Name: Synaptic Modülasyon Analizi Drosophila melanogaster Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster fotoreseptörlerinde uzun süreli ışığa maruz kalmanın sinaptik aktif bölgeler üzerindeki etkilerini niceliksel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöronal dinamikleri anlamak için değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının yararlı düzeltmeler, tartışmalar ve yorumlar için T. Stürner minnettarız; sinek stokları sağlamak için SL Zipursky; görüntü işleme gerçekleştirmek için M Schölling. Görüntü analizi Bölüm A. Kakita laboratuarda gerçekleştirilmiştir. Bu eser, Yenilikçi Alanları Başlat-up için Alexander von Humboldt Vakfı ve JSPS Bursu Yurtdışı Araştırma (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-İçi Aid (24800024), (25110713), Mochida tarafından desteklenmiştir Takeda, Inamori Daiichi-Sankyo, Toray Temelleri (TS), DZNE çekirdek finansman (GT) ve DZNE Işık Mikroskopi Tesisi (CM).

Bu protokol açıklanan deneysel prosedürler sadece Drosophila ile çalışmak barındırır Almanya ve Japonya&#39;da hayvan refahı kanunlarına tabi değildir. 1. Işık pozlama Koşulları <ol><li> Fotoreseptör R8 nöronların (R8s) &#39;de BRP-GFP görselleştirmek için sensless-Flippase (sens-flp) ve bruchpilot-FRT-DUR-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 taşıyan sinekler hazırlayın. Bakteriyel Suni Kromozom (BAC) içindeki genomik lokus kodlayan BRP Bu BRP-FSF-GFP cDNA yapısı oluşturmak için modifiye edilmiştir. Bu modifiye edilmiş BAC BRP-GFP ekspresyonunu taşıyan sinekler endojen düzenleyici dizilerin kontrolü altında olmakla birlikte, FRT DURDURMA-FRT kasetinin 15 sensless-flippase aracılı çıkarıldıktan sonra R8 fotoreseptör sınırlayıcı. Sens-flp nadiren R7s içinde Flippase ifade eden unutmayın. </li><li> 12 saatlik li sinekler tutmakeclosion (Şekil 1A) kadar larva 25 ° C &#39;de GHT / 12 saat karanlık çevrimi (LD). </li><li> eclosion 6 saat sonra ve sinek gıda içeren yeni bir şişenin içine koyun - Sinekler 0 toplayın. </li><li> Üç aşamada (41 cm yükseklikte, 21 sm bir bazın 4 cm&#39;lik bir kalınlığa ve her adım için 13 sm bir yükseklik) (Şekil 1B) akrilik reçineden yapılmış şeffaf bir rafın içine şişeleri ayarlayın. </li><li> Bir dijital ışık ölçer (Şekil 1C) kullanarak 1000 lux ortalama yoğunluğu ile aydınlatma sağlamak için raf ve bir LED panelde arasındaki mesafeyi ayarlayın. </li><li> 1 sinekler tutun - aşağıdaki koşullardan birinin altında 3 gün: Küçük bir inkübatör 25 ° C&#39;de sabit karanlık (DD), 12 saat aydınlık / 12 saat karanlık döngüsü (LD), ya da sabit ışık (LL) (Şekil 1A ve 1C). </li></ol> 2. Diseksiyon, İmmunohistokimya ve Görüntüleme <ol><li> , Forseps ile sinek beyinleri teşrih% 4 fo ile bunları düzeltmekChaoptin karşı birincil antikor (1:50) ve daha önceki deney prosedürü 25 göre fotoreseptörlerin görüntülenmesi için ikinci bir antikor ile rmaldehyde ve immunostain. kısaca: <ol><li> PBS içinde% 0.1 Triton X-100 (% 0.1 PBT) hazırlayın. Bu çözelti, bir antikor Doku penetrasyonunu arttırmak için kullanılır. </li><li> Bir CO 2 pad üzerinde sinekler uyutmak doğru genotipi sıralamak ve% 0.1 PBT ile dolu bir petri aktarabilirsiniz. </li><li> burnumun altında forseps sopa ve diğer forseps ile sırasıyla sağ ve sol gözleri çekin. </li><li> proboscis ve beyin bağlı trakea çıkarın. </li><li> Oda sıcaklığında,% 0.1 PBT 150 uL ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içine forseps ile beyin aktarın. </li><li> 2.1.3 10 dk tekrar içinde - 2.1.5 mümkün olduğunca çok sayıda beyin elde etmek. </li><li> tüp içine% 16 formaldehit 50 uL ekleyin ve pipetleme karıştırın. </li><li> odasında fiksatif beyinleri inkübe50 dakika boyunca sıcaklığı. </li><li> tüp içinde beyinleri bırakmak dikkat, bir mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kez yıkayın. </li><li> şöyle Son yıkamadan sonra, hazırlanan,% 0.1 PBT çıkarın ve primer antikor çözeltisi ekleyin:% 0.3 PBT (% 0.3 PBS içinde Triton X-100), anti-Chaoptin antikorun 4 uL (nihai seyreltme oranı: 1 196 uL ekle : fotoreseptörlerin görünüm için 50). </li><li> 4 ° de CO / N birincil antibodi çözeltisinin içine beyinleri inkübe edin. </li><li> mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL yıkama 3x. </li><li> Son yıkamadan sonra,% 0.1 PBT çıkarın ve bir sekonder antikor içeren% 0.3 PBT 200 uL ekleyin. </li><li> 4 ° de CO / N karanlıkta o inkübe edin. </li><li> mikropipet ile% 0.1 PBT 200 uL ile üç kere yıkanır. </li></ol></li><li> Montaj için, yaklaşık 2 cm Dista bir mikroskop lamı merkezinde bir mikropipet ile bir montaj ortamı (2 ul her biri) iki küçük damla koymakbirbirinden ım. </li><li> Her damla üzerine iki lamelleri, bir koyun ve yaklaşık 0.2 mm lamelleri arasındaki dar bir boşluk bırakın. </li><li> lamel üzerine bir montaj ortamı 15 ul koyun ve montaj aracı madde içine bir mikropipet ile beyin ekleyin. </li><li> Bir mikroskop altında, iki lamelleri arasındaki dar aralıkta (Şekil 2) içine ventral yüzü beyinleri yerleştirin. </li><li> Üstüne bir lamel yerleştirin ve örnek (Şekil 2) düzeltmek için net oje kullanarak lameller kenarları mühür. </li><li> konfokal mikroskop ile beyin görüntüleri elde edebilir. Bir 63X yağ daldırma objektif lens (1.4 NA) ve bir 2.6x dijital zoom kullanın. 0.5 um arasında bir basamak boyutu ile ikinci optik ganglion medulla 20&#39;den fazla optik bölümleri oluşturur. </li></ol> Spot, Yüzey Nesneler, Start-noktaları ve Bitiş noktaları 3. Nesil <ol><li> , Distr sayısını ölçmek içinibution ve BRP-GFP puncta ve delokalizasyon seviyesi, görüntü analiz yazılımı konfokal mikroskobu ile elde edilen yığın açın ve 3D görüntü (Şekil 3A) sulandırmak. Bu çalışmada, aşama IMARIS ile gerçekleştirilmiştir unutmayın. </li><li> Her R8 akson terminali için nokta tespiti modülü tarafından BRP-GFP puncta tanımlayın. <ol><li> &quot;Yeni Noktalar Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. El medulla bir R8 akson terminali seçin. </li><li> BRP-GFP sinyal kaynağı kanalını seçin. Not: R7 ve R8, fotoreseptör aksonlar, anti-Chaoptin (Şekil 3A) ile immunolabeled edildi. Sadece, R8, birlikte, BRP GFP puncta içerir ve bu nedenle kolayca (Şekil 3A) ayırt edilebilir. Bundan başka, R8 uç M3 medulla tabakası içine giriş noktasında, anti-Chaoptin pozitif akson incelmesi tarafından tespit edilebilir. </li><li> Tahmini XY çap t Seto 0.35 mikron ve spot algılama &quot;Arka Plan çıkarma&quot; kapalı kontrol. </li><li> Filtre tipi &quot;Kalite&quot; yi seçin ve otomatik filtre. Sonra bitirmek tıklayın. </li><li> Diğer R aksonlar (Şekil 3B) için 3.2.1 t 3.2.5 itibaren tekrarlayın. </li></ol></li><li> R8 aksonlardaki BRP-GFP delokalizasyon düzeyini ölçmek her akson (Şekil 3C) için &quot;Surface&quot; fonksiyonu ile yüzey nesneleri oluşturmak için. <ol><li> &quot;Yeni Yüzeyler Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra elle medulla bir R8 akson terminalleri seçin. </li><li> Fotoreseptörlerin kaynak kanalını seçin. </li><li> &quot;Smooth&quot; işaretleyin. </li><li> eşik &quot;Mutlak Yoğunluk&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Enable&quot;. &quot;Tohum Noktaları Çapı&quot; 0,5 mm. </li><li> Seçin filter Tip &quot;Kalite&quot; ve &quot;voksellerdeki sayısı&quot; ve daha sonra otomasy filtreyapılsın. </li><li> &quot;Düzenle&quot; ye gidin ve diğer non-ilginç aksonlar oluşturulan yüzeylerin parçaları silin. </li><li> Diğer R akson (Şekil 3C) için 3.3.8 - 3.3.1 itibaren tekrarlayın. Not Bazı yüzey nesneleri çünkü inceliği ve M2 katmanında fotoreseptör zayıf sinyal kesildi, ama yine de baştan uç noktalarına tek bir nesne olarak kabul edildi. </li></ol></li><li> Medulla neuropil her nöron boyunca BRP-GFP puncta dağılımının tespit edilmesi, ölçüm noktası işlevi (Şekil 3D) ile başlangıç noktası ve bitiş noktası tanımlar. <ol><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve yüzey nesnelerin en kesiştiği için &quot;Nesne Surface&quot; i seçin. </li><li> sırayla M1 tabakasında R akson yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koyun. Bunlar şimdi başlangıç noktaları (Şekil 3D) olarak tanımlanır. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin.Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve yüzey nesneleri alt kesiştiği için &quot;Nesne Surface&quot; i seçin. </li><li> sırayla M3 tabakasında R akson yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koyun. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3B) gibi tanımlanmıştır. </li></ol></li><li> GFP kanalından arka plan sinyalini çıkarmak M6 tabakasının (Şekil 3E) iki R akson yüzey nesneleri, lekeler, başlangıç noktaları ve bitiş noktaları oluşturmak için. <ol><li> &quot;Yeni Yüzeyler Ekle&quot; seçeneğini seçin. </li><li> algoritma ayarlarında &quot;İlgi Segment sadece bölge&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra elle M5 ve M6 tabakası arasında bir R7 akson terminali seçin. </li><li> fotoreseptör kaynak kanalını seçin. </li><li> &quot;Smooth&quot; işaretleyin. </li><li> eşik &quot;Mutlak Yoğunluk&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Seçin filter Tip &quot;Kalite&quot; ve &quot;voksellerdeki sayısı&quot;, daha sonra otomatik olarak filtre. </li><li> &quot;Yeni Noktalar Ekle&quot; seçeneğini seçin;. </li><li> &quot;Elle düzenlemek, otomatik oluşturmayı atla&quot; seçeneğini seçin. </li><li> &quot;Nesne Merkezi&quot; seçin ve 3.5.1 oluşturulan yüzey nesnenin iç alanına bir nokta eklemek - 3.5.6. </li><li> Başka bir R7 akson terminali için 3.5.9 - 3.5.1 itibaren tekrarlayın. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin en üstünde ölçüm noktaları koydu. Bunlar şimdi başlangıç ​​noktası olarak tanımlanır. </li><li> &quot;Yeni Ölçüm Noktaları Ekle&quot; seçeneğini seçin. Daha sonra &quot;Düzenle&quot; seçin ve M6 katmanda R7 akson terminali ucu iki yüzey nesnelerin altındaki ölçüm noktaları koydu. Bunlar, artık uç noktaları (Şekil 3E) gibi tanımlanmıştır. </li></ol></li></ol> Spot sayısı 4. hesaplanması, Nokta Frekans ve Dağılımı Özelleştirilmiş Görüntü Veri Analizi Yazılımı ile BRP-GFP Zenginleştirme Düzeyi <ol><li> dosyasını kopyalayın&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; ve Imaris XT matlab klasörüne &quot;fonksiyonları&quot; klasörü. Bu çalışmada, hesaplama Matlab uygulanan özel bir eklenti ile gerçekleştirilmiştir unutmayın. Web sitesi (gelen eklentisini indirin <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> n noktalar, n yüzeyler ve 2 ölçüm noktası nesneleri, (- 3.4 3.1 hazırlanan) her biri n ölçüm noktaları ile bir veri kümesi açın. İlk ölçüm noktası nesnesi tüm akson için başlangıç ​​pozisyonları tanımlar. İkinci ölçüm noktası nesnesi tüm akson son konumu tanımlar. Her iki ölçüm noktası nesneleri ölçüm noktaları aynı sayıda (yani akson sayısı) olması gerekir. </li><li> Yürütme görüntü işleme &gt;&gt; ÖZEL&gt; sinaps algılama 6 Vs atsushis. </li><li> meta kontrol edin ve doğru olmaması halinde görüntü analiz yazılımı piksel boyutlarını değiştirin. </li><li> perf için kanal seçinnoktalar bölgeler ve sitoplazmik bölgeler (BRP-GFP ile kanal) yoğunluk analizi sergilemiş. </li><li> Sonuçları ihracat için dosya adını tanımlayın. </li><li> yüzde bidonları ve akson uzunluğu sayısını tanımlayın. &quot;10&quot; olarak bidonları ve &quot;% 100&quot; (Şekil 4A ve 4B) olarak depo aralığının numarasını girin. </li><li> BRP-GFP delokalizasyon analizi için noktalar ve diğer sitoplazmik bölgelerin bölgelerin tanımlanması. Enter noktalar &quot;0.35 mikron&quot; ve &quot;50 um&quot; olarak alanı çevreleyen genişliği olarak radius. noktalar yarıçapı (tek punktumdan merkezli 0.35 mikron çapında) puncta GFP sinyali için bölgeyi tanımlar. Alanı çevreleyen genişliği sitoplazmik alanında GFP sinyali bölgesini tanımlayan (punktumdan merkezli 50 mikron çaplı, ancak R8 dahil ve sitoplazmasında tüm nokta alanlar hariç) (Şekil 4A ve 4C). </li><li> tüm nöron maskeleri işlenir kadar bekleyinve PDF dosyaları (Şekil 4B ve 4C) ve bir elektronik tablo içinde daha fazla analiz için bir csv tablo olarak ihraç etti. csv tablo noktaların sayısını, &quot;sitoplazmik alanı&quot; ve tüm R8 akson her bin &quot;spot&quot; maksimum sinyal yoğunluğu ortalama sinyal yoğunluğu içerir. </li><li> arka plandaki sinyal çıkarıldıktan için 3.5 hazırlanmış bir veri kümesi açın. </li><li> 4.9 - 4.3 den açıklandığı gibi görüntü işleme gerçekleştirin. </li><li> Toplam sayısının ortalamasını ve bir tablo (Şekil 4D ve 4E) &#39;de BRP-GFP puncta dağılımını hesaplayın. </li><li> Arka plan sinyali ortalama yoğunluğu ile çıkarılır &quot;spot&quot; maksimum yoğunluğu bölü &quot;sitoplazmik alan&quot; ortalama yoğunluk oranı ile bir elektronik tablo BRP-GFP sinyali yerel olmaktan ortalamasını hesaplayın (Şekil 4F) . </li></ol>

