Name: Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Keşfedin fare osteoklast öncülerinde Notch sinyal uyarılması yöntemini. Bu teknik hücre farklılaşması ve kemik biyolojisi araştırmalarında Notch sinyalinin rolünü anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Pennsylvania Üniversitesi Kas-İskelet Sistemi Bozuklukları Merkezi (5 P30 AR050950-09), AO Vakfı'ndan (S-16-12A), Philadelphia VA Tıp Merkezi Translasyonel Kas-İskelet Araştırma Merkezi'nden bir hibe ve intramural ortopedik cerrahi bölümü araştırma geliştirme fonu tarafından desteklenmiştir. JWA, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü Kurumsal Araştırma ve Kariyer Geliştirme Ödülü (IRACDA; 5 K12 GM081259-08) tarafından finanse edilen Pennsylvania Üniversitesi Araştırma ve Öğretimde Doktora Sonrası Fırsatlar (PENN-PORT) bursu tarafından desteklenmektedir.

omurgalı hayvanları da içeren tüm araştırma Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller çerçevesinde gerçekleştirildi. 1. Kültür Medya Hazırlık <ol><li> Ve 100 ml ısı, 900 mi, H2O içinde en az temel ortam (MEM) tozu ve 1.9 g sodyum bikarbonat çözülmesiyle α-MEM hazırlanması ve 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ile takviye inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu. 0.22 mikron polyethersulfone (PES) filtre kullanarak sterilize edin. </li><li> 35 ng α-MEM ilave makrofajın orta hazırlayın / ml rekombinant fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) </li><li> 100 ng / ml RANKL ile makrofaj ortamı ilave ederek osteoklast ortamı hazırlayın </li></ol> 2. Kemik iliği Hücre İzolasyonu <ol><li> 10 mi α-MEM ile fare başına 25⅝ gauge iğne ile bir 10 ml şırınga doldurun. </li&gt; <li> 1.3 L / dakikalık bir akış oranında CO 2-10 dakika maruz kalma ile fareler öldürülür. Diseksiyon başlamadan önce servikal dislokasyon ile CO 2 pozlama takip ederek hayvan ölümü sağlayın. </li><li> Temiz tekniği kullanarak, teşrih ve fibula ve femora ayırın. Kaval ve femur maruz her arka bacak ön yüzeyi boyunca bir kesi yapmadan önce% 70 etanol ile fare cildi dezenfekte edin. <ol><li> femur distal ucunu serbest diz eklemine kesti, ve mümkün olduğunca pelvis yakın olarak femur kesti. Uyluk çıkarın ve mümkün olduğu kadar yumuşak doku temizleyin. ayak bileği kesti tibia, kaldırmak ve mümkün olduğunca yumuşak doku kaldırmak için. </li></ol></li><li> 2.5 ml oda sıcaklığında α-MEM, tek bir tüp içine tek bir fare kemik iliği basması birleştirerek bir 15 ml konik tüp içine forseps ve gömme iliği ile kemik tutun. NOT: Başarılı bir kemik iliği floş t renklerini değişecekO kırmızı kemik bej. </li><li> enkaz tüpün dibe ve herhangi bir enkaz aktarılmasını engellemek için temiz bir 15 ml konik tüp alma bakımına süpernatant aktarmak için izin verin. NOT: Bazı hücreler de kemik iliği enkaz ile razı olabilir. hücrelerin daha fazla sayıda gerekli ise, kemik iliği basması temiz 15 ml&#39;lik bir tüp içine 70 mikron hücre süzgecinden süzülür. