Name: Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Keşfedin, toksik serbest gadolinium(III) iyonlarını sulu çözeltilerde floresans tabanlı aptamer sensörü ile nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, MRI kontrast maddelerinin güvenliğini sağlamak için submikromolar duyarlılık sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Columbia Üniversitesi, New York, NY'den Dr. Milan N Stojanovic'e değerli bilimsel katkıları için minnetle teşekkür ederiz. Bu çalışma, California Eyalet Üniversitesi East Bay (CSUEB) ve CSUEB Fakülte Destek Hibesi-Bireysel Araştırmacı tarafından sağlanan fonlarla desteklenmektedir. O.E., T.C. ve A.L., CSUEB Öğrenci Araştırma Merkezi (CSR) Bursu tarafından desteklendi.

Not: Moleküler biyoloji dereceli su Tüm tampon ve çözelti preparatlar kullanılır. Tüm atılabilir tüpleri (mikrosantrifüj ve PCR) ve pipet uçları DNase- ve RNaz-ücretsiz. Kullanmadan önce tüm kimyasalların malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) danışın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanılması önemle tavsiye edilir. Aptamer Stok çözeltiler hazırlanması 1. <ol><li> Ticari polydeoxynucleotide 2 ipliklerini satın alın. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırma her iki hat sipariş. 1 (Gd-aptamer) Strand: 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3&#39; Dizin 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / 3 &#39; </li><li> Gd-aptamer ve QS 100 uM bireysel hisse senedi çözümleri yapmak için su her telini eritin. </li><li> -20 ° C&#39;de bu çözümleri saklayın. çözümler şimdiye kadar, 3 yıl boyunca stabildir. </li><li> Freez en aza indirmek içinE-çözülme döngüleri, 10 ul alikotları stok solüsyonları saklayın. </li></ol> 2x Gd-sensör Çözüm 2. Hazırlık <ol><li> Deney tamponu hazırlayın (20 mM HEPES, 2 mM MgCI2, 150 mM NaCI, 5 mM KCI). NaOH ve HCl ile pH değeri için ~ 7.4 ayarlayın ve 0.2 um PES membran ile steril tek kullanımlık şişe üst filtreler aracılığıyla filtre. Steril şişelerde saklayın. filtre edilmiş ve (oda sıcaklığında) saklandığı takdirde, tampon, şimdiye kadar, 2 yıl stabildir. </li><li> deney tamponu 497 uL ve (adım 1.2 dan itibaren) QS stok solüsyonu 2 uL (adım 1.2 dan itibaren) Gd-aptamer stok solüsyonu 1 mcL seyreltin. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. 2x Gd sensör çözelti içindeki konsantrasyonu, sırasıyla, 200 nM ve 400 nM. NOT: - kalibrasyon eğrisi ve kontrast madde çözümleri için 3+ Gd 7 değişik konsantrasyonlarda bu adımda hazırlanan 2x Gd-sensör çözeltisinin hacmi 6 test etmek için yeterli 500 uL olduğunu(Aşama 3). Her bir numune, 384 oyuklu plaka çoğaltma kaynaklarıdır verecektir. <ol><li> Test edilmelidir GD 3+ çözümlerin sayısına göre 2x Gd-sensör çözümünün ses seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> Her tüpe 50 uL ile 9 PCR tüpleri içine 2x Gd-sensör çözüm aktarın. bir termal döngü tüpler yerleştirin. </li><li> 95 ° C&#39;ye kadar tüplere çözelti ısı termal döngü programı alan 5 dakika tutun ve daha sonra yavaş yavaş oranında (15 dakika ~ boyunca 25 ° C&#39;ye kadar soğumaya çözüm ~ 0,05-0,1 ° C / s). Isıtma ve soğutma çevrimi Gd-aptamer ve QS arasında optimal hibridizasyon sağlamaktır. eksik söndürme ve sensör daha yüksek bir eşiğe Kısmi melezleme sonuçları. Bir termal döngü cihazı kullanılabilir durumda değilse, bunun yerine sıcak su banyosu kullanılarak bu süreci yürütmek. </li><li> Bir kez 25 ° C&#39;ye kadar soğutuldu, hemen çözüm kullanmak, veya hazır olana kadar (yaklaşık 2 saat kadar) termal döngüleyici içinde tutmakKullanılmış. Bir su banyosu ısısı için kullanıldığında, su yavaş yavaş oda sıcaklığına