<ol><li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Pools+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Pools and Dynamics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).</li>
<li>Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BSynaptic+vesicles+and+pouches+at+the+level+of+%26%2334%3Bactive+zones%26%2334%3B+of+the+neuromuscular+junction%5D%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">[Synaptic vesicles and pouches at the level of &#34;active zones&#34; of the neuromuscular junction].</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).</li>
<li>Schoch, S., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of the presynaptic active zone.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794257">The Presynaptic Active Zone.</a> Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).</li>
<li>Owald, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627301001854">Assembling the presynaptic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+the+presynaptic+cytomatrix+upon+homeostatic+adaptation+to+network+activity+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing.</a> J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).</li>
<li>Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+alterations+of+the+active+zone+lead+to+sustained+changes+in+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).</li>
<li>Spangler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liprin-alpha2+promotes+the+presynaptic+recruitment+and+turnover+of+RIM1%2FCASK+to+facilitate+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission.</a> J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).</li>
<li>Sugie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Remodeling+of+the+Presynaptic+Active+Zone+of+Drosophila+Photoreceptors+via+Activity-Dependent+Feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback.</a> Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).</li>
<li>Sigrist, S. J., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+plasticity+of+the+cytoplasmic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+zone+assembly+and+synaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Active zone assembly and synaptic release.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly%2C+Ca2%2B+channel+clustering%2C+and+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li>
<li>Hallermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+dense+bodies+provoke+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Naked dense bodies provoke depression.</a> J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).</li>
<li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+protein+with+homology+to+ELKS%2FCAST%2C+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+labeling+of+synapses+in+vivo+through+synaptic+tagging+with+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination.</a> Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Danielson, E., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynPAnal%3A+software+for+rapid+quantification+of+the+density+and+intensity+of+protein+puncta+from+fluorescence+microscopy+images+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons.</a> PLoS One. 9 (12), e115298(2014).</li>
<li>Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-guided+automatic+three+dimensional+synapse+quantification+for+drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons.</a> BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+reconstruction+of+3D+neuron+structures+using+a+graph-augmented+deformable+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model.</a> Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).</li>
<li>Sturt, B. L., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+synaptic+fluorescence+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li>
<li>Kremer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+long-term+changes+at+mushroom+body+input+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural long-term changes at mushroom body input synapses.</a> Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).</li>
<li>Mosca, T. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+Drosophila+antennal+lobe+and+its+regulation+by+the+Teneurins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins.</a> Elife. 3, e03726(2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17487202">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732(2013).</li>
<li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu çalışmada, biz eşit bir ışık yoğunluğu sinekler ortaya çıkarmak için ışık koşulları nasıl hazırlanacağını gösterdi. Sizlere sadece bir sinaptik işaretleyici puncta sayısını sayısal hem de mekansal akson boyunca sinaps yoğunluğu gidermek ve sitoplazmik alanlarda işaretleyici protein delokalizasyon düzeyini ölçmek olabilir. Bu üç değerlendirmeler bizi farklı çevre koşullarında tek nöron düzeyinde sinaptik dinamikleri ayrıntılarını değerlendirmek için izin verir. Bizim protokol farklı sinaptik proteinlere, aynı zamanda ...

