Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için İn Vitro sidualizasyonu
2 Mart 2017
Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.
Bu prosedürün genel hedefleri, in vitro desidualizasyon çalışması için ortak kültürleri için birincil fare endometriyal, stromal ve epitel hücrelerini izole etmek ve kültürlemektir. Bu yöntem, üreme tıbbı alanında, desidualizasyon ve trofoblast invazyonu gibi önemli süreçler sırasında epitel ve stromal hücreler arasındaki parakrin sinyalizasyonun ne olduğu ve bu sinyal yolunun nasıl düzenlendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknikler, epitelyal ve stromal ko-kültür sisteminde desidualizasyon sürecini incelemek için kullanılabilir.
Bu sistemi kullanarak, iki hücreden biri tarafından salgılanan sinyal moleküllerinin bu süreci etkileyip etkilemeyeceğini değerlendirebilirsiniz. Uterusu almadan önce, hayvanların döngü aşamalarını kontrol etmek için vajinal smear muayenesi yapın. Sadece kızgınlık fazındaki fareleri seçmek için.
Vajinal lavajda kornea epitel hücrelerinin varlığı ile karakterize edildiği gibi. Daha sonra, ilk kızgınlık hayvanının karnını açmak için forseps ve makas kullanın ve her iki uterus boynuzunu görselleştirmek için bağırsakları yana yansıtın. Fallop tüpünün altında, en uzak uçta bir boynuz tutarak, uterus dokusunu diseksiyon forsepsleri ve yağ ve bağ dokularını çıkarmak için Dumont beş numaralı forseps kullanarak fallop tüpünden diseksiyon yapın.
Ardından, rahim gövdesinin üzerindeki distal uçtaki boynuzu çıkarın. Rahim boynuzlarını çıkardıktan sonra, üç mililitre HBSS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin. Tüm rahim boynuzları toplandığında, çanağı stereo mikroskop altında aktarın ve kalan yağ ve bağ dokularını çıkarmak için forseps kullanın.
Daha sonra, Dumont numaralı beş forseps, diseksiyon forseps ve küçük yaylı makas kullanarak, lümenlerini ortaya çıkarmak için uterus boynuzlarını uzunlamasına açın ve dokuları taze HBSS içeren yeni bir Petri kabında durulayın. Şimdi, tüm boynuzları pankreatin ve tripsin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ve dokuları bir orbital çalkalayıcı üzerinde dört santigrat derece ve 50 rpm'de 60 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin.
Bir saatin sonunda, tüpü çalkalamadan 45 dakikalık yatay inkübasyon için tezgaha aktarın, ardından 37 santigrat derecelik bir su banyosunda çalkalamadan 15 dakikalık yatay inkübasyon yapın. Su banyosu inkübasyonunun sonunda, süpernatanı dikkatlice dekanter edin ve uteri, tripsin aktivitesini etkisiz hale getirmek için beş dakika boyunca soğuk fare endometriyal epitel hücre ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Daha sonra, dokuları üç mililitre soğuk HBSS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve epitel tabakalarını serbest bırakmak için dokuları 10 saniye boyunca girdaplayın.
Daha sonra, uterusu üç mililitre taze HBSS içeren yeni bir Petri kabında durulayın ve az önce gösterildiği gibi iki yeni 15 mililitrelik tüpte iki epitel tabakası süspansiyonu daha toplayın. Üçüncü doku girdabından sonra, uterusu 37 santigrat derece ve 200 rpm'de 30 dakikalık bir inkübasyon için fare endometriyal stromal hücre sindirim karışımı içeren 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Doku kalıntılarını gidermek için üç hücre süspansiyonunu 100 mikronluk bir naylon ağdan nazikçe pipetleyerek ve ardından elde edilen hücrelerin süspansiyonunun santrifüjlenmesini sağlayarak epitel tabakalarını geri kazanın.
Peletleri 12 mililitre fare endometriyal epitel hücre ortamında iyice karıştırarak yeniden süspanse edin, ardından kalan fare endometriyal stromal hücresini yerçekimi ile ayırmak için çözeltinin beş dakika çökmesine izin verin. Sedimantasyonun sonunda, süpernatantın üst iki mililitresini dikkatlice çıkarmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın ve toplanan hücreleri santrifüjleyin. Ardından, fare epitel peletini nazik pipetleme ile epitel ortamında yeniden süspanse edin.