soğurken, banyo tüpleri bırakın. </li></ol> 3. Floresan Kalibrasyon eğrisi oluşturmadan ve Gd kontrast maddesi çözeltisi içinde 3+ Unchelated Gd varlığını tespit <ol><li> Deney tamponu içinde bir katı GdCl 3 (adım 2.1 ile aynı tamponu) içinde çözülür. </li><li> Seri seyreltme yoluyla, kalibrasyon eğrisi (2x çözümleri) için nihai istenen konsantrasyonlarda iki katı 100 uL mikrosantrifüj tüpler 6 farklı Gd 3+ çözümleri her hazırlamak. <ol><li> Örneğin, 0 bir kalibrasyon oluşturmak için, 50, 100, 200, 400 (Resim GdCl 3 sadece tampon), ve Gd 3+ 800 nM, 0, 100, 200, 400, 800, 1600 nM içeren çözeltiler hazırlanması iyonu. Emin negatif kontrol olarak 0 nM Gd 3+ ile &#39;boş&#39; her zaman dahil olun. </li></ol></li><li> Test için kontrast ajanı çözülürdeney tamponu içinde ed. Seri seyreltme ile kontrast maddesi çözeltilerinin 2 ya da 3 farklı konsantrasyondan hazırlayın. NOT: kontrast madde solüsyonu 3 farklı konsantrasyonlarda test tavsiye edilir. Bu durum, bu konsantrasyon, doğrusal aralığı içinde olduğunu sağlamaktır. doğrusal bir ilişki göstermez test örnekleri, kontrast madde konsantrasyonlarını azaltmak durumunda kullanılır. </li><li> termal döngü dışına adım 2.5 den 2x Gd-sensör çözeltisi içeren PCR tüpleri atın. </li><li> 2x Gd-sensör çözeltisi içeren 9 PCR tüpleri 6 içine adım 3.2 her Gd 3+ çözeltisi 50 uL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Her bir PCR tüpü artık istenen Gd 3+ konsantrasyonunu test etmek için, 100 nM Gd-aptamer ve 200 nM QS içerir. </li><li> 2x Gd-sensör çözeltisi içeren Kalan PCR tüpleri için, adım 3,3 kontrast madde çözümleri 50 mcL ekleyin. yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın. </li><li> s inkübeOda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika için PCR tüplerine Çözeltileri. En fazla 30 dakika süreyle beklemeye bırakıldı olabilir. </li><li> 384 oyuklu bir plakaya her bir tüpe 45 uL aktarın. Her bir PCR tüpü yinelenen kuyu verecektir. </li><li> Bir levha okuyucu üzerinde her bir floresan kaydedin. tedarikçinin Web sitesinde listelenen Gd-sensör tasarımında kullanılan fluorofor (FAM), sırasıyla 495 ve 520 nm eksitasyon ve emisyon maxima vardır. levha okuyucu monochromator- veya filtre bazlı olmasına bağlı olarak, uygun eksitasyon ve emisyon dalga boylarını veya filtreler seçin. </li><li> Gd 3+ konsantrasyonuna karşı keyfi floresan birimlerinin (AFU) floresan grafiği çizilir. </li><li> Gd 3+ konsantrasyonuna karşı floresan kat değişikliği olarak grafik çizilir. (Gd 0 nM 3+) ile &#39;boş&#39; çözümün AFU her konsantrasyon AFU bölerek floresan katlık değişime hesaplayın. floresan kat değişim n sağlayacaktırSonuçların ormalization, AFU ekran bazı periyodik (farklı günlerde, vb) varyasyonlar gerekir. </li><li> 0 nM GdCl 3 (sadece tampon) içeren çözüm kontrast maddeyi içeren çözeltinin ve &#39;boş&#39;, floresan emisyonunu karşılaştırın. Not: GBCA çözeltisinin bir daha yüksek floresans kontrast madde, daha fazla saflandırma gerektirebilir unchelated Gd 3+ varlığını ima eder. Unchelated Gd 3+ miktarı, adımı 3.10 veya 3.11 inşa kalibrasyon eğrisi kullanılarak tahmin edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Aptamer göre Gd-sensörü, gözlenen unchelated Gd 3+ konsantrasyonu ile orantılıdır flüoresan emisyonunda bir artışa kullanılması. Kullanılan örnek miktarı en aza indirmek için, deney, göz başına 45 uL toplam numune hacmi olan bir 384-çukurlu bir mikrolevhadaki çalıştırılabilir. Bu tasarımda, floresein (FAM) ve DABCYL (Dab) seçimi öncelikle reaktiflerin maliyeti dayanmaktadır; emisyon dalga boyu, floroforun farklı eşleştirme değiştirme ve söndürücü 11 kullanılabilir. Bu s...

