Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem Mycobacterium tuberculosis

Bu protokolün genel amacı, bileşiklerin insan makrofajları içinde M. tuberculosis sağkalımını nasıl etkilediğinin çok boyutlu değerlendirmesini sağlamaktır. Bu yöntem, Luciferaz bazlı bir etkinlik testine odaklanmıştır. Sitotoksisite ile birleştirildiğinde, bir MIC testi, TB ilaç geliştirmede HIT bileşiklerinin modifikasyonu hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir.

Yöntemimizin en büyük avantajı zamandan ve işçilikten tasarruf sağlamasıdır. Bir CFU koloni oluşturan birim tahlilinin yerine Lusiferaz bazlı bir tahlil getiriliyor. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, otomasyon yerine manuel pipetleme ile tutarlılık konusunda zorlanacaktır.

Tutarlı bir pipetleme tekniği çok önemlidir. THP1 hücrelerini RPMI'de tam ortamda büyütün. Geçişler arasındaki mililitre ortam başına 0.2 ila bir milyon hücre hücre yoğunluğunu korurken.

Aktif olarak büyüyen bir bakteri süspansiyonunun OD600'ünü ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Daha sonra, 0.1 OD600 dönüşüm faktörünü kullanarak bakteri yoğunluğunu hesaplayın, mililitre başına üç çarpı 10 ila yedinci bakteriye eşittir. 10'a bir MOI için yeterli bakteriyi yeni bir santrifüj tüpüne pipetleyin.

Daha sonra bakterileri 10 dakika boyunca 3.000 kez G'de peletleyin. Bakterileri opsonize etmek için, 450 mikrolitre RPMI 1640'a 50 mikrolitre insan serumu ekleyin ve bakteri peletini 500 mikrolitre ortam başına 10 ila sekizinci bakteri yoğunluğunda yeniden süspanse etmek için kullanın. Karışımın 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edilmesine izin verin.

Daha sonra, bir hemositometre ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, THP1 hücre kültürü yoğunluğunu belirleyin. Daha sonra, steril santrifüj tüplerinde, hücreleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 100 kez G'de peletleyin. Süpernatanı aspire edin ve RPMI'deki hücreleri mililitre başına bir milyon hücre yoğunluğunda tam ortamda yeniden süspanse edin.

PMA'yı mililitre başına 40 nanogramlık bir nihai konsantrasyona ekleyin. Bu farklılaşma karışımıdır. Kombine opsonize M. tuberculosis, 10'a bir MOI'de THP1 farklılaşma karışımı ile karıştırılmıştır.

Ve son karışımı, 100 kuyulu beyaz düz tabanlı bir plakada kuyu başına 96 mikrolitre olarak alikotlayın. Daha sonra, farklılaşma ve enfeksiyonun gece boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe etmesine izin verin. Ertesi gün, kuyuları iki kez yıkamak için 100 mikrolitre RPMI kullanın.

Daha sonra istenen konsantrasyonlara seyreltilmiş bileşikleri ve tam ortamda RPMI'yi ekleyin. Plakaları üç gün boyunca inkübe edin. Çok kanallı pipetler kullanırken, THP1 hücrelerinin zarar görmesini en aza indirmek için yavaş ve sabit bir piston hareketi uygulamayı ve pipet uçlarını her zaman her kuyunun içindeki aynı noktaya indirmeyi unutmayın.

İnkübasyonun ardından, ortamı kuyucuklardan aspire edin ve her oyuğa 50 mikrolitre lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin. Ardından plakaları kapatmak için şeffaf yapışkan plaka kapatıcılar kullanın. Plakaları 22 santigrat derecede beş dakika inkübe edin, ardından oyuk başına bir saniyede bir okuma elde etmek için bir luminometre kullanın.

THP1 hücrelerini ayırt etmek için, bu videoda daha önce gösterildiği gibi farklılaşma karışımını hazırladıktan sonra, 100 mikrolitre farklılaşma karışımını berrak, 96 oyuklu bir hücre plakasının her bir oyuğuna dağıtın. Hücreleri gece boyunca %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, besiyerini kuyulardan aspire edin ve iki kez yıkamak için RPMI 1640 kullanın.

Kuyucuklara eksik olan RPMI'de seyreltilmiş 100 mikrolitre bileşik ekleyin. Ardından, hücreleri üç gün boyunca inkübe edin. Mililitre başına beş miligramlık bir stok çözeltisi yapmak için 0.5 gram MTT'yi 100 mililitre PBS'de çözün.

