Legionella pneumophila Dış Zar veziküller: İzolasyon ve Makrofajlar Onların Pro-inflamatuar Potansiyeli Analizi

Bu çalışmanın genel amacı, Legionella pneumophila'dan Dış Zar Veziküllerini veya OMV'leri standart bir şekilde saflaştırmak ve bunların insan ve murin makrofajlarında bakteri replikasyonu üzerindeki etkilerini analiz etmektir. Bu yöntem, dış zar vezikül araştırması alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, OMV hazırlığı için standartlaştırılmış prosedür, konakçı-patojen etkileşimi üzerindeki etkilerini incelemeye yardımcı olabilir.

Bu tekniğin temel avantajı, Legionella pneumophila OMV'lerin insan veya murin makrofajları üzerindeki etkisini incelemek için standart bir protokol sağlaması ve bunun Legionella pneumophila patojenitesini anlamamızı geliştirmesidir. Bu yöntem için ilk olarak, OMV'lerin olası pro-inflamatuar potansiyelini ve OMV'lerin hem konakçı hücre içinde hem de hücre dışı olarak Legionella tarafından salındığı için enfeksiyonun seyrini nasıl etkileyebileceğini düşündüğümüzde aklımıza geldi. Prosedür, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Kerstin Hoffmann ve doktora sonrası araştırmacı Analina Young tarafından gösterilecek.

Başlamak için, steril koşullar altında çalışırken, L.pneumophila suş çekirdeği B'yi BCYE agar plakalarına yayın ve üç gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. L.pneumophila'yı 10 mililitre YEB ortamını 0.3 OD600'de aşılamak için bir ön kültür plakasından kullanın ve bakterileri altı saat boyunca dönen bir çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Bir kan agar plakası üzerine 100 mikrolitre süspansiyon yayarak sıvı kültürün saflığını doğrulayın.

Kan agar plakasını gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kalan sıvı kültürü 90 mililitre taze YEB ortamına ekleyin ve kültürü 3.0 ila 3.5 OD600'e ulaşana kadar dönen bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Bakterileri peletlemek için sıvı kültürü 4.000 g'da 20 dakika santrifüjleyin.

Ardından süpernatanı taze santrifüj tüplerine aktarın. Bakteri peletlerini atın ve santrifüjleme adımını bir kez daha tekrarlamadan önce numuneleri tekrar santrifüjleyin. Ardından, kalan süpernatanı iki kez sterilize edin.

Daha sonra bakteri içermeyen süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve numuneleri üç saat boyunca dört santigrat derecede 100.000 g'da döndürün. Süpernatanı boşaltın ve atın. Ardından OMV peletlerini yeniden süspanse etmek ve bir araya getirmek için steril PBS kullanın.

Kirletici proteinleri ve serbest LPS'yi çıkarmak için ultrasantrifüjleme adımını tekrarlayın. Şimdi, süpernatanı atın ve ultrasantrifüj tüpünü steril bir pamuklu çubukla kurulayın. OMV peletini 500 mikrolitre steril PBS ile tekrar süspanse edin.

Daha sonra, hazırlanan vezikülün bakteriyel kontaminasyonunu dışlamak için kan agar ve BCYE agar plakalarına her biri 20 mikrolitre sürün. Kan agar plakasını gece boyunca ve BCYE agar plakasını üç gün boyunca inkübe edin. Elde edilen OMV preparatı için protein miktarını ölçmek için üreticinin talimatlarına göre BCYE testini kullanın.

THP-1 hücrelerini metin protokolüne göre makrofajlara farklılaştırdıktan sonra, farklılaşma ortamını değiştirmek için 500 mikrolitre taze ortam kullanın ve hücreleri 37 santigrat derecede 24 saat daha inkübe edin. THP-1 veya murin BMDM hücrelerini OMV'lerle tedavi etmek için önceden hazırlanmış OMV'leri çözün ve hücrelere uygun miktarı ekleyin. Makrofajları OMV'lerle en az 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin, böylece önceden işlenmiş veya tedavi edilmemiş THP-1 hücrelerini vahşi tip L.pneumophila suşu çekirdek B veya murin BMDM hücreleri ile bu suşun kamçı içermeyen bir mutantı ile enfekte edin.

