Bir Tüysüz fare kulak memesi içinde intravital Mikroskopi ve trombüs İndüksiyon

Bu deneyin genel amacı, potansiyel vazoaktif ilaçların in vivo mikro vasküler trombüs oluşumu üzerindeki etkisini incelemektir. Bu yöntem, sepsis ve doku transplantasyonu sırasında temel komplikasyonlardan biri olan mikro vasküler trombüs oluşumunu önlemeye yardımcı olabilecek yeni antitrombotik maddelerin belirlenmesi gibi trombüs oluşumuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tüysüz fare kulak modelinin, incelenen mikro vasküler yatakta ön cerrahi hazırlığa gerek kalmadan intravital floresan mikroskopiye ve fototoksik trombüs indüksiyonuna olanak tanımasıdır.

İşe farenin ağırlığını ölçüp kaydederek başlayın. Ardından, test maddesinin uygun hacmini bir insülin şırıngasına doldurun. İlacı, trombus indüksiyonundan 30 dakika önce uygulayın.

Trombüs indüksiyonundan 15 dakika önce fareyi anestezi ettikten sonra, anestezinin etkisini göstermesi için fareyi tekrar kafesine yerleştirin. Anestezinin yeterli olduğunu doğrulamak için kuyruğunu pensetle sıkın ve herhangi bir reaksiyon oluşmadığını gözlemleyin. Ardından, çözünmüş 50 Dextran'dan 0,05 ml'yi bir insülin şırıngasına çekin.

Şırıngayı doldurduktan sonra, intravenle olarak uygulanan küçük hava kabarcıkları bile hayvan için ölümcül olabileceğinden, içeride hiç hava kabarcığı kalmadığından emin olun. Anestezili fareyi, entegre ısıtma plakası olan bir acroglass ped üzerine yüzüstü gelecek şekilde yerleştirin. Isıtma plakasını 37 degrees Celsius değerine ayarlayın.

Fare göz kornealarını oftalmik pomad ile kaplayın. Ardından, sağ kulağın kranial ve kaudal kenarına polypropylene 7.0 ile iki dikiş atın. Dikişleri mümkün olduğunca kenara yakın ve tabana proksimal olarak yerleştirin.

Fareyi dorsal pozisyona getirin. Tüm bacakları yapışkanlı bandaj kullanarak platforma sabitleyin. Ön dişlerin altına bir sütür yerleştirin ve sütürü yapışkanlı bandajla platforma sabitleyerek başı dorsifleksiyon pozisyonuna getirin.

Hayvanı stereo mikroskop altındaki platforma yerleştirin. 10X büyütme kullanın. Sağ kulağın mikroskopisi için, önce boyun derisinde kraniokaudal yönde 5 mm'lik bir insizyon oluşturarak sol juguler veni hazırlayın.

Ardından, deri altı dokusunu diseke etmek için mikroforseps ve mikromakas kullanın. Daha sonra, damara dokunmadan veni adventisyasından kurtarın. Şimdi, floresan boya enjeksiyonu için daha önce hazırlanan insülin şırıngasını kullanın.

Venle perforasyon yapmadan, damar duvarını mikroforseps ile dikkatlice kavrayın. Genişlemiş damar duvarını şırınga iğnesiyle penetre edin ve intravenle olarak 50 Dextran enjekte edin. İğneyi geri çekin ve pamuklu çubuklar kullanarak kanamayı durdurun.

Kulağın kan ve boya ile kontamine olmasını önleyin. Hayvanı ısıtma plakası üzerindeyken, ısıtma plakası için bir dilimi ve kulağı konumlandırmak için 0,5 cm yüksekliğinde bir düzlemi olan akro cam düzeneğe aktarın. Hayvanı, yapışkan bandaj kullanarak ısıtma plakası üzerinde prone pozisyonda sabitleyin.

