At Oositlerinde Kromozom Ayrımı, Histon Asetilasyonu ve İşmili Morfolojisi Analizi
11 Mayıs 2017
Bu el yazması, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize eden deneysel bir yaklaşımı anlatmaktadır. Özellikle mevcut çalışma, ultrason kılavuzluğundaki ovum toplama (OPU) ile olgunlaşmamış ve olgun ata oositlerinin nasıl toplanacağını ve kromozom ayrımını, iğ morfolojisini, küresel histone asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağını göstermektedir.
Bu deneysel yaklaşımın genel hedefleri, ilk olarak, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize etmek ve ikincisi, in vitro veya in vivo olarak işlenen aynı hayvandan alınan gametleri karşılaştırmaktır. Bu deneysel yaklaşım, oosit biyolojisi ve monovulatuar türlerde doğurganlıktaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca gamet manipülasyon prosedürlerinin güvenliğini de artırabilir.
Bu yaklaşım, özellikle monovulatuar türlerden oositlerin kısıtlı örnek mevcudiyetinin üstesinden gelmek için geliştirilmiştir. OPU prosedürlerini göstermek için Liege Üniversitesi'nden Profesör Stefan Deleuze, laboratuvarımın laboratuvar yöneticisi Cecile Douet ve INRA Centre Val de Loire'daki at biriminin yöneticisi Fabrice Reigner olacak. Günlük olarak, ultrason kullanarak yetişkin kısraklardan oluşan bir kohortta yumurtalık foliküllerinin çapını değerlendirin.
Çapı 33 milimetreden daha büyük olan büyük bir folikül arayın. Bulunduktan sonra, oositin baskın bir foliküle olgunlaşmasını indüklemek için 1.500 ünite insan koryonik gonadotropin enjekte etmeye hazırlanın. Ardından, juguler karığı bulun ve enjeksiyon bölgesini alkolle temizleyin.
Daha sonra, damarın yükselmesini sağlamak için, enjeksiyon bölgesinin iki veya üç santimetre altına bir miktar kuvvet uygulayın. İğneyi boynuna neredeyse paralel olarak yerleştirin, iğnenin damarda olduğundan emin olmak için hafifçe aspire edin ve hormonu enjekte edin. Vajinal erişim için bir ultrason probu hazırlayın.
Ardından iğneyi bir emme sistemine bağlayın. HCG enjeksiyonundan 35 saat sonra, OPU için enstrümantasyonu ayarlayın ve kısrağı sakinleştirin. İyi analjezi, hayvanın ve operatörün güvenliği için son derece önemlidir.
Ağrı veya rahatsızlık hissetmeyen bir hayvan, yumurtalığın manipüle edilmesine izin vererek, delinme ve kızarmaların gerçekleştirilmesini kolaylaştırır. İğne probu yerleştirildikten sonra, bir operatör proba bakacak şekilde yumurtalığı manipüle ederken, diğer operatör iğneyi manipüle etmelidir. Ekografik görüntüde baskın folikülü bulun.
Ardından, vajinal duvarı ve baskın folikülün duvarını delmek için iğneyi kullanın. Folikül boşluğuna erişildiğinde, foliküler sıvıyı aspire edin. Foliküler duvarı kazımak ve kümülüs-oosit kompleksini takmak için iğneyi döndürün.
Ardından, sıvıyı büyük bir petri kabına dökün. Ve bir stereoskop altında, COC'yi arayın. Bu arada, folikülü ılık Dulbecco'nun heparin içeren modifiye edilmiş PBS'si ile yıkayın.
COC'yi toplamak için birkaç yıkama gerekebilir. COC bulunduktan sonra, iğneyi çift lümenli bir iğneye değiştirin ve olgunlaşmamış COC'leri çapı beş ila 25 milimetre arasında olan tüm foliküllerden toplayın. Bunlar in vitro olgunlaşma için kullanılacaktır.
Bir yumurtalıktan alınan tüm foliküller aspire edildikten sonra, olgunlaşmamış COC'leri diğer yumurtalıktan toplamak için aynı prosedürleri tekrarlayın. Şimdi, COC'ler arasında seçim yapın. Yalnızca birkaç tam kümülüs hücresi katmanı ve kahverengi, ince granüllü bir ooplazma içeren COC'leri saklayın.