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpüne (ler) hücreler pelet. </li><li> Vakum tampon lize 0.5 mi Amonyum Klorür-Potasyum (ACK) supernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire ve kırmızı kan hücreleri lize etmek için 3 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de çözeltisi ve santrifüj hücresi ACK doğrudan 10 ml PBS ilave edin. NOT: Daha önce kırmızı hücre pelet şimdi bej olmalıdır. </li><li> 100 mm doku kültürü ile tedavi edilen çanak vakum aspirasyon supernatant ve tekrar süspansiyon pelet 10 ml α-MEM içinde ve plaka. nemlendirilmiş, 37 ° C de bir gece boyunca inkübe hücreleridoku kültürü kuluçka. NOT: hücrelerin sayılması bu adım için gerekli değildir. Bu süre boyunca, kemik iliğinden yapışan hücreler, kültür yüzey eklenecektir; yapışmayan kemik iliği hücre popülasyonları süspansiyon içinde kalır. MCSF Bu ilk inkübasyon sırasında kültür ortamında mevcut değildir. </li></ol> Osteoklast Öncüleri 3. zenginleştirilmesi <ol><li> iliği basması, 50 ml yıkanarak yapışmayan hücreler konik tüp içeren transfer kültür süpernatanının gece boyunca inkübe edildikten sonra. Not: Kemik iliği mezenkimal projenitör hücreleri, yapışık hücreler ile kültür tabaklarında, iptal edilebilir ya da başka deneyler için arzu edildiği takdirde, taze α-MEM ile beslenir. Not: Osteoklastlar, 5 gün boyunca her gün osteoklast orta ve ferahlatıcı bir ortam içinde 4 x 10 5 hücre / cm2 yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş tabaklar içine kaplama ile, bu yapışmayan kemik iliği hücreleri ile irtibata ayırt edilebilir. </li&gt; <li> 18 ml&#39;lik bir son hacme yapışmayan hücre çözeltisine α-MEM ilave edin ve 35 ng / ml&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar M-CSF ekleyin. </li><li> 6 60 mm süspansiyonu kültür tabaklarında hücre süspansiyonu her bir 3 ml ekleyin. </li><li> nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. Bu süre boyunca, M-CSF daha olmayan doku kültürü ile muamele edilmiş yüzeylerin yapışabilir makrofajlar, farklılaşmasını teşvik edecektir. </li><li> bir gecede 3 ml taze makrofaj ortamı ile, yeniden besleme osteoklast öncülerini kuluçka sonra. Bu makrofajlar içine farklılaştırılmış değil yapışmayan hücreleri çıkarmak olacaktır. </li><li> 2 gün veya kültürlerinin yaklaşık 70% konfluansta ulaşana kadar CO2, 37 ° C&#39;de, kültür osteoklast öncüler devam ve% 5. </li></ol> 4. Osteoklast Farklılaşma <ol><li> cel kadar oda sıcaklığında 1 mi Deniz menşeli proteolitik / kolajenolitik enzim hücreler 5 ml PBS ile osteoklast öncüler yıkayın ve tedavisils plakanın nazik dokunarak yerinden yapılabilir. NOT: süspansiyon yemekleri kültüre ise osteoklast öncüleri sadece kaldırılabilir; öncüleri kaldırılması için doku kültürü ile işlenmiş yüzeylere çok sıkı bir şekilde takın. Tripsin osteoklast öncülerini aktive edebilir ve kaçınılmalıdır. </li><li> 50 ml konik tüp, her çanak ve aktarım hücrelere 4 ml α-MEM ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve mi, 5 x 10 4 hücre / bir yoğunluğa hücreleri sulandırmak ve 100 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar 35 ng / ml ve RANKL nihai konsantrasyona M-CSF ekleyin. </li><li> Doku kültürü ile muamele edilmiş plakalara 2.6 x 10 4 hücre / cm2 yoğunluğunda tohum hücreleri ve 2 gün boyunca nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de inkübe edin. Farklılaşma, tipik olarak 5 x 10 4 hücre her bir kuyunun içine ekilir 24 oyuklu plakalar içinde gerçekleştirilmektedir. </li><li> 2 gün 1 ml taze osteoc ile ortamının değiştirilmesiyle farklılık yeniden besleme hücrelerinin başladıktan sonraGeçen ortam. Not: osteoklast başkalaşımı, genellikle 3 gün içinde tamamlanır. Ortaya çıkan osteoklastlar TRAP-lekeli kolay ölçümü ve morfolojik analizler için olabilir. </li></ol> Jagged1 kaplı Yüzeyli Notch Sinyal 5. Sürekli Stimülasyon <ol><li> 10 ug / ml bir konsantrasyonda PBS içinde keçi anti-insan IgG Fc antikoru Askıya (1: 10 mg / ml stok 1000 seyrelti). 1.3 ug / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta kültür yüzey antikor solüsyonu ilave edin ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. 24 oyuklu plakalar halinde, oyuk başına 250 ul (2.5 ug) ilave edilir. </li><li> Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. </li><li> 10 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda PBS içinde yeniden birleştirici Jagged1-Fc füzyon proteinini süspanse edin. 1.3 ug / cm2 &#39;lik bir yoğunlukta antikor kaplı kültür yüzey Jagged1-YP solüsyonu ilave edin ve 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kültür yüzey antikoru ONL ile kaplanmışY kontrol olarak da kullanılabilir. </li><li> Vakum aspirasyon kuyuları ve 1 ml PBS ile doldurun. Bu adımı 2 kez tekrarlayın. kurumasını önlemek için tohumlama hücre hemen önce kadar kuyu PBS tutun. </li><li> Tohum 2.6 x 10 4 osteoklast ön-maddeleri / kaplanmış yüzeyler üzerine cm2. Çentik sinyal sürekli en az 3 gün süre ile teşvik edilecektir. </li></ol> Jagged1 kaplı Boncuk ile Notch Sinyal 6. Geçici Stimülasyon <ol><li> 1.5 ml&#39;lik bir son hacimde 0.5 mg / cm 2 Jagged1-Fc, 21 ul / cm2 protein G agaroz boncuklar, ve PBS: uygun boyutta bir boru aşağıdaki birleştirin. Bir 24 yuvalı plaka 1 kuyu için Jagged1 boncuk yeterli sayıda hazırlanması 1.5 ml 1 ug Jagged1-Fc, 40 ul protein G agaroz boncuklar, ve PBS birleştirmek için. </li><li> 4 dönme ile tüp inkübe 2 saat ° C. </li><li> Pelet tanelerine 1 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj tüpü. 1.5 ml PBS içinde süspanse boncuk. Bu yıkama tekrarlayın2 kez daha. </li><li> 130 ul / cm2, kültür ortamı içinde yeniden süspanse Jagged1 boncuk ve kültürlenmiş hücrelere uygulanır. </li><li> İstenen süre için CO2 37 ° C&#39;de boncuk hücreleri inkübe ve% 5. PBS veya kültür ortamının çok yıkama ile boncuk çıkarın. </li><li> Notch hedef gen kopyalarının 10 ölçümü yoluyla Notch sinyal aktivasyonunu doğrulayın. </li></ol>