Ve hücreleri, planlanan aşağı akış analizi için uygun yoğunlukta kollajen kaplı örtü fişleri üzerine yerleştirin. Epitel hücre izolasyonundan sonra, stromal hücrelerle devam edin ve fare stromal hücre sindirim tüpünü uteri ile birlikte inkübatörden çıkarın. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, az önce gösterildiği gibi, tüpü 10 saniye boyunca elle hafifçe sallayın ve uterusu üç mililitre dört derece celsisus HBSS içeren bir Petri kabına aktarın.
Dokuları iyice durulayın, daha sonra tripsin aktivitesini etkisiz hale getirmek için sindirim tüpüne üç mililitre stromal hücre ortamı ekleyin ve uterusu üç mililitre taze fare endometriyal stromal hücre ortamı içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Doku tüpünü 10 saniye boyunca nazikçe çalkalayın. Daha sonra, uterusu bir soğuk HBSS kabına aktarın, ardından 15 mililitrelik yeni bir stromal hücre ortamı tüpüne transferlerini takip edin.
Üçüncü bir doku durulaması ve transferinden sonra, uterus dokularını taze fare endometriyal stromal hücre sindirim karışımında 30 dakikalık, 37 santigrat derece inkübasyon için inkübe edin. Sindirimin sonunda, hücre süspansiyonlarını bir tüpten üçe ve tripsin tüpünü 40 mikronluk bir naylon ağdan geçirin ve ağı ek beş mililitre fare endometriyal stromal hücre ortamı ile durulayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın.
Ve peleti, planlanan aşağı akış analizi için uygun yoğunlukta polilisin kaplı örtü fişleri üzerine kaplama için taze fare endometriyal stromal hücre ortamında yeniden süspanse edin. Birincil hücre kültürlerinin saflığı, vimentin seviyeleri fare endometriyal stromal hücrelerinde yüksek ve fare endometriyal epitel hücrelerinde düşük olduğundan, vimentin ve sitokeratin ekspresyonundaki farklılıklarla değerlendirilebilir. Sitokeratin seviyeleri fare endometriyal epitel hücrelerinde yüksek ve fare endometriyal stromal hücrelerinde düşüktür.
Mentin/sitokeratin çift boyama, mentinin stromal hücreler tarafından ekspresyonunu ve ayrıca epitel hücreleri tarafından sitokaratinin özel ekspresyonunu daha da gösterir. Siklik adenozin monofosfat ve MPA uygulaması ile stromal hücre kültürlerinde desidualizasyonun indüksiyonu, prolaktin MRNA seviyelerinin kontrol stromal hücre kültürlerine kıyasla beş günlük tedaviden sonra önemli ölçüde arttığını ortaya koymaktadır. Epitel hücrelerinin yan hücre kültürü eklerinde görselleştirilmesi zor olduğundan, canlı epitel hücrelerinin varlığını gösteren maviden parlak pembeye bir renk kayması ile beş günlük bir desidualizasyon simülasyonundan hemen sonra bir canlılık testi gerçekleştirilebilir.
Bu tekniği takiben, blastosist varlığında epitel hücreleri tarafından salgılanan faktörlerin stromal hücre desidualizasyonunu indükleyip indükleyemeyeceğini değerlendirmek için blastosist adezyon testleri gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, in vitro desidualizasyonu incelemek için bir kokültür sisteminde kullanılabilecek, primer fare endometrial stromal ve epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standardize edilmiş ve valide edilmiş bir yöntem sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Üreme Tıbbı
- Hücre Kültürü Teknikleri
- Endometrial Biyoloji
Arka Plan
- Desidüalizasyonun anlaşılması, üreme sağlığı açısından kritik öneme sahiptir.
- Epitelyal ve stromal hücreler arasındaki parakrin sinyalizasyon, bu süreçte kilit bir rol oynar.
- Primer hücre kültürleri, bu sinyal yolaklarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Araştırmalarda tekrarlanabilirlik için standardize yöntemler gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Primer fare endometrial hücrelerini izole etmek ve kültüre etmek.
- Desidüalizasyonu incelemek için bir ko-kültür sistemi kurmak.
- Desidüalizasyonda rol oynayan sinyal mekanizmalarını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Östrus evresindeki farelerin seçilmesi için vajinal yayma incelemesi.
- Steril koşullar altında uterus boynuzlarının diseksiyonu ve toplanması.
- Hücre ayrıştırması için pankreatin ve tripsin ile inkübasyon.
- Naylon filtre ve santrifüj kullanarak hücre kültürü ve saflaştırma.
Temel Sonuçlar
- Fare endometriyumundan epitel ve stromal hücrelerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Kokültür sisteminin desidüalizasyonu inceleme yeteneğinin gösterilmesi.
