Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem

Bu protokolün genel amacı, bileşiklerin insan makrofajları içindeki M.tuberculosis sağkalımı üzerindeki etkilerinin çok boyutlu bir değerlendirmesini sağlamaktır. Bu yöntem, Lusiferaz tabanlı bir etkinlik analizine odaklanmaktadır. Sitotoksisite ile birleştirildiğinde, bir MIC analizi, TB ilaç geliştirme sürecindeki HIT bileşiklerin modifikasyonu hakkında faydalı bilgiler sağlayabilir.

Yöntemimizin temel avantajı, zaman ve emek tasarrufu sağlamasıdır. Bu yöntem, bir CFU colony forming unit analizinin yerine Luciferase tabanlı bir analizin kullanılmasını sağlar. Genel olarak, bu tekniğe yeni başlayan kişiler, otomasyon yerine manuel pipetleme yaparken tutarlılık sağlama konusunda zorluk yaşayacaklardır.

Tutarlı bir pipetleme tekniği çok önemlidir. THP1 hücrelerini tamamlayıcı besiyerli RPMI içerisinde büyütün. Pasajlar arasında, mililitre başına 0,2 ile bir milyon hücre arasında bir hücre yoğunluğunu koruyun.

Aktif olarak büyüyen bir bakteri süspansiyonunun OD600 değerini ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Ardından, 0.1 OD600'ün mililitre başına 3 × 10⁷ bakteriye eşit olduğu dönüştürme faktörünü kullanarak bakteri yoğunluğunu hesaplayın. 10:1'lik bir MOI için yeterli miktarda bakteriyi yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin.

Ardından bakterileri 3,000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Bakterileri opsonize etmek için, 450 µL RPMI 1640'a 50 µL insan serumu ekleyin ve bu karışımı, bakteriyel peleti 500 µL besiyeri başına 1 × 10⁸ bakteri yoğunluğunda yeniden süspande etmek için kullanın. Karışımı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, bir hemositometre ve ters mikroskop kullanarak THP1 hücre kültürü yoğunluğunu belirleyin. Daha sonra, steril santrifüj tüplerinde hücreleri 37 °C'de 10 dakika boyunca 100 ×g'de çöktürün. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri complete medium içeren RPMI içinde mililitrede bir milyon hücre yoğunluğunda yeniden süspande edin.

PMA'yı 40 nanograms per milliliter nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde ekleyin. Bu, diferansiyasyon karışımıdır. Opsonize edilmiş M.tuberculosis'i, 10'a bir MOI oranında THP1 diferansiyasyon karışımı ile birleştirin.

Ardından, nihai karışımı 96 kuyucuklu beyaz düz tabanlı bir plakadaki her kuyucuğa 100 µL olacak şekilde paylaştırın. Daha sonra, farklılaşma ve enfeksiyon işleminin %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edilmesini sağlayın. Ertesi gün, kuyucukları iki kez yıkamak için 100 µL RPMI kullanın.

Ardından, istenen konsantrasyonlarda seyreltilmiş bileşikleri ve tam besiyerindeki RPMI'yi ekleyin. Plakaları üç gün boyunca inkübe edin. Çok kanallı pipetler kullanırken, THP1 hücrelerinin rahatsız edilmesini en aza indirmek için piston hareketini yavaş ve sabit bir şekilde gerçekleştirmeyi ve pipet uçlarını her kuyucuğun içinde her zaman aynı noktaya yerleştirmeyi unutmayın.

İnkübasyonun ardından, kuyucuklardaki besiyerini aspire edin ve her kuyucuğa 50 µL lusiferaz analiz reaktifi ekleyin. Ardından plakaları mühürlemek için şeffaf yapışkan plaka sızdırmazlık örtüleri kullanın. Plakaları 22 °C'de beş dakika inkübe edin, ardından bir lüminometre kullanarak kuyucuk başına bir saniye süreyle okuma yapın.

THP1 hücrelerini diferansiyete etmek için, bu videonun önceki kısımlarında gösterildiği gibi diferansiyasyon karışımı hazırlandıktan sonra, hücrelerin bulunduğu şeffaf, 96 kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa 100 µL diferansiyasyon karışımı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, kuyucuklardaki medyumu aspire edin ve kuyucukları iki kez yıkamak için RPMI 1640 kullanın.

Kuyucuklara, RPMI eksik besiyerinde seyreltilmiş bileşiklerden 100 µL ekleyin. Ardından, hücreleri üç gün boyunca inkübe edin. Mililitre başına beş miligramlık bir stok çözelti hazırlamak için 0,5 g MTT'yi 100 mL PBS içinde çözün.

