Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III)

Bu floresan bazlı testin genel amacı, manyetik rezonans görüntüleme kontrast maddeleri içeren sulu çözeltilerde toksik şelatsız gadolinyum iyonunun varlığını tespit etmektir. Bu yöntem, sentezlenen ajanların yüksek paritesini sağlamak için bir araç sağlayarak gadolinyum bazlı MRG kontrast ajanlarının kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, diğer biyolojik metal katyonlara göre nispeten yüksek seçiciliğe sahip şelatlanmamış toksik gadolinyumun submikromolar konsantrasyonunu tespit edebilmesidir.

Bu prosedüre başlamak için, test tamponunu metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın. Ardından, tamponu 0,2 mikron PES membranlı steril tek kullanımlık bir şişe üstü filtreden süzün.

Daha sonra, 497 mikrolitre tahlil tamponunu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bir mikrolitre hazırlanmış gadolinyum aptamer stok çözeltisi ve iki mikrolitre hazırlanmış QS stok çözeltisi ekleyin. Bu 2X Gadolinyum sensör çözeltisinin 50 mikrolitresini dokuz PCR tüpünün her birine aktarın.

Bundan sonra, tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Termal döngüleyiciyi, numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat dereceye ısıtacak şekilde ayarlayın, ardından çözeltileri 15 dakika boyunca yavaşça 25 santigrat dereceye soğutun. Gadolinyum iyon çözeltisini eklemeden önce 2X gadolinyum sensör çözeltilerini 95 dereceye kadar ısıtmayı ve ardından oda sıcaklığına yavaş soğutmayı unutmamak önemlidir.

Başlamak için, istenen konsantrasyonda bir gadolinyum üç stok çözeltisi oluşturmak için katı gadolinyum triklorürü tahlil tamponunda çözün. Seri seyreltme kullanarak, metin protokolünde belirtildiği gibi altı adet 100 mikrolitre gadolinyum üç çözelti hazırlayın. Bundan sonra, test edilecek kontrast maddeyi tahlil tamponunda çözün.

Üç farklı konsantrasyon hazırlamak için seri seyreltme kullanın. Ardından, 2X gadolinyum sensör solüsyonunu içeren PCR tüplerini termal döngüleyiciden çıkarın. Her gadolinyum üç çözeltisinden 50 mikrolitreyi ayrı PCR tüplerine aktarın.

Karıştırmak için her çözeltiyi birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra, her bir kontrast madde çözeltisinin 50 mikrolitresini ayrı ayrı kalan PCR tüplerine aktarın. Birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Dokuz çözeltinin tümünü oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Bundan sonra, her çözeltinin 45 mikrolitresini iki parça halinde 384 oyuklu bir plakaya aktarın. Ardından, floresan verilerini metin protokolünde belirtildiği gibi kaydedin ve analiz edin.

Bu çalışmada, şelatsız üç değerlikli gadolinyum iyonu, floresan bazlı bir yöntem kullanılarak sulu çözelti içinde tespit edilmiştir. Floresan sensör, aptamere bir florofor takılarak geliştirilmiştir. Sensör daha sonra koyu renkli bir su verme molekülü ile etiketlenen bir su verme ipliği ile hibritlenir.

Gadolinyum üç ilavesi, söndürme ipliğini aptamerden uzaklaştırarak floresan emisyonunda bir artışa neden olur. Kalibrasyon eğrileri, 100 nanomolar gadolinyum aptamer ve 200 nanomolar QS kullanılarak elde edilir ve ham floresan veya floresan kat değişimi olarak çizilir. Her iki eğri de gadolinyum için doğrusal bir aralık, bir mikromolar altındaki üç konsantrasyon ve üç mikromolar üzerindeki konsantrasyonlarda sinyalin doygunluğunu gösterir.

Daha sonra iki farklı gadoterik asit partisi sıfır milimolar ila 20 milimolar arasında değişen konsantrasyonlar için analiz edilir. Yüksek saflıktaki numunenin floresan emisyonu bu aralıkta gözle görülür şekilde artmazken, şelatsız gadolinyum üç içeren numunede beş milimolar kadar düşük konsantrasyonlarda önemli bir değişiklik gözlenir. Bu prosedürü denerken, floresan okumasını değiştireceğinden, mikroplakanın kuyucuklarında hava kabarcığı olmadığından emin olmak önemlidir.

Bu prosedürü kullanarak, kontrast maddeler içeren çözeltilerde küçük miktarlarda hesaplanmış gadolinyum iyonlarını bile tespit edebiliriz. Bu, ajanların saflığını belirlemek için iyi bir yöntem olacaktır. Kimyasallarla çalışmak tehlikeli olabilir ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması önemlidir.