Tekniğin doğal duyarlılığı ile sınırlıdır klinik tanı, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) artan önemi, yeni gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBKM&#39;lerin) 1 geliştirilmesine yönelik araştırma hızlı büyüme sonuçlandı. GBKM&#39;lerin görüntü kalitesini artırmak için tatbik edilmektedir moleküllerdir ve bunlar genellikle çok dişli bir ligand ile koordine bir üç değerli gadolinyum iyonu (Gd 3+) kimyasal yapıya sahiptir. Bu kompleksleşme toksik 3+ unchelated Gd gibi kritik öneme sahiptir; böbrek hastalığı veya yetmezliği 2 olan bazı hastalarda nefrojenik sistemik fibrozis gelişiminde rolü olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, sulu serbest iyon tespit GBKM&#39;lerin güvenliğini sağlamada etkili olduğunu. GBCA Çözeltilerin unchelated Gd 3+ varlığı genellikle ligand ve iyon kompleksinin ayrışma veya displacemen arasında bir tam olmayan reaksiyon sonucudiğer biyolojik metal katyonları 3 ile t. Şu Gd 3+, çok yönlülük ve uygulanabilirliği 4 açısından kromatografi ve / veya spektrometre en yüksek değerli dayalı olanlar varlığını tespit etmek için kullanılan çeşitli teknikler arasında. Onların güçlü yanları arasında yüksek hassasiyet ve doğruluk, (bir liste ve çoklu Gd 3+ komplekslerin eşzamanlı ölçümü (insan serumu 5, idrar ve saç 6, atıksu 7 ve kontrast ajan formülasyonları 8 dahil) çeşitli numune matrisleri analiz yeteneği olan çalışmaların 2013 öncesinde Telgmann ve diğ.) 4 kapsamlı bir inceleme açıklanmaktadır. Tek dezavantajı bu yöntemlerden birkaç bazı laboratuvarlar erişimi olmayabilir (örneğin indüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi gibi) instrumentations 4 gerektirir olmasıdır. araştırma ve kanıt-of-concept seviyelerinde, ar de roman GBCA keşif kapsamındaelatively daha rahat, hızlı ve uygun maliyetli spektroskopik tabanlı bir yöntem (örneğin UV-Vis absorpsiyon veya floresan gibi) değerli bir alternatif olarak hizmet verebilir. Akılda bu uygulamalar sayesinde, sulu Gd 3+ için bir floresan aptamer tabanlı sensör 9 geliştirilmiştir. Aptamer (Gd-aptamerin) üstel zenginleştirme (SELEX) 9 tarafından ligandların sistematik evrim süreci boyunca izole edildi bazların spesifik dizisi ile bir 44 baz uzunluğunda tek iplikli bir DNA molekülüdür. Floresan sensör içine aptamer uyarlamak için, bir flüorofor, sonra 13 tamamlayıcı bazlar (Şekil 1) aracılığı ile su verme telinin (QS) ile hibridize olan telin, 5 &#39;ucuna eklenir. QS 3 &#39;ucunda bir karanlık söndürücü molekülü ile etiketlenir. 1 oluşan Gd 3+, sensör (Gd-sensör) yokluğunda, sırasıyla: Gd-aptamer ve QS 2 mol oranı, en az floresans emisyon nedeniyle t olacaktırquencher için fluorofordan o enerji transferi. Sulu Gd 3+ eklenmesi floresan emisyonunda bir artışa neden, Gd-aptamer gelen QS ettirilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> Floresein (bir fluorofor) ve DABCYL ile etiketlenmiş 13 baz uzunluğunda söndürme iplikçik (QS) ile etiketlenmiş 44 baz uzunluğunda aptamer (Gd-aptamer) (koyu söndürücü) oluşur Şekil 1. sensörü (Gd-sensör) . Unchelated Gd 3+ yokluğunda, algılayıcının flüoresan az. Gd 3+ eklenmesiyle, QS yerinden oluşur ve floresan emisyonunda bir artış gözlenmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Günümüzde vardır, yaygın bir şekilde kullanılan spektroskopik bazlı yöntem algılama içinSulu Gd 3+ ing. Bu tahlil iyonunun 10 şelasyon üzerine 433 nm 573 ila maksimum absorpsiyon dalga boyu bir kayma uğrar molekül ksilenol turuncu kullanır. Bu iki emilimi maksimum oranı unchelated Gd 3+ miktarını belirlemek için kullanılabilir. iki yöntem, hedef seçicilik, miktarının doğrusal aralıkları ve algılama yöntemlerinin (örneğin pH ve kullanılan tampon çözeltilerin bileşiminde gibi) farklı reaksiyon koşullarına sahip olarak aptamer sensörü, ksilenol turuncu tahlil alternatif (aynı zamanda tamamlayıcı olabilir) &#39;dir 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Giriş dizisi ve sipariş formunda florofor modifikasyonu</td><td>Farklı bir emisyon dalga boyuna sahip bir florofor kullanılabilir. Aptamer başka bir şirketten de sipariş edilebilir.</td></tr><tr><td>Söndürme ipliği</td><td>IDTDNA</td><td>Giriş dizisi ve sipariş formunda söndürücü modifikasyonu</td><td>Florofordan optimum enerji transferi için farklı bir söndürücü kullanılabilir. Aptamer başka bir şirketten de sipariş edilebilir.</td></tr><tr><td>Moleküler biyoloji sınıfı su</td><td></td><td></td><td>Belirli bir üretici yok, hem DEPC hem de DEPC ile muamele edilmemiş eşit derecede iyi çalışıyor</td></tr><tr><td>Gadolinyum(III) klorür susuz</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür susuz</td><td>MP Biyomedikal</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit, peletler</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td>Aşındırıcı</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toksik ve aşındırıcı</td></tr><tr><td>384 kuyulu düşük flanşlı siyah düz tabanlı polistiren NBS plakaları</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Floresan için uygun plakalar Okuma gereklidir.</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow steril tek kullanımlık şişe üstü filtre</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>Şişe üstü 0,2 mikron PES membran ile donatılmıştır</td></tr><tr><td>Tek kullanımlık steril şişeler 250 mL</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>Daha büyük veya daha küçük bir şişe kullanılabilir</td></tr><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td></td><td></td><td>DNAse ve RNAse içermeyen</td></tr><tr><td>0.2 mL PCR tüpleri</td><td></td><td></td> <td>oldukları sürece belirli bir üretici yokturDNAse ve RNAse içermedikleri sürece belirli bir üretici yoktur</td></tr><tr><td>Mikropipetler</td><td></td><td></td><td>Belirli bir üretici yok</td></tr><tr><td>Uygun boyutlarda</td><td></td><td></td> pipet uçları (filtresiz) <td>DNAse ve RNAse içermedikleri sürece belirli bir üretici yoktur</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate okuyucu</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Diğer üreticilerin plaka okuyucuları da aynı derecede iyi çalışacaktır</td></tr></tbody></table>