<html> sinaptik fonksiyon modülasyonu tam yanıt ya da çevresel uyaranlara değişen uyum sinir sisteminin olağanüstü yeteneği katkıda bulunur. Presinaptik vezikül bırakma olasılığını ayarlanması sinaptik gücü 1 kontrol etmenin bir yoludur. Sinaptik vezikül salım aktif bölge (AZ), presinaptik zar 2&#39;nin özel bir bölgede yer alır. AZ spesifik proteinlerin 3&#39;ün bir kaset, 4 ile karakterize edilir. AZ montaj katkıda Çoğu protein son derece nematod, böcek ve memelilerde 5 korunmuştur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal aktivite düzeyi da hem in vitro ve in vivo 6, 7 fonksiyonel çıkışının düzenlenmesine katkıda AZ, moleküler yapısı düzenleyen düşündürmektedir&gt; 8. Biz daha önce fotoreseptör AZS doğal ortam ışığı 9 uzun süre maruz kaldıktan sonra Drosophila moleküler biçimlenme geçmesi bulundu. Bu durumda biz Bruchpilot (BRP) -pozitif AZS sayısı fotoreseptör aksonlar indirgendi görülmektedir. BRP / CAST / ELKS ailesi proteinleri omurgalı ve omurgasız sinapsların 10 AZS temel yapı taşlarıdır. Drosophila BRP mutantlar, vezikül açıklaması, 12 11 bastırılır uyarılmış. BRP 17 C-terminali amino asit kalıntıları Drosophila nöromüsküler bileşke (NMJ) 13, 14 sinaptik vezikül Kümelenme için gereklidir. Bu çalışmalar AZ organizasyon ve fonksiyonunda bu molekülün merkezi rolünü göstermiştir. Rekombinasyon (Star), BRP ile son zamanlarda geliştirilen genetik aracı Synaptic Etiketleme ileendojen ekspresyon düzeyleri ve tek bir sinaps çözünürlüğü 15 de, belirli bir hücre tiplerinde in vivo gözlenebilir. Bu araç, bu mümkün nicel olarak karmaşık, merkezi sinir sisteminde sinaps endojen dinamiklerini analiz kolaylaştırır. konfokal mikroskopi elde edilen verilere dayalı sinaps sayımsal dahil olmak üzere çeşitli çalışmalar yapılmıştır. Sinaptik değişiklikler uzunluk, alan, hacim, yoğunluk ölçümü ve gelişmiş yazılım uygulamalarına dayalı sayısını sayarak değerlendirilmiştir. Örneğin, ücretsiz ImageJ toplam sinaptik alan ve Drosophila NMJ 16 sinaptik yoğunluk ölçümleri için bir miktar yöntemi sağlar. Önceden ve postsinaptik belirteçlerinin ko sitelerin sayısı ImageJ yazılım platformu 17 mevcut eklenti &quot;puncta Analyzer&quot; kullanılarak sayısal edilmiştir. Seçenek olarak ise, bir multi-paradigm sayısal işlem ortamı tabanlı program, Synapse Dedektörü (SYND), otomatik olarak bir floresan işaretleyici ile etiketli nöronların dendritler iz ve ardından hücre gövdesine 18 mesafenin bir fonksiyonu olarak sinaptik protein düzeyleri rakamlarla olabilir. Yazılım Sinaptik puncta Analizi (SynPAnal) konfokal veya floresan mikroskobu elde nöronların 2D görüntüler hızlı analizi için özel olarak tasarlanmıştır. Bu yazılımın ana işlevi protein puncta 19 yoğunluğu ve şiddeti otomatik ve hızlı miktar olduğunu. Son zamanlarda, otomatik öğrenme bazlı sinaps algılama algoritması 3D Görselleştirme Destekli Analizi (Vaa3D) Yazılımın 21 yararlanarak, 3D 20 sinaptik sayısının ölçümü için oluşturuldu. Ticari görüntü analiz yazılımı da sinaptik sayımsal için güçlü araçlardır. Örneğin, flüoresanetiketli nörotransmiter reseptörleri veya presinaptik AZ bileşeni C. tek sinaps çözünürlüğü 22 elegans veya sinapsların yüzlerce izin Drosophila koku sistemi 23, 24, hızla tek bir numune içinde karakterize edilmesi ile üç boyutlu olarak sayısal edilmiştir. Burada, özel bir görüntü analiz yazılımı tarafından bir yöntem mevcut plug-in sayıları, dağıtım ve moleküler bileşenleri zenginleştirme düzeyine dahil AZS yarı otomatik olarak birden fazla yönlerini analiz sağlayan bir çoklu-paradigma sayısal bilgi işlem ortamında uygulanan AZ. Bu nedenle, bu karmaşık analiz, farklı çevresel koşullar altında akson terminallerinde bileşenlerin dinamiklerini değerlendirmek için bize izin verdi. Biz yetişkin sinek Fotoreseptörlerin çıkış sinaps üzerinde ışığa maruz kalma etkisi araştırıldı. Prosedür üç adımda gerçekleştirilir: 1)ışığa maruz kalma, 2) diseksiyon, immünhistokimya ve konfokal görüntüleme, ve 3) görüntü analizi için hazırlık.

