Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için
2 Mart 2017
Bu çalışma, in vitro desidualizasyon çalışma için Coculture sisteminde kullanılabilen birincil fare, endometriyal stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu ve kültürü, bir standart ve geçerli bir yöntem sunulur.
Bu prosedürün genel amaçları, in vitro desidüalizasyon çalışmalarında birlikte kültüre etmek üzere primer fare endometrial stromal ve epitel hücrelerini izole etmek ve kültüre etmektir. Bu yöntem, reprodüktif tıp alanındaki; desidüalizasyon ve trofoblast invazyonu gibi önemli süreçler sırasında epitel ve stromal hücreler arasındaki parakrin sinyalleşmenin ne olduğu ve bu sinyal yolunun nasıl düzenlendiği gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknikler, epitel ve stromal ko-kültür sisteminde desidüalizasyon sürecini incelemek için kullanılabilir.
Bu sistemi kullanarak, iki hücreden birinin salgıladığı sinyal moleküllerinin bu süreci etkileyip etkileyemeyeceğini değerlendirebilirsiniz. Rahmi hasat etmeden önce, hayvanların siklus evrelerini kontrol etmek için vajinal smear muayenesi yapın. Sadece östrus evresindeki fareleri seçmek için.
Vajinal lavajda korneal epitel hücrelerinin varlığıyla karakterize edilir. Ardından, ilk östrus evresindeki hayvanın abdomenini açmak için pens ve makas kullanın ve her iki uterus kornusunu görüntülemek için bağırsakları yana çevirin. Bir kornusu fallop tüpünün altındaki en distal ucundan tutarak, diseksiyon pensi ve yağ ile bağ dokularını temizlemek için Dumont beş numara pens kullanarak uterus dokusunu fallop tüpünden ayırın.
Ardından, uterus gövdesinin üzerindeki distal uçta bulunan kornuyu çıkarın. Uterusun kornuları çıkarıldıktan sonra, bunları 3 mL HBSS içeren 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Tüm uterus kornuları toplandıktan sonra kabı bir stereo mikroskobun altına taşıyın ve kalan tüm adipoz ve bağ dokularını temizlemek için pens kullanın.
Ardından, Dumont numara beş pens, diseksiyon pensi ve küçük yaylı makas kullanarak uterus kornularını lumenlerini açığa çıkaracak şekilde boylamasına kesin ve dokuları taze HBSS içeren yeni bir Petri kabında durulayın. Şimdi, tüm kornuları pankreatin ve tripsin içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Ve dokuları bir orbital çalkalayıcı üzerinde, 4 °C'de ve 50 rpm'de 60 dakika boyunca yatay olarak inkübe edin.
Bir saatin sonunda tüpü, sallamadan 45 dakikalık yatay inkübasyon için tezgaha aktarın ve ardından 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda sallamadan 15 dakikalık yatay inkübasyon uygulayın. Su banyosu inkübasyonunun sonunda, süpernatantı dikkatlice dökün ve tripsin aktivitesini inaktive etmek için uterusları, soğuk fare endometrial epitel hücre ortamı içeren bir Petri kabına beş dakika boyunca aktarın. Daha sonra, dokuları 3 mL soğuk HBSS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve epitel tabakalarını serbest bırakmak için dokuları 10 saniye boyunca vorteksleyin.
Ardından, uterusları üç mililitre taze HBSS içeren yeni bir Petri kabında durulayın ve az önce gösterildiği gibi iki yeni 15 mililitre tüpe iki epitel tabakası süspansiyonu daha toplayın. Üçüncü doku vortekslemesinden sonra, uterusları 37 degrees celsius ve 200 rpm'de 30 dakika inkübasyon için fare endometrial stromal hücre sindirim karışımı içeren 15 mililitre konik tüpe aktarın. Doku kalıntılarını temizlemek için üç hücre süspansiyonunu 100 micron naylon ağ üzerinden nazikçe pipetleyerek epitel tabakalarını geri kazanın ve ardından elde edilen hücre süspansiyonunu santrifüjleyin.
Pelleti, iyice karıştırarak 12 mililitre fare endometrial epitel hücre besiyerinde yeniden süspanse edin, ardından kalan fare endometrial stromal hücrelerin yerçekimi ile ayrışması için çözeltinin beş dakika boyunca çökmesini bekleyin. Sedimentasyonun sonunda, üstteki iki mililitrelik süpernatantı dikkatlice uzaklaştırmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın ve toplanan hücreleri santrifüjleyin. Daha sonra, fare epitel pelletini nazikçe pipetleme yaparak epitel besiyerinde yeniden süspanse edin.