unchelated gadolinium için bir aptamer tabanlı sensörü (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Sulu çözeltide şelatsız üç değerlikli gadolinyum iyonunun (Gd3 +) varlığını belirlemek için bir yöntem gösterilmiştir. Gd3 + genellikle ligand ve iyon arasındaki eksik reaksiyonların bir sonucu olarak veya bir ayrışma ürünü olarak gadolinyum bazlı kontrast madde örneklerinde bulunur. İyon toksik olduğu için tespiti kritik öneme sahiptir. Burada, Gd3+ için aptamer tabanlı bir sensörün (Gd-sensörü) tasarımı ve kullanımı açıklanmaktadır. Sensör, artan iyon konsantrasyonlarına yanıt olarak bir floresan değişikliği üretir ve nanomolar aralıkta (3 sinyal-gürültü oranıyla ~ 100 nM) bir algılama sınırına sahiptir. Test, 384 oyuklu bir mikroplakada ortam pH'ında (~ 7 - 7.4) sulu bir tamponda çalıştırılabilir. Sensör, sodyum, potasyum ve kalsiyum iyonları gibi fizyolojik olarak ilgili diğer metal iyonlarına karşı nispeten reaktif değildir, ancak öropyum(III) ve terbiyum(III) gibi diğer üç değerlikli lantanitlere göre Gd3+ için spesifik değildir. Bununla birlikte, lantanitler kontrast maddelerde veya biyolojik sistemlerde yaygın olarak bulunmaz ve bu nedenle sensör, sulu koşullarda şelatsız Gd3 + 'yı seçici olarak belirlemek için kullanılabilir.