<table><tbody><tr><td>Flakon</td><td>Hightech, Japonya</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Fiş</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, ABD</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik reçineden yapılmış özelleştirilmiş şeffaf raf&nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japonya</td><td></td><td>41 cm yükseklik, 21 cm taban, 4 cm kalınlık ve her basamak için 13 cm yükseklik</td></tr><tr><td>Soğuk kuluçka makinesi</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japonya</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>LED panel</td><td>MISUMI, Japonya</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Dijital ışık ölçer</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Sineklik</td><td>Tokken, Japonya</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Almanya</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablet</td><td>Takara, Japonya</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japonya</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL tüp</td><td>Sarstedt, Almanya</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit %16</td> <td>NEM, Japonya</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Makinesi P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anti-chaoptin antikoru</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-konjuge anti-fare antikoru</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaj Ortamı Vektör</td><td>Laboratuvarları, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lamı (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamel (18 x 18 mm, 0,17 mm)</td><td>Zeiss, Almanya</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Endüstriyel Mikroskoplar</td><td>Olympus, Japonya</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop Aydınlatması</td><td>Olympus, Japonya</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>konfokal mikroskopi</td><td>Zeiss, Almanya</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, İsviçre</td><td></td><td>Sürüm 7.6.4 veya üzeri</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac için Excel&nbsp;</td><td>Microsoft Bilişim Sistemleri</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

synaptic modülasyon analizi<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra fotoreseptörler