- Vimentin ve sitokeratin ekspresyonu aracılığıyla hücre saflığının değerlendirilmesi.
- Spesifik tedavilerle desidüalizasyon indüksiyonunun gözlemlenmesi.
Sonuçlar
- Yöntem, endometrial hücre etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Elde edilen bulgular, üreme süreçlerinin anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, diğer sinyal yollarını araştırmak için bu çerçeve üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel İlgililik
Bu yöntem, desidüalizasyon sırasındaki parakrin sinyalleri incelemek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak üreme tıbbında endometrial stromal-epitel etkileşiminin mekanistik risklerinin azaltılmasını mümkün kılar. İmplantasyonla ilişkili yolaklar için hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerini destekler; fertilite ile embriyo-endometriyum iletişiminin preklinik modellerinde öngörücü değer sunar. Kokültür yaklaşımı, monokültür sistemlerinde gözden kaçan hücreler arası dinamikleri yakalayarak translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Desidüalizasyondaki epitel-stromal parakrin sinyallemenin sorgulanmasına olanak tanıyarak embriyo implantasyonunun moleküler mekanizmalarına açıklık getirir.
- Operasyonel Değer: Vimentin ve sitokeratin belirteçleri aracılığıyla saflığı değerlendirilebilen, saf ve canlı primer hücre popülasyonları sağlayarak hedef taramasındaki biyolojik gürültüyü azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Stromal desidüalizasyonu modüle eden salgılanmış faktörlerin (örneğin, epitelyal hücrelerden kaynaklanan) değerlendirilmesi için kokültür tabanlı analizlerin geliştirilmesini destekleyerek ligand-reseptör ayrıştırmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış izolasyon protokolü, verimi ve canlılığı artırarak bileşik veya siRNA taramaları için analiz tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hormonal olarak hazırlanmış bir sistemde hastalıkla ilgili stromal-epitelyal iletişimi modeller ve implantasyon başarısızlığı etiyolojilerinin preklinik değerlendirmesiyle uyum sağlar.
- Operasyonel Değer: Prolaktin mRNA indüksiyonu ve canlılık analizleri gibi alt fonksiyonel okumalara olanak tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, özellikle rahim reseptivitesi ve erken gebelik sürdürülmesinde stromal-epitelyal etkileşimleri yöneten hedeflerin belirlenmesi için, keşif biyolojisinden hedef tanımlama sürecine uzanan sürekliliğe uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü bir ko-kültür sisteminde, stromal desidüalizasyon tetikleyicilerinin ve epitel kaynaklı sinyal moleküllerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Epitel kondisyonlu ortamlar veya aday modülatörlere yanıt olarak desidüalizasyon çıktıların (örneğin, prolaktin ekspresyonu, morfolojik değişiklikler) kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Gen ekspresyonu kaymaları ve canlılık değişimleri gibi ölçülebilir bağımlı değişkenler oluşturarak koşullar arasında istatistiksel karşılaştırma yapılmasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hormonla ön işlem görmüş stromal yanıtları fizyolojik olarak bağlamlandırılmış bir ko-kültürde modelleyerek, mekanistik bulguları preklinik uygunlukla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sinyal yollarının iteratif testleri için yeniden kullanılabilir bir primer hücre izolasyon platformu kurarak, değişken in vivo modellere olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Epitelyal-stromal iletişimdeki değişkenleri izole ederek implantasyon araştırmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş enzimatik dissosiyasyon ve saflaştırma adımları, laboratuvarlar arasındaki parti-parti tutarlılığı artırır.
- Stratejik Değer: Stromal yanıt fenotipleri hakkında erken öngörücü güven sağlayarak, fertilite hedef programlarındaki devam/durdurma kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Hedeflerin, insanla ilişkili bir murine ko-kültür sisteminde desidüalizasyonu modüle etme yeteneklerine göre riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Primer doku diseksiyonu, enzimatik sindirim ve steril hücre kültürü teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- HBSS, pankreatin, tripsin, kolajen ve polilizin kaplı yüzeylere erişime ve izleme için faz-kontrast mikroskopisine bağlıdır.
- Doku homojenliğini sağlamak için vajinal sürüntü yoluyla fare östrus döngülerinin senkronizasyonunu gerektirir.
- Diğer türlere veya hormonal koşullara adaptasyon; enzim konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Vimentin ve sitokeratin için immünboyama yoluyla yapılan saflık değerlendirmesi bir doğrulama adımı ekler ancak kaynak tarafından güvenilir bir yöntem olarak desteklenmektedir.