<ol><li>Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in development and disease.</a> Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).</li>
<li>Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+simplicity+in+design%2C+versatility+in+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: simplicity in design, versatility in function.</a> Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).</li>
<li>Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+ligand+endocytosis+generates+mechanical+pulling+force+dependent+on+dynamin%2C+epsins%2C+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin.</a> Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).</li>
<li>Chowdhury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+Single+Molecular+Forces+Required+for+Notch+Activation+Using+Nano+Yoyo%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo.</a> Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).</li>
<li>Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+receptor-ligand+binding+and+activation%3A+insights+from+molecular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies.</a> Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).</li>
<li>Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged-1+is+able+to+inhibit+the+function+of+its+multivalent+form+to+induce+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+a+surrogate+in+vitro+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).</li>
<li>Small, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Jagged+1+represses+the+function+of+its+transmembrane+form+to+induce+the+formation+of+the+Src-dependent+chord-like+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).</li>
<li>Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+notch+signaling+by+immobilization+of+jagged-1+on+self-assembled+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers.</a> Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).</li>
<li>Varnum-Finney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Notch+ligand%2C+Jagged-1%2C+influences+the+development+of+primitive+hematopoietic+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells.</a> Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).</li>
<li>Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKCdelta+is+required+for+Jagged-1+induction+of+human+mesenchymal+stem+cell+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation.</a> Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+radiation+on+the+Notch+signaling+pathway+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts.</a> Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).</li>
<li>Urs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+soluble+Jagged1-mediated+inhibition+of+Notch+signaling+on+proliferation+and+differentiation+of+an+adipocyte+progenitor+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model.</a> Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).</li>
<li>LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch1-STAT3-ETBR+signaling+axis+controls+reactive+astrocyte+proliferation+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).</li>
<li>Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+gene+related+to+anergy+in+lymphocytes+is+associated+with+Notch-mediated+human+T+cell+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression.</a> J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%3A+what+do+they+do+and+how+do+they+do+it%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts: what do they do and how do they do it?</a> Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+transcription+factor+RBP-J+results+in+osteopenia+attributable+to+attenuated+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation.</a> Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+regulates+osteoclastogenesis+directly+in+osteoclast+precursors+and+indirectly+via+osteoblast+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells.</a> J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).</li>
<li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+development+by+Notch+signaling+directed+to+osteoclast+precursors+and+through+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells.</a> Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).</li>
<li>Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+JAGGED1+promotes+osteolytic+bone+metastasis+of+breast+cancer+by+engaging+notch+signaling+in+bone+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells.</a> Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).</li>
<li>Sekine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+osteoclastogenesis+by+Notch2%2FDelta-like+1+and+Notch1%2FJagged1+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes.</a> Arthritis Res Ther. 14 (2), R45(2012).</li>
<li>Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+Signaling+Promotes+Osteoclast+Maturation+and+Resorptive+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity.</a> J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).</li>
<li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+of+Notch2+and+NF-kappaB+accelerates+RANKL-induced+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis.</a> Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).</li>
<li>Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hajdu+Cheney+Mouse+Mutants+Exhibit+Osteopenia%2C+Increased+Osteoclastogenesis%2C+and+Bone+Resorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption.</a> J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