Unchelated Gd 3+ mevcudiyetinde Gd sensör çözeltisi tipik bir floresans değişimi, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Emisyon flüoresan kat değişim (Şekil 2A) ya da rasgele birimlerde okuma ham floresans (Şekil 2B) olarak grafiğe edilebilir (SKB). Her iki araziler&gt; 3 uM sinyalin 1 uM ve doygunluk altında Gd konsantrasyonları için doğrusal aralık 3+ ile çok benzer kalibrasyon eğrileri elde. Saptama sınırı 3 bir sinyal...

Sulu bir çözeltide şelatsız gadolinyum(III) iyonunu algılamak için polideoksinükleotid (44-mer aptamer) moleküllerinin kullanımı anlatılmıştır. İyonun varlığı, sensörün floresan emisyonundaki bir artışla tespit edilir.

Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Bu floresan tabanlı analizin genel amacı, manyetik rezonans görüntüleme kontrast maddeleri içeren sulu çözeltilerde toksik şelatlanmamış gadolinyum iyonlarının varlığını tespit etmektir. Bu yöntem, sentezlenen ajanların yüksek saflığını sağlayan bir araç sunarak gadolinyum tabanlı MRI kontrast ajanlarının kolaylaştırılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, şelatlanmamış toksik gadolinyumu, diğer biyolojik metal katyonlarına göre nispeten yüksek seçicilikle submikromolar konsantrasyonlarda tespit edebilmesidir.Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği şekilde analiz tamponunu hazırlayın. Sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanarak pH değerini 7,4'e ayarlayın. Ardından, tamponu 0,2 mikron PES membranlı steril tek kullanımlık bir şişe üstü filtreden süzün.Ardından, 497 µL assay tamponunu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hazırlanmış gadolinyum aptamer stok çözeltisinden bir µL ve hazırlanmış QS stok çözeltisinden iki µL ekleyin. Bu 2X Gadolinyum sensör çözeltisinden 50 µL'yi dokuz adet PCR tüpünün her birine aktarın.Bundan sonra tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Termal döngüleyiciyi, örnekleri beş dakika boyunca 95 °C'ye ısıtacak, ardından çözeltileri 15 dakika içinde yavaşça 25 °C'ye soğutacak şekilde ayarlayın. Gadolinyum iyon çözeltisini eklemeden önce, 2X gadolinyum sensör çözeltilerinin 95 °C'ye ısıtılması ve ardından oda sıcaklığına yavaşça soğutulması gerektiğini unutmamak önemlidir.Başlamak için, istenen konsantrasyonda bir gadolinyum üç stok çözeltisi hazırlamak amacıyla katı gadolinyum triklorürü analiz tamponu içerisinde çözün. Seri dilüsyon yöntemiyle, metin protokolünde belirtildiği şekilde altı adet 100 µL gadolinyum üç çözeltisi hazırlayın. Bundan sonra, test edilecek kontrast maddeyi analiz tamponu içerisinde çözün.