Konveks kıkırdağı, kulağın apikal kısmının düzleme paralel şekilde yerleştirilebilmesi için kulağın düzleminin yanındaki kulak tabanına yerleştirin. Acro cam plakaya oda sıcaklığında bir damla aqua ekleyin. Pamuklu çubuklar kullanarak aqua damlasını emdirin ve kılcal kuvvetlerin kulak düzlemini acro cama sabitlemesini sağlayın.

Kıkırdak, aurikula konveks bir şekil verse de aurikula mümkün olduğunca düz konumlandırılmalıdır. Bu nedenle, akrilik cam plaka üzerine yalnızca aurikulanın daha esnek olan distal kısmı yerleştirilmelidir. Doku hasarını, sıvıların ve boyanın dışa sızmasını önlemek için kulakla forsepsle mümkün olduğunca az temas edilmelidir.

Ardından, kulağın konveks dorsal tarafına bir damla aqua ekleyin. Kulağa giren bazal damarları sıkıştırmadan, üzerine dikkatlice bir lamel yerleştirin. Lamel ile hedef kulak damarları arasındaki mesafeyi minimize etmek için, lamelin altındaki aqua'nın mümkün olduğunda fazlasını pamuklu çubuklar kullanarak temizleyin.

İşe, intravital floresan mikroskobunu 50 Dextran görselleştirmesi için ayarlayarak başlayın. Hazırlanan hayvanı intravital floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin. 5X, 10X ve 20X büyütme ile %20 ışık yoğunluğu kullanarak, 50 ila 60 mikron çapında ve anterograd kan akışına sahip bir venöz damar arayın.

63X büyütmeli objektifin su daldırma işlemi için lam üzerine oda sıcaklığında bir damla su ekleyin. Su damlası uygulamasının hemen ardından, çap ve kan akışının bazal değerlendirmesi için damarı 20 saniye boyunca kaydedin. Trombus indüksiyonunu, 50 Dextran enjeksiyonundan beş dakika sonra başlatın.

Bu amaçla, ışık şiddetini %100'e yükseltin. Fototoksik trombüs indüksiyonu sırasında, kan akışının tıkanıklığını kontrol etmek için 30 saniyelik bir süre içinde mikroskobun diyaframını iki saniye boyunca kapatın. Kan akışı devam ediyorsa, diyaframı tekrar açın. Akış 30 saniye veya daha fazla süreyle durursa ya da kan akışı retrograd ise damar tıkalı olarak sınıflandırılır.

50 Dekstran enjeksiyonundan sonra bir saatlik süre içinde her kulakta beş damarı seçin ve tıkayın. Burada hayvanlar, trombüs indüksiyonu öncesinde 50 Dekstran enjeksiyonundan önce taşıyıcı (vehikül) veya kanabinoidler olan anandamid, WIN 155, 212-2 veya kannabidiol ile tedavi edilmiştir. Tek seferlik tedavi sonrası, taşıyıcı kontrole kıyasla anandamid ve WIN 155, 212-2 trombüs büyümesini anlamlı şekilde hızlandırmış, ancak CBD bunu yapmamıştır.

Başka bir düzenekte, anandamid aracılığıyla gerçekleşen trombüs oluşumu üzerinde siklooksijenaz bağımlı ürünlerin etkisini değerlendirmek için anandamide indometasin eklenmiştir. İndometasinle birlikte uygulama, anandamide pro-trombotik etkisini nötralize etmiştir. Bu nedenle, anandamideye akut maruziyet in vivo ortamda siklooksijenaz bağımlı pro-trombotik bir etki uyandırmaktadır.

Uzmanlaşıldığında, hazırlıklar dahil olmak üzere dar damarlarda trombus indüksiyonu 90 dakika içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, sıvıların ve boyanın ekstrvazasyonunu önlemek için aurikül her dokunulduğunda çok dikkatli bir şekilde tutulması önemlidir. Bu yöntem trombus oluşumu hakkında bilgi sağlayabilse de; yara iyileşmesi, flep yetmezliği ve anjiyogenez gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, intravital fototoksik trombus indüksiyonu gerçekleştirmek için intravenöz floresan boya uygulaması, kulak kepçesinin konumu ve belirli damarların aydınlatılması konularında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.