protokolü içinde kritik adımlar Kültür ve osteoklast ön-maddeleri arasında nitro farklılaşmasında osteoclastogenez ve kemik rejenerasyonu ve kemik kütlesinin korunması için terapötik hedeflerin tanımlanması moleküler mekanizmalarının incelenmesi için yararlı bir platform sağlar. Fare osteoklast öncülerini kültürlerken, en kritik unsur, bir naif bir durumda öncüleri bakımıdır. makrofaj-benzeri hücreler olarak, osteoklast ön-maddeleri, bakteriyel bileşenler ve pro-inflamatuar sitokinlere...

Memeli Çentik sinyal yolu, Drosophila melanogaster, aynı yol homolog olan dört transmembran Çentik reseptörleri (Notch1-4) ve sivri (JAG1 ve JAG2) Delta-benzeri (DLL1, 3 beş zara bağlı ligand içerir ve 4) aileleri 1. Bir alıcı hücreye Çentik alıcısı bir iletim hücresi 2 ligandı ile bağlı olduğunda, Çentik sinyal başlatılır. Bu şekilde trans-aktivasyon sırasında zara bağlı Çentik ligand zara bağlı Çentik alıcısı 3, 4 üzerinde bir germe kuvveti üretir. bağlayıcı ligandın germe kuvveti presenilin-içeren y-sekretaz kompleksi (γ-sekretaz) tarafından aracılık edilen bir hücreiçi bölünme etkinliği ve ardından enzim (TACE), dönüştürücü TNFalfa ile reseptörünün hücre dışı ayrılmasını kolaylaştıran Çentik reseptörde konformasyonel değişikliklere neden olur. γ-sekretaz bültenleri Notch intBu CBF-1-Su (lH) -Lag-1 (CSL), beyni benzeri (MAML) bir transkripsiyonel aktivasyon kompleks oluşturan çekirdek içine geçiş yapar ve hücre tipine spesifik faktörler, ekspresyonu hızlandırmak için racellular alan (NiCd) genler 5 hedef. In vitro Notch yolu aktivasyonu eşsiz yöntemlere ihtiyaç Notch sinyal aktivasyon sonucu mekanik elemanlar. Eriyebilir Çentik ligandlarmın reseptörlerine Notch bağlanan, ancak aynı zamanda, rekabetçi, hücreye birleşik Çentik ligandların bağlanmasını inhibe ederken NICD serbest bırakılması için gerekli kuvvetleri gerilme özelliklerine göre başarısız olabilir. Bu nedenle, kültür ortamına eriyebilir Çentik ligandlarmın eklenmesi 6, 7 sinyal, normal Notch azaltabilir. Bunlar uygun bir şekilde katı bir alt-tabaka 5, 8, 9 sabitlenmektedir Neyse ki, Çentik ligandları NICD salınmasını,10. Ligand kaplı kültür yüzeylerde hücreleri tohumlama veya hücrelere ligand kaplı boncuklar uygulayarak hem Notch sinyali etkinleştirmek ve aralarındaki seçim Notch stimülasyon istenen zamanlaması öncelikle bağlıdır olabilir. fonksiyonel ya da farklılaşma deneyinde orta noktası boyunca arzulanan gibi anında geçici Çentik sinyal aktivasyonu için, Çentik ligand kültürlenmiş hücrelere uygulanan boncuklar, agaroz bağlı olabilir ve herhangi bir zamanda yıkanmıştır. bir kültür süresinin başlangıcından itibaren daha sürekli Çentik sinyallemesinin için, doku kültürü plakaları Hücre Serpilmesi önce bir ligant ile kaplanabilir. Bu protokol amaçları için, yöntemler, fare osteoklast öncüler kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak burada tarif edilen yöntemler ile ilgili yöntemler ve varyasyonların hücre tipleri 6, 11, 12, 13, çok çeşitli uygulanabilir, </sup&gt; 14. Osteoklastlar terminal kemik dokusunun emilmesinden sorumlu olan farklılaşmış hematopoietik nesilli hücreleridir ve bunlar kemik kaybı 15 birden fazla rahatsızlığa rol oynar. Böylece, monosit / makrofaj-soy öncüleri osteoklastlar ve fonksiyon osteoklastlar ve yeni kemik-yenileyici tedavilerin geliştirilmesi daha iyi anlaşılması için gereklidir kontrol eden moleküler mekanizmaların farklılaşma in vitro çalışmada. Bu artık, genel olarak bu çentik sinyal osteoklast farklılaşması ve fonksiyonunda pozitif bir rol oynadığını kabul edilmekle birlikte, her iki çentik sinyal uyarılması ve osteoklast ön-kültürü ve farklılaşmasında varyasyonlar ilk çelişkili sonuçlar 16, 17, 18, 19 yol açmıştır. Yakından yöntemleri farklılıkların incelenmesi ve genetik kullanımımodeller büyük ölçüde osteoklastogenez Notch sinyalizasyon rolünü açıklık, ama standardize Notch uyarılması ve kültür yöntemlerinin uygulama diğer hücre tipleri 20, 21, 22, 23 Notch sinyalizasyon gelecekteki çalışmalarda bu tür tartışmaları engelleyebilir. Notch sinyali teşvik etmek için çeşitli yöntemler olduğu gibi, en iyi yöntem deneysel soru bağlı olacaktır, orada kültüre ve fare osteoklast öncülerini ayırt etmek için birden çok yöntem vardır ve. Burada, fare uzun kemiklerde temizlendi ilik hücrelerinin yapışık ve yapışmaz kesirler kültüre bizim tercih edilen yöntem sunulacaktır. Bu yöntem, farklılaşma çeşitli yöntemler uygulanabilir hücreleri esas olarak herhangi bir özel ekipman gerektiren ve üretme avantajına sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Rekombinant fare M-CSF</td><td>Biolegend</td><td>576402</td><td>Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi</td></tr><tr><td>Rekombinant fare RANKL</td><td>Shenandoah Biyoteknoloji</td><td>200-04</td><td>Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi</td></tr><tr><td>Rekombinant insan Jagged1-Fc</td><td>R& D Sistemleri</td><td>1277-JG-050</td><td>Birden fazla tedarikçiden temin edilebilir, deneylerden önce test aktivitesi</td></tr><tr><td>Protein G agaroz boncukları</td><td>InvivoGen</td><td>jel-agg-2</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgG Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-001-008</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>Accutase hücre ayrışma reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Osteoklast öncülerini kaldırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Asit fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td>Diferansiye osteoklastları boyamak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