Üç farklı konsantrasyon hazırlamak için seri dilüsyon uygulayın. Ardından, 2X gadolinyum sensör çözeltisi içeren PCR tüplerini termal döngüleyiciden çıkarın. Her bir gadolinyum üç çözeltisinden 50 microliter'i ayrı PCR tüplerine aktarın.Karıştırmak için her çözeltiyi pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekin. Ardından, her bir kontrast madde çözeltisinden 50 µL'yi ayrı ayrı kalan PCR tüplerine aktarın. Pipetle birkaç kez yukarı aşağı çekerek karıştırın.Dokuz çözeltinin tamamını oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Ardından, her bir çözeltiden 45 µL'yi bir 384 kuyucuklu plakaya çift örnekler halinde aktarın. Sonrasında, metin protokolünde belirtildiği şekilde floresans verilerini kaydedin ve analiz edin.Bu çalışmada, şelasyona uğramamış üç değerli gadolnyum iyonu, floresans tabanlı bir yöntem kullanılarak sulu çözelti içinde tespit edilmektedir. Floresan sensör, bir floroforun aptamere bağlanmasıyla geliştirilmiştir. Sensör daha sonra, karanlık bir söndürücü molekül ile işaretlenmiş bir söndürme zinciriyle hibridize edilir.Gadolinium three ilavesi, söndürücü zinciri aptamerden uzaklaştırarak floresans emisyonunda bir artışa neden olur. Kalibrasyon eğrileri, 100 nanomolar gadolinium aptamer ve 200 nanomolar QS kullanılarak elde edilir ve ham floresans veya floresans kat değişimi şeklinde çizilir. Her iki eğri de bir mikromoların altındaki gadolinium three konsantrasyonları için doğrusal bir aralık ve üç mikromoların üzerindeki konsantrasyonlarda sinyal doygunluğu göstermektedir.Ardından, iki farklı gadoterik asit partisi, 0 mM ile 20 mM arasındaki konsantrasyonlar için analiz edilir. Yüksek saflıktaki örneğin floresan emisyonu bu aralıkta belirgin bir artış göstermezken, şelatlanmamış gadolinyum üç içeren örnekte 5 mM kadar düşük konsantrasyonlarda bile önemli bir değişim gözlemlenir. Bu prosedürü uygularken, floresan okumasını değiştirebileceği için mikroplaka kuyucuklarında hava kabarcığı bulunmadığından emin olmak önemlidir.Bu prosedür kullanılarak, kontrast maddeler içeren çözeltilerdeki hesaplanmış düşük miktarlardaki gadolinyum iyonları bile tespit edilebilir. Bu, maddelerin saflığını belirlemek için iyi bir yöntem olacaktır. Kimyasallarla çalışmak tehlikeli olabilir ve bu prosedürü gerçekleştirirken kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemler almak önemlidir.

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz metalation, arıtma, ve lantanide komplekslerin karakterizasyonu göstermektedir. Burada açıklanan komplekslerinin manyetik rezonans görüntüleme kullanarak bu moleküllerin izlemeyi etkinleştirmek için makromoleküllerin konjuge olabilir.

Manyetik Rezonans Görüntüleme için hazırlanması, Saflaştırılması ve lantanide Kompleksleri Kontrast Ajanlar Kullanım Karakterizasyonu

Fare prostat kanseri modelinde tümör stroma içinde pıhtılaşmış plazma proteinlerine özel bir MRT-kontrast maddesi hedefleyen küçük peptid ile MR kanser moleküler görüntüleme göstermek için.

Küçük Moleküler CLT1 Peptide Hedefli Kontrast Agent ile Prostat Kanseri MR Moleküler Görüntüleme

Ayarlanabilir sıkılık manyetik boncuk seçim yöntemine dayalı olarak küçük moleküllü hedefler için yapı anahtarlamalı aptamerleri seçmek için bir protokol sağlanır. Yapı değiştirme özelliklerine sahip olarak seçilen aptamerler, tarif edilen altın nanopartikül tahlili gibi bir hedefin varlığını işaret etmek için konformasyonel bir değişiklik gerektiren tahliller için faydalıdır.

