Synaptic Modülasyon Analizi Drosophila melanogaster Uzun süreli ışığa maruz kaldıktan sonra Fotoreseptörler

Bu deneysel prosedürün genel amacı, farklı aktivasyon koşulları altında tek bir nörondaki sinaptik dinamikleri anlamaktır. Bu yöntem, nöronun aktivitesinin olgunlaşması üzerine sinapsların moleküler bileşimindeki değişiklikleri ortaya çıkarmak gibi sinaptik plastisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sinapsların sayısı, dağılımı ve sinapslardan sonra moleküler bileşenlerin zenginleştirme seviyesi dahil olmak üzere sinapsların birçok yönünün yarı otomatik analizine izin vermesidir.

Bu deney için, sinekleri eklosiyondan sonraki altı saat içinde normal şişelere toplayın. Toplama şişelerini şeffaf bir akrilik rafa yükleyin. 25 santigrat dereceye ayarlanmış küçük bir inkübatörde, rafı, ışığa maruz kalmanın ortalama 1000 lux olduğu bir LED panelden belirli bir mesafeye yerleştirin.

Ardından, sürekli karanlık, 12 saat ışık ve ardından 12 saat karanlık veya sabit ışık olmak üzere aşağıdaki koşullardan birini kullanarak bir ila üç gün boyunca arkadan uçar. Daha sonra, standart teknikler kullanarak beyinleri inceleyin ve boyayın. Sinek beyinlerini monte etmek için, montaj ortamına sahip bir mikropipet yükleyin ve yaklaşık 2 cm aralıklarla bir mikroskop lamının ortasına iki adet 2 mikrolitrelik damla bırakın.

Her damlanın üzerine bir kapak fişi yerleştirin ve yaklaşık 0,2 mm arasındaki boşluk bırakın. Daha sonra 15 mikrolitre montaj ortamını kapak kızaklarının üzerine ve boşluğa bırakın. Diseksiyon mikroskobu altında, beyni mikropipetten gelen boşluğa yatırın.

Ve sonra beyinleri ventral tarafı yukarı gelecek şekilde konumlandırın. Son olarak, bir kapak fişi takın ve şeffaf oje kullanarak kenarları boyunca kapatın. Beyinler daha sonra 3D görüntüleri yeniden oluşturmak için standart teknikler kullanılarak görüntülenebilir.

Bu durumda, GFP lüminesansı, yıldız yöntemi kullanılarak aktif Brp ekspresyonu olan hücrelerde belgelenir. Ayrıca bu örnekte, R7 ve R8 fotoreseptör aksonları, RFP etiketli ikincil antikorlar kullanılarak görüntülenen antisiyaoptin ile immünobilize edildi. Brp GFP puncta'nın sayısını, dağılımını ve delokalizasyon seviyesini ölçmek için önce görüntü yığınlarından yapılan beynin 3D görüntülerini yeniden yükleyin.

Brp puncta beyaz renkte gösterilir. Şimdi, ilgilendiğiniz bölgeyi bulun. Bu durumda M3 medulla tabakasına giriş noktasında antisiyaoptin pozitif aksonların incelmesi takip edilerek R8 aksonunun terminalleri yerleşir.

Her R8 akson terminalinde, nokta algılama modülünü kullanarak Brp GFP puncta'yı tanımlayın. Yeni noktalar ekle'yi seçin, ardından algoritma ayarlarında yalnızca ilgilenilen bölgeyi segmentlere ayır'ı seçin. Analiz bölgesi tanımlandıktan sonra, kaynak kanalını Brp GFP olarak ayarlayın ve ardından tahmini XY çapını 0,35 mikron olarak ayarlayın.

Ardından, nokta algılamada arka plan çıkarmayı kontrol edin. Ardından, filtre türü olarak kaliteyi seçin ve puncta otomatik olarak filtrelenir. Son'a tıklayarak bu adımı tamamlayın.

Veri setindeki tüm R8 aksonları için nokta algılama yöntemini tekrarlayın. Tanımlanacak bir sonraki bölge akson sitoplazmasıdır. İlk olarak, yüzey işleviyle yüzey nesneleri oluşturun.

Ardından, yeni yüzeyler ekle'yi seçin ve algoritma ayarları altında yalnızca ilgilenilen bölgeyi segmentlere ayırma seçeneğini değiştirin. Şimdi, ilgilendiğiniz bölgeyi manuel olarak seçin. Ardından, hesaplama çevrelerini ayarlayın.

Fotoreseptör kanalını kaynak olarak bulmak için düzgün seçeneğini seçin. Eşik için mutlak yoğunluğu seçin. Dokunan nesneleri böl seçeneğini etkinleştirin.

Koltuk noktaları çapını 0,5 mikron olarak ayarlayın ve kalite ve voksel sayısı için varsayılan filtre ayarlarını kullanın. Filtre daha sonra otomatik olarak uygulanır. Şimdi, ilgilenilen bölgenin dışında oluşturulan yüzey parçalarını düzenlemeye ve silmeye gidin.