Sonra filtre çözeltiyi sterilize edin. Üç günlük inkübasyon süresinin bitiminden iki buçuk saat önce, her bir hücre oyuğuna 25 mikrolitre MTT çözeltisi ekleyin ve inkübasyon süresini tamamlayın. 250 mililitre DMF'yi 250 mililitre deiyonize su ile karıştırarak% 50 NN dimetilformamid veya DMF hazırlayın.

MTT ekstraksiyon tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın. 500 mililitrelik bir şişeye 100 gram SDS koyun ve 300 mililitre% 50 DMF ekleyin. SDS'nin çözünmesini sağlamak için düşük ısı uygulayın.

10 mililitre saf asetik asit ve 12,5 mililitre bir molar hidroklorik asit ekleyin. Ardından, şişeyi 500 mililitre işaretine kadar doldurmak için %50 DMF kullanın. Tedavi süresinin sonunda, her kuyucuğa 100 mikrolitre ekstraksiyon tamponu ekleyin.

Karışımı, gece boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 570 nanometrede absorbansı okuyun. Bir resazurin testi yapmak için, M. tuberculosis'i 7H9 ADST'de orta kilit fazına kadar büyütün.

Kültürü 7H9 ADST ile 0.01'lik bir OD600'e seyreltin. Bileşikleri test konsantrasyonlarının iki katına kadar seyreltmek için 7H9 ADST kullanın. Ve her seyreltilmiş bileşiğin 100 mikrolitresini şeffaf 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna alikot edin.

Her bir kuyucuğa 100 mikrolitre seyreltilmiş bakteri süspansiyonu aktarın. Plakaları beş gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. 10 miligram resazurini 100 mililitre deiyonize suda çözün.

Ve filtre çözeltiyi sterilize eder. Kuyucuklara 30 mikrolitre resazurin çözeltisi ekleyin. Daha sonra hücreleri 48 saat inkübe edin.

Bakteri üremesi, maviden pembeye bir renk dönüşümü ile gösterilir. Metin protokolüne göre kantitatif analiz yapın. Bu saçılma grafiği, M.tuberculosis ve THP1 hücreleri üzerindeki çeşitli rifampisin konsantrasyonlarının tedavisi için bağıl lüminesans birimlerinde ölçülen ham lüminesans verilerini gösterir.

Bu grafikte, arıtılmamış kuyucuklara kıyasla arıtılmış kuyulardaki azalma ve lüminesans yüzdesi gösterilmiştir. Rifampisin, nispi ışık birimlerinin% 99.9'unu veya hücre içi M.tuberculosis'ten RLU'ları mililitre başına 0.1 mikrogram konsantrasyonda azaltabilir. CFU'dan belirlenen daha önce yayınlanmış sonuçlara benzer.

Bu şekilde, MTT testinde kullanılan artan G1-1H konsantrasyonlarının neden olduğu sitotoksisite gösterilmektedir. 10 ve üç mikromolar konsantrasyonlar, IC 50 sınırının açıkça altındadır. Bu şekil, antibiyotik apramisinin çeşitli konsantrasyonlarının M. tuberculosis tarafından resazurin dönüşümü üzerindeki etkilerini göstermektedir.

Et suyu içi MIC90, mililitre başına 2.5 ila beş mikrogram arasındaydı. Bu, daha önce yayınlanan mililitre başına 1.5 mikrogram değerinden biraz daha yüksektir. Ancak yine de kabul edilebilir aralıkta.

Burada gösterildiği gibi, buharlaşma, uzun inkübasyon süreleri olan tüm deneyler için önemli hale gelir. Bu nedenle, tutarsızlıkları önlemek için inkübatörleri iyi nemlendirmek için özen gösterilmelidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dört gün gibi kısa bir sürede güvenilir hücre içi veriler sağlayabilir.

Bu prosedürü denerken, THP1 hücrelerine karşı nazik olmayı unutmamak ve otomasyon olmadan deniyorsa pipetleme konusunda tutarlı olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, isabet bileşiklerinin bakteriyostatik mi yoksa bakterisidal mı olduğunu belirlemek için yüksek içerikli tarama gibi diğer yöntemler kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu protokol, tüberküloz ilaç keşfi alanındaki araştırmacıların, insan makrofajları içindeki MTB'ye karşı bileşik etkinliğini hızlı bir şekilde değerlendirmelerinin yolunu açtı.

Mikrobakteri tüberkülozu ile çalışmanın tehlikeli olduğunu unutmayın. Bu mikroorganizmayı tutarken önlem ve uygun ekipman kullanın.