Ve hücreleri, planlanan sonraki analizler için uygun yoğunlukta, kolajen kaplı lamellerin üzerine ekleyin. Epitel hücre izolasyonundan sonra, stromal hücrelerle devam edin ve fare stromal hücre sindirim tüpünü uteruslarla birlikte inkübatörden çıkarın. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, az önce gösterildiği gibi, tüpü elinizle 10 saniye boyunca hafifçe sallayın ve uterusları üç mililitre 4 °C HBSS içeren bir Petri kabına aktarın.
Dokuları iyice durulayın, ardından tripsin aktivitesini inhibe etmek için sindirim tüpüne üç mililitre stromal hücre medyumu ekleyin ve uterusları, üç mililitre taze fare endometrial stromal hücre medyumu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Doku içeren tüpü 10 saniye boyunca nazikçe sallayın. Ardından, uterusları soğuk HBSS içeren bir kaba, sonrasında ise stromal hücre medyumu içeren yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın.
Üçüncü doku durulamasından ve transferden sonra, uterus dokularını taze fare endometrial stromal hücre sindirim karışımı içinde 30 dakika boyunca, 37 °C'de inkübe edin. Sindirim işleminin sonunda, bir ile üç arasındaki tüplerden ve tripsin tüpünden gelen hücre süspansiyonlarını 40 µm'lik bir naylon süzgeçten geçirin ve süzgeci ek beş mL fare endometrial stromal hücre besiyeri ile durulayın. Ardından, hücreleri santrifüj ile toplayın.
Ardından, planlanan alt analizler için uygun yoğunlukta poli-lizin kaplı lameller üzerine ekim yapmak amacıyla, pellet taze fare endometrial stromal hücre besiyerinde yeniden süspande edilir. Primer hücre kültürlerinin saflığı, vimentin ve sitokeratin ekspresyonundaki farklar aracılığıyla değerlendirilebilir; çünkü vimentin seviyeleri fare endometrial stromal hücrelerinde yüksek, fare endometrial epitel hücrelerinde ise düşüktür. Buna karşılık, sitokeratin seviyeleri fare endometrial epitel hücrelerinde yüksek, fare endometrial stromal hücrelerinde ise düşüktür.
Mentin/sitokeratin çift boyaması, mentinin stromal hücreler tarafından ekspresyonunun yanı sıra, sitokeratinin yalnızca epitelyal hücreler tarafından eksprese edildiğini daha ayrıntılı bir şekilde göstermektedir. Siklik adenozin monofosfat ve MPA uygulamasıyla stromal hücre kültürlerinde desidüalizasyonun indüklenmesi, prolaktin mRNA seviyelerinin beş günlük tedaviden sonra kontrol stromal hücre kültürlerine kıyasla dramatik şekilde arttığını ortaya koymaktadır. Epitelyal hücrelerin yan hücre kültürü insertlerinde görüntülenmesi zor olduğundan, beş günlük desidüalizasyon simülasyonunun hemen ardından bir viyalite testi gerçekleştirilebilir; maviden parlak pembeye dönen renk değişimi, canlı epitelyal hücrelerin varlığını göstermektedir.
Bu tekniği takiben, bir blastokistin varlığında epitelyal hücreler tarafından salgılanan faktörlerin stromal hücre desidüalizasyonunu tetikleyip tetikleyemeyeceğini değerlendirmek amacıyla blastokist adezyon deneyleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, in vitro desidualizasyonu incelemek için bir kokültür sisteminde kullanılabilecek, primer fare endometrial stromal ve epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için standardize edilmiş ve valide edilmiş bir yöntem sunmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Üreme Tıbbı
- Hücre Kültürü Teknikleri
- Endometrial Biyoloji
Arka Plan
- Desidüalizasyonun anlaşılması, üreme sağlığı açısından kritik öneme sahiptir.
- Epitelyal ve stromal hücreler arasındaki parakrin sinyalizasyon, bu süreçte kilit bir rol oynar.
- Primer hücre kültürleri, bu sinyal yolaklarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Araştırmalarda tekrarlanabilirlik için standardize yöntemler gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Primer fare endometrial hücrelerini izole etmek ve kültüre etmek.
- Desidüalizasyonu incelemek için bir ko-kültür sistemi kurmak.
- Desidüalizasyonda rol oynayan sinyal mekanizmalarını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Östrus evresindeki farelerin seçilmesi için vajinal yayma incelemesi.
- Steril koşullar altında uterus boynuzlarının diseksiyonu ve toplanması.
- Hücre ayrıştırması için pankreatin ve tripsin ile inkübasyon.
- Naylon filtre ve santrifüj kullanarak hücre kültürü ve saflaştırma.
Temel Sonuçlar
- Fare endometriyumundan epitel ve stromal hücrelerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Kokültür sisteminin desidüalizasyonu inceleme yeteneğinin gösterilmesi.
- Vimentin ve sitokeratin ekspresyonu aracılığıyla hücre saflığının değerlendirilmesi.