Diğerlerini atın. İşlemin sonunda, enfeksiyonu önlemek için kısrak 15.000 birim benzil-penisilin enjekte edin. Ardından, kısrağı iyileşirken en az iki saat sessiz ve temiz bir ahırda tutun.
OPU başlamadan önce, bir şişe takviye edilmiş HEPES tamponlu TCM-199'u 37 santigrat dereceye ısıtın. Ardından, IVM ortamını hazırlayın. 500 mikrolitre takviye edilmiş sodyum bikarbonat tamponlu TCM-199'u dört kuyulu bir tabağın kuyucuklarına dağıtın.
Ardından, çanağı en az iki saat boyunca 38,5 santigrat derecede inkübe edin. Geri kazanılan olgunlaşmamış COC'leri, iki mililitre ısıtılmış HEPES TCM-199 ile doldurulmuş 3,5 santimetrelik bir tabağa aktarın. Çevredeki kalıntıları nazikçe yıkamak için COC'leri yemeğin farklı bölgelerinden geçirin.
Şimdi, COC'leri IVM ortamına aktarın ve 38.5 santigrat derecede 28 saat boyunca inkübe edin. Olgun COC'lerde bir kromozom sayımı yapmak için, onları 38.5 santigrat derecede bir saat boyunca 100 mikromolar monastrol içinde inkübe edin. Daha sonra, COC'leri HEPES tamponlu TCM-199'da% 0.5 hyaluronidaz ile muamele ederek kümülüs hücrelerini çıkarın.
Bu reaksiyonu 38 santigrat dereceye ayarlanmış ısıtılmış bir aşamada izleyin. Yaklaşık beş dakika içinde tüm hücreleri çıkarın. Son birkaç inatçı hücreyi çıkarmak için nazik pipetleme kullanın.
Daha sonra, HEPES tamponlu TCM-199'da% 0.2 pronaz kullanarak zona pellucida'yı çıkarın. Bu reaksiyonu ısıtılmış bir aşamada da izleyin. Tamamlanması yaklaşık beş dakika sürmelidir.
Daha sonra, oositleri DPBS'de% 4 paraformaldehit içinde 38.5 santigrat derecede 15 dakika boyunca sabitleyin, ardından dört santigrat derecede 45 dakika daha fiksasyon yapın. Fiksasyondan sonra, oositleri DPBS'de% 0.1 polivinil alkolün üç oyuğu arasında sırayla aktararak yıkayın. Kuyucuk başına yaklaşık yarım mililitre çözelti kullanın.
Daha sonra, oositleri PBS'de% 0.3 Triton X-100 ile doldurulmuş bir kuyuya aktarın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe etmelerine izin verin. Spesifik olmayan sinyalleri engellemek için, DPBS'deki hücreleri %1 BSA ve %10 normal eşek serumu ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.
30 dakika sonra, birincil antikoru uygulayın ve ardından hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, oositleri yıkayın ve ikincil antikoru, ışığa maruz kalmaktan korunarak oda sıcaklığında bir saat boyunca uygulayın. İkincil uyguladıktan sonra oositleri tekrar yıkayın.
Ardından, montajdan önce, lamel desteği olarak işlev görmesi için kızaklara çift taraflı bant şeritleri takın. Şimdi, oositleri, 20 mikromolar YO-PRO-1 ile desteklenmiş, sertleşmeyen, antifade montaj ortamının bir damlasına slayt başına üç ila dört kez monte edin. Oositlerin yaklaşık 10 dakika oturmasına izin verin ve ardından lamelleri uygulayın.
OPU tarafından dominant foliküllerden alınan 32 COC'den 28'i metafaz II'deydi.İn vitro maturasyon kullanılarak, dominant olmayan foliküllerden toplanan 44 COC'nin 37'si metafaz II'ye olgunlaştırıldı. İn vitro olgunlaşmış oositler sıklıkla anöploididen, çoğunlukla hiperploididen etkilenmiştir. Bu, in vivo olgunlaşmış oositlerde gözlenmedi.
Daha sonra, kutuptan direğe iş mili uzunluğu ve iş milinin maksimum çapının her ikisi de ölçüldü. İn vitro olgunlaşmış oositler, in vivo olgunlaşmış oositlerden önemli ölçüde daha uzun ve daha genişti. Aynı örneklerde, H4K16'nın küresel asetilasyon seviyesi ölçüldü.