Bakterileri 0.5'lik bir MOI'ye ekleyin, bu da kuyucuk başına 10 ila beşinci L.pneumophila'ya eşittir. Kültürleri sırasıyla 24 ve 48 saat inkübe edin. Hücreleri parçalamak için,% 0.1'lik bir son konsantrasyonda saponin ekleyin ve hücreleri beş dakika inkübe edin.

Daha sonra parçalanmış makrofajları pipetleme ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir reaksiyon kabına aktarın. L.pneumophila süspansiyonunun seri seyreltmelerini hazırlamak için steril PBS kullanın. Daha sonra BCYE agar plakalarına gerekli seyreltmelerden 50 mikrolitre çizgi ve plakaları üç gün inkübe edin.

Oluşan kolonileri gözle görsel olarak sayın ve metin protokolüne göre hesaplamalar yapın. Bu deneyde, L.pneumophila OMV'lerin pro-inflamatuar potansiyelinin incelenmesinde, PMA ile farklılaşmış THP-1 hücreleri, IL-8 ve IL-6 sekresyonunda zamana ve doza bağlı bir artış ile yanıt verir. Burada, farklı toll benzeri reseptörlerin L.pneumophila OMV tanıma üzerindeki etkisi, bir CXCL-1 ELISA testi kullanılarak farklı genetik geçmişlere sahip murin BMDM'lerinde analiz edildi.

Yabani tip farelerden elde edilen murin BMDM'leri, OMV stimülasyonundan sonra CXCL-1 salgılarken, TLR2/4 çift nakavttan elde edilen murin BMDM'leri önemli ölçüde daha az salgılandı. L.pneumophila OMV'lerin THP-1 makrofajlarında bakteri replikasyonu üzerindeki etkisini incelemek için, hücreler 20 saat boyunca OMV'lerle önceden inkübe edildi ve daha sonra ek olarak L.pneumophila ile enfekte edildi. THP-1'den türetilen makrofajların ön uyarılması, ilk olarak 24 saatlik enfeksiyondan sonra bakteriyel replikasyon dozunu bağımlı olarak azaltırken, daha sonraki zaman noktasında CFU sayısında iki katına çıkmasına neden olur.

Bu deneyde gösterildiği gibi, murin BMDM'lerinin OMV'lerle ön uyarılması, vahşi tip hayvanlardan murin BMDM'sinde CFU sayısında on kat artışa neden olurken, TLR2 nakavt ve TRIF/MyD88 makrofajları, OMV ön inkübasyonundan sonra L.pneumophila replikasyonunda bu artışı göstermez. Bu prosedürü denerken, steril koşullar altında çalışmayı ve saflaştırılmış OMV'lerin bakteriyel kontaminasyonunu kontrol etmeyi unutmamak önemlidir. Aksi takdirde, aşağı akış analizi kesin sonuçlar vermez.

Bu prosedürü takiben, hangi Legionella mutantının daha fazla veya daha az OMV ürettiği gibi ek soruları yanıtlamak veya farklı stres koşullarının OMV'lerin salgılanması üzerindeki etkisini araştırmak için nanopartikül izleme analizi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, OMV araştırmaları alanındaki araştırmacıların, OMV'lerin in vitro ve daha sonra in vivo olarak konak-patojen etkileşimleri üzerindeki etkisini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, OMV'lerin nasıl saflaştırılacağını ve makrofajların sonraki enfeksiyonu üzerindeki etkilerini analiz etmeye nasıl başlayacağınızı iyi anlamalısınız.

Bu protokol daha sonra inkübasyon ve büyüme sürelerine adapte olduktan sonra farklı gram-negatif bakteriler ve ilgili konak hücreleri için uygulanabilir. Legionella pneumophila ile çalışmanın insanlar için son derece bulaşıcı olabileceğini unutmayın, bu nedenle Legionella ile çalışırken ve bu prosedürü gerçekleştirirken çalışma her zaman steril bir tezgah altında yapılmalıdır.