- Spesifik tedavilerle desidüalizasyon indüksiyonunun gözlemlenmesi.
Sonuçlar
- Yöntem, endometrial hücre etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Elde edilen bulgular, üreme süreçlerinin anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki çalışmalar, diğer sinyal yollarını araştırmak için bu çerçeve üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel İlgililik
Bu yöntem, desidüalizasyon sırasındaki parakrin sinyalleri incelemek için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak üreme tıbbında endometrial stromal-epitel etkileşiminin mekanistik risklerinin azaltılmasını mümkün kılar. İmplantasyonla ilişkili yolaklar için hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerini destekler; fertilite ile embriyo-endometriyum iletişiminin preklinik modellerinde öngörücü değer sunar. Kokültür yaklaşımı, monokültür sistemlerinde gözden kaçan hücreler arası dinamikleri yakalayarak translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Desidüalizasyondaki epitel-stromal parakrin sinyallemenin sorgulanmasına olanak tanıyarak embriyo implantasyonunun moleküler mekanizmalarına açıklık getirir.
- Operasyonel Değer: Vimentin ve sitokeratin belirteçleri aracılığıyla saflığı değerlendirilebilen, saf ve canlı primer hücre popülasyonları sağlayarak hedef taramasındaki biyolojik gürültüyü azaltır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Stromal desidüalizasyonu modüle eden salgılanmış faktörlerin (örneğin, epitelyal hücrelerden kaynaklanan) değerlendirilmesi için kokültür tabanlı analizlerin geliştirilmesini destekleyerek ligand-reseptör ayrıştırmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış izolasyon protokolü, verimi ve canlılığı artırarak bileşik veya siRNA taramaları için analiz tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Hormonal olarak hazırlanmış bir sistemde hastalıkla ilgili stromal-epitelyal iletişimi modeller ve implantasyon başarısızlığı etiyolojilerinin preklinik değerlendirmesiyle uyum sağlar.
- Operasyonel Değer: Prolaktin mRNA indüksiyonu ve canlılık analizleri gibi alt fonksiyonel okumalara olanak tanıyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği kolaylaştırır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, özellikle rahim reseptivitesi ve erken gebelik sürdürülmesinde stromal-epitelyal etkileşimleri yöneten hedeflerin belirlenmesi için, keşif biyolojisinden hedef tanımlama sürecine uzanan sürekliliğe uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü bir ko-kültür sisteminde, stromal desidüalizasyon tetikleyicilerinin ve epitel kaynaklı sinyal moleküllerinin hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Epitel kondisyonlu ortamlar veya aday modülatörlere yanıt olarak desidüalizasyon çıktıların (örneğin, prolaktin ekspresyonu, morfolojik değişiklikler) kantitatif değerlendirmesine olanak tanır.
- Analitik: Gen ekspresyonu kaymaları ve canlılık değişimleri gibi ölçülebilir bağımlı değişkenler oluşturarak koşullar arasında istatistiksel karşılaştırma yapılmasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Hormonla ön işlem görmüş stromal yanıtları fizyolojik olarak bağlamlandırılmış bir ko-kültürde modelleyerek, mekanistik bulguları preklinik uygunlukla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Sinyal yollarının iteratif testleri için yeniden kullanılabilir bir primer hücre izolasyon platformu kurarak, değişken in vivo modellere olan bağımlılığı azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Epitelyal-stromal iletişimdeki değişkenleri izole ederek implantasyon araştırmalarındaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standardize edilmiş enzimatik dissosiyasyon ve saflaştırma adımları, laboratuvarlar arasındaki parti-parti tutarlılığı artırır.
- Stratejik Değer: Stromal yanıt fenotipleri hakkında erken öngörücü güven sağlayarak, fertilite hedef programlarındaki devam/durdurma kararlarına temel oluşturur.
- Portföy Etkisi: Hedeflerin, insanla ilişkili bir murine ko-kültür sisteminde desidüalizasyonu modüle etme yeteneklerine göre riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Primer doku diseksiyonu, enzimatik sindirim ve steril hücre kültürü teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- HBSS, pankreatin, tripsin, kolajen ve polilizin kaplı yüzeylere erişime ve izleme için faz-kontrast mikroskopisine bağlıdır.
- Doku homojenliğini sağlamak için vajinal sürüntü yoluyla fare östrus döngülerinin senkronizasyonunu gerektirir.
- Diğer türlere veya hormonal koşullara adaptasyon; enzim konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin optimizasyonunu gerektirebilir.
- Vimentin ve sitokeratin için immünboyama yoluyla yapılan saflık değerlendirmesi bir doğrulama adımı ekler ancak kaynak tarafından güvenilir bir yöntem olarak desteklenmektedir.