Sonuçlar beklendiği gibi oldu. H4K16'nın asetilasyonu, in vitro olgunlaşmış oositlerde in vivo olgunlaşmış oositlere göre anlamlı derecede düşüktü. İyi eğitimli bir ekip, yumurtlama öncesi oosit için %80'lik bir geri alma oranı ve olgunlaşmamış oositlerin %50 ila 60'lık bir geri kazanım oranı ile bir OPU sabahında beş kısrağı işleyebilir.
OPU sırasında, her zaman hayvanın sağlığını ve refahını izleyin ve gerekirse yeterli veteriner bakımı sağlamaya hazır olun. Deneysel yaklaşım, diğer türlerin oositlerine de uygulanabilir ve özellikle insanlar gibi örneklerin mevcudiyetinin bir sorun olduğu durumlarda uygulanabilir. Sonuçlarımıza dayanarak, uygun kromozom ayrışması ve epigenetik değişiklikler için gereken kültür koşullarını daha iyi anlamak için çalışmalar yapılmalıdır.
Kapsayıcı hedef, hem veteriner tıbbı hem de insan doğurganlık tedavisi için in vitro olgunlaşma verimliliğini artırmaktır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize etmek için deneysel bir yaklaşım sunmaktadır. Ultrasonda kılavuzluk edilen ovum pick-up (OPU) yöntemi kullanılarak immatür ve matür at oositlerinin toplanmasını detaylandırmakta; kromozom ayrılmasını, iğ iplik morfolojisini, global histon asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu incelemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Oosit biyolojisi
- Monovulatuar türlerde fertilite
- Gamet manipülasyon prosedürleri
Arka Plan
- Oosit özelliklerinin anlaşılması, fertilite araştırmaları için kritik öneme sahiptir.
- Monovulatuar türlerde oosit erişilebilirliği sınırlıdır.
- Ultrasoun eşliğinde OPU, örnek toplamayı artırabilir.
- In vitro ve in vivo olarak işlenmiş gametlerin karşılaştırmalı analizi esastır.
Çalışmanın Amacı
- At oositlerinin morfolojik ve biyokimyasal karakterizasyonunu yapmak.
- Aynı hayvandan alınan ve farklı ortamlarda işlenen gametleri karşılaştırmak.
- Gamet manipülasyon prosedürlerinde güvenliği artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Oosit toplama için ultrason eşliğinde ovum pick-up (OPU).
- Yetişkin kısraklarda over folikül çapının değerlendirilmesi.
- Kromozom ayrışması ve iğ morphology'sinin incelenmesi.
- Global histon asetilasyonu ve mRNA ekspresyonunun analizi.
Temel Sonuçlar
- İmatür ve matur at oositlerinin başarılı bir şekilde toplanması.
- Kromozom ayrılması ve iğ iplikçiği morfolojisine dair öngörüler.
- Global histon asetilasyon seviyelerine ilişkin veriler.
- İlgili mRNA'ların ekspresyon profilleri belirlendi.
Sonuçlar
- Bu çalışma, atlarda oosit karakterizasyonu için bir çerçeve sunmaktadır.
- Bulgular, monovülatuvar türlerde fertiliteye ilişkin anlayışı geliştirebilir.
- OPU teknikleri, gamet manipülasyonu güvenliğini artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Monovüler türlerde oosit biyolojisinin karakterize edilmesi, sınırlı örnek mevcudiyetinin mekanistik çalışmaları engellediği üreme Ar-Ge çalışmalarındaki kritik bir darboğazı gidermektedir. Bu yaklaşım, in vitro ile in vivo maturasyonun kromozomal bütünlük ve epigenetik regülasyon üzerindeki etkilerinin karşılaştırmalı analizine olanak tanıyarak kültür koşullarının optimizasyonu için öngörücü bilgiler sağlar. Bu tür veriler, klinik uygulamadan önce kültür kaynaklı aneuploidi ve iğ iplikçik kusurlarının belirlenmesi yoluyla yardımcı üreme teknolojilerinin risklerinin azaltılmasını destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değeri: Kromozom ayrılma yeteneğinin fonksiyonel bir çıktısı olarak aneuploidi insidansını nicelleştirerek, mayoz sadakat mekanizmalarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Bilimsel Değeri: Histon asetilasyon profillemesi (H4K16), epigenetik durumu iğ iplikçik morfolojisi ile ilişkilendirerek, oosit maturasyonundaki HDAC/HAT yolaklarının hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değeri: Oosit erişiminin sınırlı olduğu türler genelinde uygulanabilen, oosit kalite parametrelerinin değerlendirilmesi için standartlaştırılmış sitolojik bir çerçeve sunar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kantitatif kromozom ve iğ iplikleği morfometrisi, maturasyon kültürü koşullarını değerlendirmek için objektif ve tekrarlanabilir metrikler sağlar.