Bir Kolorimetrik Altın Nanopartikül Testi Uygulanan Yapı-anahtarlama aptamers seçilmesi için bir yöntem

Bu protokol, biyoişlevselleştirilmiş Prusya mavisi nanopartiküllerin sentezini ve bunların multimodal, moleküler görüntüleme ajanları olarak kullanımlarını açıklar. Nanopartiküller, nanopartikül çekirdeği içindeki gadolinyum veya manganez iyonlarının MRI kontrastı oluşturduğu bir çekirdek kabuk tasarımına sahiptir. Biyofonksiyonel kabuk, floresan görüntüleme için floroforlar ve moleküler hedefleme için hedefleme ligandları içerir.

Modlu Moleküler Görüntüleme Uygulamaları için Biofunctionalized Prusya Mavisi Nanopartikülleri

in-the-alanın uygulamaları için küçük moleküllerin tespiti için aptamer-altın nanoparçacık kolorimetrik testinin tasarım ve geliştirme incelenmiştir. Buna ek olarak, akıllı aygıt kolorimetrik bir uygulama (uygulama) doğrulandı ve analiz uzun süreli depolama alanında kullanım için kurulmuştur.

In-alan uygulamaları için tasarım ve Aptamer-Altın Nanopartikül Tabanlı Kolorimetrik Tahliller Gelişimi

EOB-DTPA izolasyonu ve sonraki Kompleksleşmeye doğal Ga (III) ve 68 ile Ga burada sunulan yanı sıra etiketleme verimliliği üzerinde tüm bileşiklerin ve soruşturmaların tam bir analizini, in vitro istikrar ve n-oktanol / su için bir prosedür Radyo-etiketli kompleks dağılım katsayısı.

EOB-DTPA ve Ga (III) Complex Araştırmalar Onun<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radyoaktif Analog

Bu protokol paramanyetik gadolinyum iyonları koordine Cyclen tabanlı makrosiklik şelatları taşıyan bir dendrimeric manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kontrast madde hazırlanması ve karakterizasyonu açıklar. Ticari olarak temin edilebilen monomerik analog ile karşılaştırıldığında, in vitro olarak MR deneyler serisinde, bu madde bir güçlendirilmiş MR sinyal üretti.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Manyetik Rezonans Görüntüleme için Dendrimer tabanlı Kontrast Ajanlar Karakterizasyonu

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Maddedir asit Ester-bağlama DNA Aptamer seçimi, karakterizasyonu ve elektrokimyasal bir Aptasensor uygulamaya

Burada, elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut68Ga çekirdek katkılı demir oksit nano tanecikleri ile hızlı mikrodalga tahrik sentezi. Evde beslenen hayvan metodoloji işler / (TRT1) MRG nano tanecikleri ile verimliliği % 90 ve %99 20 dk sentez radiochemical saflık daha yüksek radiolabeling.

68Ga çekirdek katkılı demir oksit nano tanecikleri çift pozitron emisyon tomografi için sentezi / (TRT1) manyetik rezonans görüntüleme

Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.

Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini hızlı ve ucuz bir şekilde doğrulayabilen bir floresan tahlili tarif ediyoruz. Tahlil, bileşiklerin, zayıf demir şelatlama floresan probu Calcein'in demir bağlama aktivitesini aşma yeteneğini ölçer ve şelasyon meydana geldiğinde floresanda ölçülebilir bir artışa neden olur.

Yeni bileşiklerin demiri şelatlama yeteneğini doğrulamak için ölçülebilir ve ucuz hücresiz floresan yöntemi 

Keşfedin, toksik serbest gadolinium(III) iyonlarını sulu çözeltilerde floresans tabanlı aptamer sensörü ile nasıl tespit edeceğinizi. Bu yöntem, MRI kontrast maddelerinin güvenliğini sağlamak için submikromolar duyarlılık sunar.

Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III)

Daha fazla video keşfet