Bu durumda, diğer aksonlar. Veri setindeki tüm R8 aksonları için akson bölgesi algılaması tekrarlandıktan sonra, tüm Brp puncta ve R8 aksonları bir dizi spot nesne olarak tanımlanır. Ve karşılık gelen sitoplazmik bölgeler yüzey nesneleri olarak tanımlanır.

Şimdi, her bir aksonun yönünü ve boşluğunu manuel olarak tanımlayarak devam edin. Bu, medulla nöropilindeki her bir nöron boyunca Brp GFP yoğunluğunun daha sonra ölçülmesi için önemlidir. Bunu yapmak için önce başlangıç noktalarını ve bitiş noktalarını tanımlayın.

Yeni ölçüm noktaları ekle'yi seçin, ardından düzenle'yi seçin ve ardından yüzey nesnelerinin üst kısmıyla çalışmak için nesnenin yüzeyini seçin. Başlangıç noktalarını tanımlamak için, M1 katmanındaki R aksonlarının tüm yüzey nesnelerine ölçüm noktaları koyun. Bu noktaları sistematik, tekrarlanabilir bir sıraya yerleştirin.

Ardından, bitiş noktalarını tanımlayın. Yeni ölçüm noktaları ekle'yi, düzenle'yi ve nesnenin yüzeyini tekrar seçin. Daha sonra, aynı sistematik sırayı tekrarlayarak, ölçüm noktalarını M3 katmanındaki R aksonlarının altına yerleştirin.

Brp arka plan yoğunluğunu ölçmek için, iki R7 aksonunun sitoplazmik bölgelerini analiz edin. Yeni yüzeyler ekle'yi seçin ve R8 aksonları için yapıldığı gibi bir R7 aksonunun bölgesini manuel olarak tanımlayın. Dokunmatik nesneleri bölmeyi etkinleştir seçeneğini açmamak dışında aynı ayarları kullanın.

Bunu bırak. Ardından, tanımlanmış bir R7 akson bölgesinin içine bir kukla noktalar nesnesi ekleyin. Yeni noktalar ekle'yi seçin ve otomatik oluşturmayı atla'yı seçin ve manuel olarak düzenleyin.

Ardından, nesnenin merkezini seçin ve kukla noktalar nesnesini R7 aksonunun içine yerleştirmek için yüzey nesnesine tıklayın. Şimdi, ikinci bir R7 aksonu için yüzey ve nokta algılama adımlarını tekrarlayın. Ardından, R7 aksonlarında olduğu gibi R8 aksonlarının başlangıç ve bitiş terminal noktalarını tanımlayın.

Bu analiz için doğru yazılımın kurulu olduğundan emin olun. Spot verilerini, yüzey verilerini ve her biri aynı sayıda ölçüm noktası içeren iki ölçüm noktası nesnesini içeren veri kümesini açın. Verileri inceleyin.

Hesaplamaların çalışması için her iki ölçüm noktası nesnesinin de aynı sayıda ölçüm noktasına sahip olması gerekir. Noktalar, akson bölgeleri ve başlangıç ve bitiş noktaları tanımlandıktan sonra eklentiyi başlatın. İlk olarak, meta verileri, özellikle voksel boyutunu kontrol edin.

Düzenle'den görüntü özelliklerini açın, ardından geometrideki koordinatlar altında voksel ve mikronun 3 boyutunu kontrol edin. Ardından, yoğunluk analizi için bir kanal seçin. Bu durumda Brp GFP'yi gösteren kanal seçilir.

Ardından sonuçlar için dosya adını tanımlayın. Ardından, kutu sayısını 10 olarak tanımlayın ve akson uzunluğunu %100 olarak ayarlayınArdından, nokta yarıçapını 0.35 mikrona ve çevreleyen sitoplazmik bölgeyi 50 mikrona ayarlayarak punkta bölgelerini tanımlayın. Son olarak, sinaps algılama komutunu yürütün ve daha sonra çıktıyı istatistiksel olarak analiz edin.

Açıklanan protokolleri takiben, Brp GFP puncta, sürekli karanlığa, sabit ışığa veya normal bir aydınlık/karanlık döngüsüne maruz kalan sineklerin R8 sinapslarında analiz edildi. Sabit ışıkta tutulan sineklerin R8 fotoreseptörlerinde Brp puncta sayısı önemli ölçüde azalmıştır. Puncta'nın dağılımı özel bir eklenti kullanılarak hesaplandı.

R8 sinapsları, M1'den M3 katmanına kadar aksonal şaft boyunca dağıtıldı, ancak yoğunlukları M1 ve M3 katmanlarında daha yüksekti. Benzer şekilde, puncta'nın delokalizasyon seviyeleri hesaplandı. Her koşulda değişmediler, ancak Brp GFP'nin delokalizasyon seviyeleri, sürekli ışık altında net bir şekilde etkisiz hale gelen Brp-short-cherry gibi diğer muhabirlerden farklıydı.

AZ'den söküldükten sonra Brp kısa parçasının uygun olmayan şekilde işlenmesi mümkündür. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir nörondaki sinaptik plastik özelliklerin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu tür plastik özellikler, sinaps sayısını, dağılımlarını ve sinapslardan sonra belirli bir moleküler bileşenin zenginleştirme etiketini içerir.