- Operasyonel Değer: Tübülin ve asetillenmiş histonlar için immun boyama protokolleri, epigenetik modifikatörlerin yüksek içerikli taramaları için aktarılabilir analizler oluşturur.
- Bilimsel Değer: Transkripsiyonel sessizlik altında qPCR aracılığıyla yapılan mRNA stabilitesi analizi, post-transkripsiyonel düzenleyici hedef tanımlamaya temel oluşturur.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Aynı hayvandan elde edilen in vitro ve in vivo olgunlaştırılmış oositlerin doğrudan karşılaştırılması, kültüre özgü etkileri ayrıştırarak preklinik modellerin translasyonel uygunluğunu artırır.
- Operasyonel Değer: Monovulator kısıtlamaları olan türlerde fizyolojik olgunlaşma durumlarını tanımlamak için referans iğ (spindle) boyutları ve asetilasyon eşikleri belirler.
- Bilimsel Değer: Histon modifikasyon veri setleri, yardımcı üreme süreçlerinde oosit yeterliliğinin öngörülmesine yönelik biyobelirteç keşfini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, gamet kalitesine ilişkin mekanistik içgörülerin, reprodüktif terapötikler için yukarı akış hedef doğrulaması ve aşağı akış analiz geliştirme süreçlerini bilgilendirdiği keşif biyolojisi aşamasına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kültür kaynaklı epigenetik disregülasyon ve bunun kromozom ayrılma sadakati üzerindeki etkisine yönelik hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin veya koşulların oosit maturasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, kantitatif veriler (kromozom sayıları, iğ iplikçik morfometrisi, asetilasyon seviyeleri) sağlar.
- Analitik: Deney grupları arasında istatistiksel karşılaştırmaya olanak tanıyan ölçülebilir çıktılar (aneuploidi oranları, H4K16 yoğunluğu, iğ iplikçik boyutları) üretir.
- Translasyonel Araştırma: In vitro bulguları in vivo referanslarla ilişkilendirerek, preklinik fertilite modeli geliştirmede türe özgü ekstrapolasyon riskini azaltır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: OPU ve tespit protokolleri, örnek kıtlığı yaşayan diğer monovulatuar türlere uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir oosit karakterizasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kültür koşullarının epigenetik ve kromozomal bütünlük metrikleriyle doğrudan ilişkilendirilmesi yoluyla maturasyon protokolü güvenliğinde öngörücü güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış oosit toplama ve işleme iş akışları, laboratuvarlar ve türler arası tekrarlanabilirliği artırır.
- Stratejik Değer: Kültür kaynaklı meiyotik defektlerin erken tespiti, yardımcı üreme teknolojileri geliştirmede geç evre başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Aneuploidi ve iğ iplikçikleri normalliği eşiklerine dayalı olarak maturasyon medyası formülasyonlarının veri odaklı önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Kromozom ve iğ analizi için oosit yönetimi, mikromanipülasyon ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gereklidir.
- Meiyotik yapıların zaman çözünürlüklü fiksasyonu ve görüntülenmesi için konfokal lazer tarama mikroskopi ve ısıtmalı tabla sistemleri temel öneme sahiptir.
- Antikor validasyonunun (tubulin, H4K16ac) ve montaj protokollerinin laboratuvarlar arası standardizasyonu, karşılaştırılabilir kantitatif çıktılar sağlar.
- Farklı türlere adaptasyon, üreme fizyolojisine bağlı olarak OPU folikül boyutu eşiklerinin ve hormon dozajının optimizasyonunu gerektirir.
- Sınırlamalar arasında, seans başına düşük oosit verimi ve maturasyon sırasındaki genel susturma nedeniyle transkripsiyonel aktivitenin değerlendirilememesi yer alır; bu durum odak noktasını post-transkripsiyonel düzenlemeye kaydırmaktadır.