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

sinir sistemi adapte ve çeşitli uyaranlara yanıt olağanüstü bir yeteneği vardır. Bu sinir ayar ölçüde sinaptik düzeyde plastisite ile elde edilir. Aktif bölge (AZ) nörotransmitter salımını aracılık ve iskele proteinlerinin yoğun bir toplama oluşan presinaptik membran bölgedir. Drosophila melanogaster AZS (Drosophila) fotoreseptör doğal ortam ışığına uzun süreli maruz kalma sonrasında moleküler biçimlenme geçmesi. Böylece nöronal aktivitenin düzeyi AZ moleküler kompozisyonu yeniden ve işlevsel çıktı düzenlenmesine katkıda bulunabilir. Immünohistokimyaya ışığa maruz kalma set-up hazırlanmasından başlayarak, bu protokol numarası, mekansal dağılımı ve Drosophila fotoreseptörlerde AZS sinaptik moleküllerin delokalizasyon seviyesini ölçmek için nasıl ayrıntıları. görüntü analizi sof kullanmayazılımlarını, GFP-kaynaşık AZ bileşeni Bruchpilot kümeleri her R8 fotoreseptör (R8) akson terminal belirlenmiştir. Algılandı Bruchpilot noktalar otomatik olarak bireysel R8 akson ayrıldı. akson boyunca nokta frekans dağılımını hesaplamak için, biz bir özel yazılım eklentisi uyguladı. Her aksonun başlangıç ​​noktası ve bitiş noktası elle tanımlanmış ve her Bruchpilot nokta pozisyonu başlangıç ​​ve bitiş noktası arasındaki bağlantı hattı yansıtılıyor edildi. Bruchpilot küme sayısına yanı sıra, kümeler içinde Bruchpilot-GFP delokalizasyon düzeyini sayılabilir. Bu ölçümler farklı çevresel koşullar altında tek bir nöron mekansal çözüme sinaptik dinamikleri uyaranlara ayrıntılı olarak yansıtmaktadır.

Drosophila bileşik göz ~ 780 ommatidia içermektedir, fotoreseptör içeren her sekiz türleri (R1-8). R7 ve R8 proje, katmanlar M6 ve M3, sırasıyla 26 yılında sinaps oluşturan ikinci optik ganglion, medulla, onların aksonları. Fotoreseptör R8 aktif bölgeleri moleküler kompozisyonu üzerine ışığa uzun süre maruz kalma etkisini araştırmak için, biz Star Yöntem 15 yararlandı. BRP endojen ifade seviyeleri floresan sens-FLP türetil...

Burada sayı ve Drosophila melanogaster fotoreseptör sinaptik aktif bölgelerin mekansal dağılımını ölçmek için nasıl göstermek, genetik olarak kodlanmış moleküler işaretleyici ile vurgulanır ve ışığa uzun süreli maruz kalma sonrasında kendi modülasyonu.