Ardından çözeltiyi filtre ile sterilize edin. Üç günlük inkübasyon süresinin bitimine iki buçuk saat kala, hücrelerin bulunduğu her kuyucuğa 25 µL MTT çözeltisi ekleyin ve inkübasyon süresini tamamlayın. 250 mL DMF'yi 250 mL deiyonize su ile karıştırarak %50'lik dimetilformamid veya DMF hazırlayın.

MTT ekstraksiyon tamponu şu şekilde hazırlanır. 500 mililitrelik bir şişeye 100 gram SDS koyun ve 300 mililitre %50 DMF ekleyin. SDS'nin çözünmesini sağlamak için düşük ısı uygulayın.

10 mililitre saf asetik asit ve 12,5 mililitre bir molar hidroklorik asit ekleyin. Ardından, şişeyi 500 mililitre işaretine kadar %50 DMF ile doldurun. Uygulama süresinin sonunda, her kuyucuğa 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin.

Karışımı, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 570 nm'de absorbansı okuyun. Bir rezazurin testi gerçekleştirmek için, M.tuberculosis'i 7H9 ADST içerisinde mid-log fazına kadar büyütün.

Kültürü 7H9 ADST ile 0,01 OD600 değerine kadar seyreltin. Bileşikleri test konsantrasyonlarının iki katına seyreltmek için 7H9 ADST kullanın. Ardından, seyreltilmiş her bileşikten 100 microliters miktarını şeffaf bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna paylaştırın.

Seyreltilmiş bakteri süspansiyonundan her kuyucuğa 100 microliters aktarın. Plakaları nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 degrees Celsius sıcaklıkta beş gün boyunca inkübe edin. 10 milligrams resazurin'i 100 milliliters deiyonize su içerisinde çözün.

Ve çözeltiyi filtre ile sterilize edin. Kuyucuklara 30 µL resazurin çözeltisi ekleyin. Ardından hücreleri 48 saat boyunca inkübe edin.

Bakteriyel büyüme, rengin maviden pembeye dönmesiyle belirtilir. Kantitatif analizi metin protokolüne göre gerçekleştirin. Bu dağılım grafiği, M.tuberculosis ve THP1 hücreleri üzerinde çeşitli rifampicin konsantrasyonlarının tedavisi için göreceli lüminesans birimleri cinsinden ölçülen ham lüminesans verilerini göstermektedir.

Bu grafikte, işlem görmüş kuyucukların işlem görmemiş kuyucuklara kıyasla yüzde azalması ve lüminesansı gösterilmektedir. Rifampisin, 0,1 micrograms per milliliter konsantrasyonda, hücre içi M.tuberculosis'ten gelen göreli ışık birimlerini veya RLU'ları %99,9 oranında azaltabilmektedir. Bu sonuçlar, daha önce CFU ile belirlenmiş ve yayınlanmış sonuçlarla benzerdir.

Bu şekilde, MTT analizinde kullanılan G1-1H'nin artan konsantrasyonlarının neden olduğu sitotoksisite gösterilmiştir. 10 ve üç mikromolar konsantrasyonlar, IC 50 eşiğinin açıkça altındadır. Bu şekil, farklı konsantrasyonlardaki apramisin antibiyotiğinin M.tuberculosis tarafından gerçekleştirilen rezazurin dönüşümü üzerindeki etkilerini göstermektedir.

Besiyeri içi MIC90 değeri 2.5 ile 5 µg/mL arasındaydı. Bu değer, daha önce yayınlanmış olan 1.5 µg/mL değerinden biraz daha yüksektir. Ancak yine de kabul edilebilir aralık içerisindedir.

Burada gösterildiği gibi, uzun inkübasyon süreleri olan tüm deneylerde buharlaşma önemli hale gelir. Bu nedenle, tutarsızlıkları önlemek için inkübatörlerin iyi nemlendirilmiş tutulmasına özen gösterilmelidir. Bu teknik bir kez kavrandığında, dört gün kadar kısa bir sürede güvenilir hücre içi veriler sağlayabilir.

Bu prosedürü uygularken THP1 hücrelerine karşı nazik olmak ve otomasyon olmadan uygulama yapılıyorsa pipetleme işlemlerinde tutarlı olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, hit bileşiklerin bakteriostatik mi yoksa bakterisid mi olduğunu belirlemek için yüksek içerikli tarama gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu protokol, tüberküloz ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların, insan makrofajları içindeki MTB'ye karşı bileşik etkinliğini hızla değerlendirmelerinin önünü açmıştır.

Microbacterium tuberculosis ile çalışmanın tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu mikroorganizmayı işlerken önlemler alın ve uygun ekipman kullanın.