fare osteoklast Öncüleri notch sinyal uyarılması

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Çentik sinyali, çoklu fizyolojik ve patolojik süreçlerin önemli bir bileşenidir. Bununla birlikte, Notch sinyalizasyonunun doğası, değişen ve bazen çelişkili rollerinin in vitro olarak araştırılmasını bir zorluk haline getirir. Plazma zarına bağlı hem reseptörler hem de ligandlar ile doğrudan hücre-hücre iletişiminin bir bileşeni olarak, Notch sinyali, diğer birçok sinyal yolunda olduğu gibi, kültür ortamına ligandların basit bir şekilde eklenmesiyle in vitro olarak aktive edilemez. Bunun yerine, Çentik ligandları hareketsiz bir durumda hücrelere sunulmalıdır. 
Notch sinyal aktivasyonu yöntemlerindeki farklılıklar, kültürlenmiş hücrelerde farklı sonuçlara yol açabilir. Özellikle osteoklast öncülerinde, Notch stimülasyonu ve osteoklast öncü kültürü ve farklılaşması yöntemlerindeki farklılıklar, Notch sinyalinin osteoklast farklılaşmasının pozitif mi yoksa negatif bir düzenleyicisi mi olduğu konusunda anlaşmazlığa yol açmıştır. Farklı Notch stimülasyon koşulları altında osteoklast farklılaşmasının in vitro ve genetik modellerde daha yakın karşılaştırmaları, Notch sinyali ve osteoklastlar ile ilgili tartışmayı büyük ölçüde çözmüş olsa da, kültürlenmiş hücrelerde Notch sinyalinin sürekli ve geçici olarak uyarılması için standartlaştırılmış yöntemler gelecekte bu tür tutarsızlıkları önleyebilir.
Bu protokol, özellikle kültürlenmiş fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalini uyarmak için iki yöntemi tanımlar, ancak bu yöntemler küçük ayarlamalarla herhangi bir yapışık hücre tipine uygulanabilir olmalıdır. İlk yöntem, Notch sinyalinin sürekli olarak uyarılmasını sağlar ve hücrelerin tohumlanmasından önce Notch ligandının bir doku kültürü yüzeyine hareketsiz hale getirilmesini içerir. Agaroz boncuklara bağlı Notch ligandını kullanan ikincisi, zaten bir kültür yüzeyine yapışmış hücrelerde Notch sinyalinin geçici olarak uyarılmasına izin verir. Bu protokol aynı zamanda osteoklast öncülerinde Notch aktivasyonunu tespit etmek için yöntemlerin yanı sıra Notch sinyal aktivasyonunun temsili transkripsiyonel belirteçlerini de içerir.

Bu yöntemin amacı, kültürüne ve osteoklast öncüleri olarak Notch sinyali uyarır. Düzgün kültürlenmiş, osteoklast ön-maddeleri düzgün bir sitoplazma (Şekil 1A) ile esas olarak uzunlamasına aks-benzeri morfolojiye sergiler. Bakım osteoklast öncülerinin immünolojik aktivasyon önlemek için alınmalıdır. Aktivasyonu üzerine, ön-yayılmış ve köpüksü sitoplazma (Şekil 1B) basık hale gelir. Bu &quot;kızarmış yumurta&quot; hücreler SIRA sinyalizasyon dayanıklıdır v...