Synaptic Modülasyon Analizi<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Bu deneysel prosedürün genel amacı, farklı aktivasyon koşulları altında tek bir nöründeki sinaptik dinamikleri anlamaktır. Bu yöntem, nöron aktivitesinin olgunlaşması üzerine sinapsların moleküler kompozisyonundaki değişikliklerin ortaya çıkarılması gibi, sinaptik plastisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; sinapsların sayısı, dağılımı ve sinapslar sonrası moleküler bileşenlerin zenginleşme düzeyi dahil olmak üzere sinapsların birden fazla yönünün yarı otomatik olarak analiz edilmesine olanak tanımasıdır.Bu deney için, sinekleri eclosion sonrası altı saat içinde normal viallere toplayın. Toplama viallerini şeffaf akrilik bir rafa yerleştirin. 25 degrees celsius'e ayarlanmış küçük bir inkübatörde, rafı ışık maruziyetinin ortalama 1000 lux olduğu bir LED panelden belirli bir mesafeye konumlandırın.Ardından, sinekleri aşağıdaki koşullardan birini kullanarak bir ila üç gün boyunca yetiştirin: sürekli karanlık, 12 saat ışık ve ardından 12 saat karanlık veya sürekli ışık. Daha sonra, standart teknikleri kullanarak beyinleri diseke edin ve boyayın. Sinek beyinlerini monte etmek için, bir mikropipeti montaj medyumu ile doldurun ve bir mikroskop lamının merkezine, aralarında yaklaşık 2 cm mesafe olacak şekilde iki adet 2 µL damla damlatın.Her damlanın üzerine bir lamel yerleştirin ve boşluğu yaklaşık 0.2 mm seviyesinde bırakın. Ardından, lamellerin üzerine ve boşluğa 15 µL montaj medyumu damlatın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, beyni mikropipet kullanarak boşluğa yerleştirin.Ardından beyinleri, ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Son olarak, bir lamelle kapatın ve kenarlarını şeffaf oje kullanarak mühürleyin. Beyinler daha sonra, 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için standart teknikler kullanılarak görüntülenebilir.Bu vakada, yıldız yöntemi kullanılarak aktif Brp ekspresyonuna sahip hücrelerde GFP lüminesansı belgelenmiştir. Ayrıca bu örnekte, R7 ve R8 fotoreseptör aksonları anti-ciaoptin ile immünlekelenmiş ve RFP etiketli sekonder antikorlar kullanılarak görüntülenmiştir. Brp GFP punktalarının sayısını, dağılımını ve delokalizasyon seviyesini nicelleştirmek için öncelikle görüntü yığınlarından oluşturulan beynin yeniden yapılandırılmış 3D görüntülerini yükleyin.Brp punctaları beyaz renkte gösterilmiştir. Şimdi, ilgi bölgesini belirleyin. Bu durumda, R8 aksonunun terminalleri, anticiaoptin pozitif aksonların M3 medulla tabakasına giriş noktasındaki incelmesi takip edilerek bulunur.Her bir R8 akson terminalindeki Brp GFP noktalarını nokta tespit modülünü kullanarak tanımlayın. Yeni noktalar ekle seçeneğini belirleyin, ardından algoritma ayarlarından yalnızca ilgi alanı bölgesini segmente et seçeneğini seçin. Analiz bölgesi tanımlandıktan sonra, kaynak kanalı Brp GFP olarak ayarlayın ve tahmin edilen XY çapını 0.35 micron olarak belirleyin.Ardından, nokta tespitindeki (spot detection) arka plan çıkarma (background subtraction) seçeneğini işaretleyin. Sonra, filtre tipi olarak kaliteyi (quality) seçin; böylece puncta'lar otomatik olarak filtrelenir. Bitir (finish) düğmesine tıklayarak bu adımı tamamlayın.Veri setindeki tüm R8 aksonları için nokta tespit yöntemini tekrarlayın. Belirlenecek bir sonraki bölge akson sitoplazmasıdır. Öncelikle, surface fonksiyonu ile yüzey nesneleri oluşturun.Ardından, yeni yüzeyler ekle seçeneğini belirleyin ve algoritma ayarları altında, yalnızca ilgi alanını segmente et seçeneğini etkinleştirin. Şimdi, ilgi alanını manuel olarak seçin. Sonrasında, hesaplama parametrelerini ayarlayın.Fotoreseptör kanalını kaynak olarak belirlemek için "smooth" seçeneğini seçin. Eşik değeri için "absolute intensity" seçeneğini belirleyin. "split touching objects" seçeneğini etkinleştirin.Oturma noktaları çapını 0.5 mikron olarak ayarlayın ve kalite ile voksel sayısı için varsayılan filtre ayarlarını kullanın. Ardından filtre otomatik olarak uygulanır. Şimdi, düzenle kısmına giderek ilgi alanı dışında oluşturulan yüzey parçalarını silin.Bu durumda, diğer aksonlar için de aynı işlem uygulanır. Veri setindeki tüm R8 aksonları için akson bölgesi tespiti tekrarlandıktan sonra, tüm Brp puncta'ları ve R8 aksonları bir dizi nokta nesnesi olarak tanımlanır. Karşılık gelen sitoplazmik bölgeler ise yüzey nesneleri olarak tanımlanır.Şimdi, her bir aksonun yönelimini ve alanını manuel olarak tanımlayarak devam edin. Bu işlem, medulla nöropilindeki her bir nöron boyunca Brp GFP yoğunluğunun daha sonraki aşamalarda nicel olarak belirlenmesi için önemlidir. Bunu yapmak için öncelikle başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın.Yeni ölçüm noktaları ekle seçeneğini seçin, ardından düzenle seçeneğini ve sonrasında yüzey nesneleriyle çalışmak için nesne yüzeyini seç seçeneğini belirleyin. Başlangıç noktalarını tanımlamak için, M1 tabakasındaki R aksonlarının tüm yüzey nesneleri üzerine ölçüm noktaları yerleştirin. Bu noktaları sistematik ve tekrarlanabilir bir sırayla yerleştirin.Ardından, bitiş noktalarını tanımlayın. Yeni ölçüm noktaları ekle, düzenle ve tekrar nesne yüzeyi seçeneklerini belirleyin. Daha sonra, aynı sistematik sırayı tekrarlayarak, M3 tabakasındaki R aksonlarının altına ölçüm noktaları yerleştirin.Brp arka plan yoğunluğunu nicelendirmek için, iki R7 aksonunun sitoplazmik bölgelerini analiz edin. "add new surfaces" seçeneğini belirleyin ve R8 aksonları için yapıldığı gibi bir R7 aksonunun bölgesini manuel olarak tanımlayın. "enable split touching objects" seçeneğini etkinleştirmemek dışında aynı ayarları kullanın.Bunu kapalı bırakın. Ardından, tanımlanmış bir R7 akson bölgesinin içine sahte bir noktalar nesnesi ekleyin. "Yeni noktalar ekle"yi seçin, "otomatik oluşturmayı atla" seçeneğini belirleyin ve manuel olarak düzenleyin.Ardından, nesnenin merkezini seçin ve dummy spots nesnesini R7 aksonunun içine yerleştirmek için yüzey nesnesine tıklayın. Şimdi, ikinci bir R7 aksonu için yüzey ve nokta tespit adımlarını tekrarlayın. Daha sonra, R8 aksonlarında yapıldığı gibi R7 aksonlarının başlangıç ve bitiş terminal noktalarını tanımlayın.Bu analiz için, doğru yazılımın yüklü olduğundan emin olun. Nokta verilerini, yüzey verilerini ve her biri aynı sayıda ölçüm noktası içeren iki ölçüm noktası nesnesini kapsayan veri setini açın. Verileri inceleyin.Hesaplamaların çalışabilmesi için her iki ölçüm noktası nesnesinin de aynı sayıda ölçüm noktasına sahip olması gerekir. Spotlar, akson bölgeleri ile başlangıç ve bitiş noktaları tanımlandıktan sonra eklentiyi başlatın. Öncelikle meta verileri, özellikle de voksel boyutunu kontrol edin.Düzenle menüsünden görüntü özelliklerini açın, ardından geometri altındaki koordinatlar bölümünde vokselin 3 boyutunu ve mikron değerlerini kontrol edin. Sonrasında, yoğunluk analizi için bir kanal seçin. Bu örnekte, Brp GFP'yi gösteren kanal seçilmiştir.Ardından sonuçlar için dosya adını belirleyin. Sonra, bin sayısını 10 olarak tanımlayın ve akson uzunluğunu %100 olarak ayarlayın. Ardından, nokta yarıçapını 0,35 mikron ve çevre sitoplazmik bölgeyi 50 mikron olarak ayarlayarak puncta bölgelerini tanımlayın. Son olarak, sinaps tespit komutunu çalıştırın ve daha sonra elde edilen çıktıyı istatistiksel olarak analiz edin.Tanımlanan protokollerin ardından, sürekli karanlığa, sürekli ışığa veya normal bir ışık/karanlık döngüsüne maruz bırakılan sineklerin R8 sinapslarındaki Brp GFP punktaları analiz edildi. Sürekli ışıkta tutulan sineklerin R8 fotoreseptörlerinde Brp punktalarının sayısı önemli ölçüde azalmıştı. Punktaların dağılımı, özel bir eklenti kullanılarak hesaplandı.R8 sinapsları M1'den M3 tabakasına kadar aksonal şaft boyunca dağılmıştı, ancak yoğunlukları M1 ve M3 tabakalarında daha yüksekti. Benzer şekilde, puncta'ların delokalizasyon seviyeleri hesaplandı. Tüm koşullarda bunlar değişmedi, ancak Brp GFP'nin delokalizasyon seviyeleri, sabit ışık altında belirgin şekilde difüze olan Brp-short-cherry gibi diğer raporörlerden farklılık gösterdi.AZ'den ayrıldıktan sonra Brp kısa fragmanının uygunsuz bir şekilde işlenmesi mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir nörondaki sinaptik plastik özelliklerin nasıl analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu plastik özellikler arasında sinaps sayısı, bunların dağılımı ve sinapslardan sonra spesifik bir moleküler bileşenin zenginleşme etiketi yer almaktadır.

