in vitro DC farklılaşması için stabil nakavt hücre hatları elde etmek için shRNA'nın lentiviral transdüksiyonunu kullanarak dendritik hücrenin (DC) gelişiminde rol oynayan potansiyel transkripsiyon faktörlerini taramak için bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücre Hattı In vitrounda Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Knockdown ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi Çalışması

Keşfedin B lenfositlerinde antikor sınıf değiştirme ve plazma hücre farklılaşmasını HDAC inhibitörleri ile epigenetik düzenleme yöntemini. Bu teknik immunoloji araştırmalarında gen ifadesi modülasyonunu analiz etmeye yardımcı olur.

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNAların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı (Video) | JoVE Journal

Genom çapında modülasyon mikroRNA ve mRNA'ların B hücreleri indüklenen geçirmek sınıf--düğme DNA rekombinasyon ve Plazma hücre farklılaşması içinde analiz HDAC inhibitörü-aracılı

Daha fazla video keşfet