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Bu prosedürün genel amacı, osteoklast farklılaşma sürecinin farklı aşamalarında notch sinyallendirme stimülasyonunun etkilerini gözlemlemektir. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanındaki "Hücresel bir süreç sırasında notch sinyallendirmesinin rolü nasıl değişir?" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, diğer hücrelere veya notch ligandlarına uyarlanmasına olanak tanıyan esnekliğidir.Bu yöntem osteoklast farklılaşması hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre sağkalımı, proliferasyonu gibi diğer süreçlere veya diğer hücre tiplerinin farklılaşmasına da uygulanabilir. İşleme, bir fareyi sırt üstü pozisyonda sabitleyip cildi yüzde 70 etanol ile dezenfekte ederek başlayın. Ardından, tibia ve femur kemiklerini açığa çıkarmak için bir arka ekstremitenin ön yüzeyi boyunca bir insizyon yapın.Ardından, femur'un distal ucunu serbest bırakmak için diz eklemi üzerinden bir insizyon yapılır. Pelvise yakın kemik ucundan keserek femur çıkarılır ve yapışık olan tüm yumuşak dokular temizlenir. Tibia'yı çıkarmak için ayak bileği üzerinden kesim yapılır ve yumuşak dokular uzaklaştırılır.Ardından, bacak kemiğini 15 mL'lik konik bir tüp üzerinde tutmak için pens kullan

stimulation-of-notch-signaling-in-mouse-osteoclast-precursors

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Bu protokol, in vivo osteoklast aktivitesini kontrol eden kritik genleri anlamak için kurallı bir yöntemi açıklar. Bu yöntem, iskelet fenotipini analiz etmek için transgenik bir fare modeli ve bazı kurallı teknikler kullanır.

Koşullu Stat3 Silme Fare Modelinin İskelet Fenotip Analizi

Protokol, disseke edilmiş fare embriyo yüz süreçlerinden veya kültürlenmiş fare embriyonik palatal mezenkim hücrelerinden tüm hücre protein lizatlarını izole etmek ve fosforile protein seviyelerini değerlendirmek için müteakip batı lekelemesini gerçekleştirmek için bir yöntem sunar.

Fosfoprotein Analizi için Fare Yüz İşlemleri ve Kültürlenmiş Palatal Mezenkim Hücrelerinden Tüm Hücre Protein Lisatlarının İzolasyonu

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Bu çalışma, ortodontik kuvvet altında kemiğin yeniden şekillenmesini incelemek için indüklenebilir osteoblast soyuna özgü Stat3 nakavt farelerin kullanılması için bir protokol sağlar ve ortodontik diş hareketi sırasında alveolar kemiğin yeniden şekillenmesini analiz etme yöntemlerini açıklar, böylece iskelet mekanik biyolojisine ışık tutar.

Ortodontik Diş Hareketi Sırasında Alveolar Kemiğin Yeniden Şekillenmesini İncelemek için İndüklenebilir Osteoblastik Soya Özgü Stat3 Nakavt Farelerinin Kullanılması

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Murin kemik iliği yaralanması modeli, intramembranöz ossifikasyon yoluyla doğum sonrası osteogenezi incelemek için yararlı bir araçtır. Bu basitleştirilmiş cerrahi protokol, yaralanma sonrası yeni kemik oluşumunun ve hücresel yanıtların aşağı akış değerlendirmesi için kemik iliği ablasyon prosedürünü tanımlar.

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Keşfedin fare osteoklast öncülerinde Notch sinyal uyarılması yöntemini. Bu teknik hücre farklılaşması ve kemik biyolojisi araştırmalarında Notch sinyalinin rolünü anlamaya yardımcı olur.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Daha fazla video keşfet