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu prosedür sinaptik potansiyeller, nöromüsküler bileşke (NMJ) ışık darbeleri ile uyandırmak için mavi bir ışık ile aktive alg kanal ve hücre spesifik genetik ifade araçları...

Synaptic Potansiyellerinin Channelrhodopsin2 aracılığı Uyarım Drosophila Nöromüsküler Kavşaklar

Bu video, hareketsiz hale getirilmiş bir Drosophila'nın gözündeki fotoreseptör aktivitesinin elektrofizyolojik kaydı için protokolü ana hatlarıyla belirtir ve ışık uyaranlarına yanıt olarak voltaj değişikliklerinin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar.

Drosophila Retinal Fotoreseptörlerinin Işık Uyaranlarına Voltaj Yanıtlarının Elektrofizyolojik Kaydı

Bu video, beyaz gözlü Drosophila'da uzun süreli depolarize edici artpotansiyel (PDA) araştırmak için deneysel bir protokolü göstermektedir. Sineğin gözü, fotopigment rodopsini metarhodopsine dönüştürmek için yoğun mavi ışık darbelerine maruz bırakılır ve pozitif iyon kanallarını açan ve membran depolarizasyonuna neden olan bir sinyal kaskadı başlatır. Mavi ışık, metarhodopsinin rodopsine yeniden dönüşümünü önlediğinden, pozitif iyonların sürekli akışı, uzun süreli depolarize edici son...

Drosophila Fotoreseptörlerinde Uzun Süreli Depolarizan Afterpotential (PDA) Araştırılması

Bu video, Bruchpilot proteinlerinin nörotransmitter salınımındaki rolünü ve bunun sonucunda ortaya çıkan sinaptik aktivite modülasyonunu incelemek için Drosophila melanogaster'in belirli ışık koşulları altında yetiştirilmesini göstermektedir.

Uzun Süreli Işığa Maruz Kaldıktan Sonra Drosophila'da Sinaptik Modülasyon

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Burada Drosophila larva için bir ışık-karanlık tercih testi açıklar. Bu testte ışık algılama ve işleme photobehavior doğuştan gelen ve sirkadiyen düzenleme hakkında bilgi sağlar.

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Keskin mikroelektrotlar, canlı Drosophila'da fotoreseptörün ve görsel internöron çıkışının doğru elektrofizyolojik karakterizasyonunu sağlar. Burada, tek tek hücrelerin kontrollü ışık stimülasyonuna yüksek kaliteli voltaj tepkilerini kaydetmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Bu yöntem, böcek bileşik gözlerinde nöral bilgi işlemeyi incelemek için idealdir.

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Öğrenin, Drosophila melanogaster fotoreseptörlerinde uzun süreli ışığa maruz kalmanın sinaptik aktif bölgeler üzerindeki etkilerini niceliksel olarak analiz etme yöntemini. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöronal dinamikleri anlamak için değerli bilgiler sunar.

Synaptic Modülasyon Analizi

Daha fazla video keşfet