Name: Kaplama DNA sentezinin kinetiği İn Vitro Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Öğrenin bakteriyofaj T7 çoğaltma proteinleriyle gecikmiş zincir DNA sentezi kinetiğini incelemeyi. Bu jel bazlı yöntem, Okazaki parçacıkları sentezindeki kritik adımları belirlemeye ve DNA primaz ile polimeraz arasındaki primer transferini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yorumları için C.C.R. laboratuvar üyelerine ve şekil hazırlığı için S. Moskowitz'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Hibe Enstitüleri F32GM101761 (AJH) ve GM54397 (CCR) tarafından desteklenmiştir.

NOT: dahil ancak, eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve uygun akrilik kalkan olarak, sınırlı kişisel koruyucu ekipman kullanımı değil, radyoaktif malzemenin güvenli kullanımı ve bertarafı ile ilgili tüm kurumsal düzenlemelere uyun. Not: standart tampon 40 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA (Bu tampon 5x konsantrasyonda önceden yapılır) ve her dNTP 0.3 mM oluşur. T7 kopyalama proteinleri, 10 9, 8 tarif edildiği gibi saflaştırılır. Tek bir T7 primaz tanıma sitesi (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) ihtiva eden tek şeritli DNA, DNA sentezi, çeşitli şirketler (uzunluğu satın alınabilir ssDNA T7 primaz için, tercih edilen bir enzim bağlı olabilir, bir pentamer tam uzunlukta bir astar sentezlenmesi için en az bir şablon uzunluğu 1Şifreli Cı esas olarak astar polimerazı ile genişletilmesi için ise 1, ancak, ek nükleotidleri şablonunun 3 &#39;ucunda mevcut olması gerekmektedir. Reaksiyonlar, 10 mM MgCl2 nihai bir konsantrasyona ilave edilmesi ile başlatılır ve 25 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Manuel örnekleme 5 saniye veya daha fazla zaman noktaları için iyi çalışır. daha kısa zaman noktası gerekir, doğru veri elde etmek için bir hızlı soğutma akış aleti kullanmak tavsiye edilir. Manuel Örnekleme yoluyla 1. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu <ol><li> Deneye başlamadan önce, formamid boya tamponu kısım 2 uL (% 93 (h / h) formamid, 50 mM EDTA,% 0.01 iksilen siyanol, mavi,% 0.01 bromofenol) 8 1.5 ml polipropilen tüplere. Genel olarak, tüp sayısı analiz zaman noktalarının sayısına eşittir. </li><li> , 1 x tampon, 0.1 mM ATP ve CTP, 0.25 mCi / ml [32P α-] CTP oluşan bir 20 uL karışım hazırlayın 0.1 uM SSD(Heksamer konsantrasyon olarak ifade - 0.6 mcM monomer) NA şablon ve 0.1 uM GP4. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Bir pipet kullanarak karışımı 2 mcL çıkarın ve hiçbir tepki kontrolü (zaman sıfır) için adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüp içinde 2 mL formamid boya tamponu ile karıştırın. </li><li> (10 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar), reaksiyon karışımına 0.1 M MgCl2 2 uL ekleyin. </li><li> El ile 10 s aralıklarla pipet kullanarak reaksiyon karışımlarının 2 uL örneklerinin alınması ve adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüpler içinde predispensed formamid boya ile karıştırın. </li><li> ısı bloğu 5 dakika boyunca 95 ° C de bir ısı örnekleri. </li><li> Bir denatüre jel üzerine örneklerin hacimde yükleyin. bisakrilamid T7 primaz tarafından sentezlenen, küçük tetraribonucleotide astar ürünleri 0.4 mm, kalın% 25 akrilamid çözümlenir (19: 1), 3 M üre, 1 x TBE (100 mM Tris-borat, 1mM EDTA). </li><li> Kromatografi üzerinde tüm jel yerleştirinplastik örtü ile phy kağıt ve kapak. Bir jel kurutucu kullanılarak kuru jel. </li><li> Reaksiyon karışımının geri kalan kısmının bir seyreltme serisi hazırlamak ve kromatografi kağıdı üzerine jel üzerine yüklenmiş aynı ses nokta, yani, numunenin 4 uL yüklendiğindekiyle seyreltme 4 ul nokta. NOT: Bu reaksiyon sırasında oluşan ürün konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri olarak hizmet edecektir. Örneğin, TE tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA), bir dizi yayılan iyi iş kullanarak beş kat seyreltme 1:25 ila 1: 15.625 (5 2 -5 6), ama seyreltme olmalıdır aktivitenin seviyesine bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Bir Phosphorimager ekranını kullanarak kuru jel ve standart Açığa. 12 dilüsyon seri radyoaktivite ölçme ve 8 açıklandığı gibi bir standart eğri oluşturmak Not: Reaksiyon karışımına, T7 DNA polimerazı dahil edilmesi, bir eksa sağlarbenim bu enzim tarafından tetraribonucleotide primerlerin kullanımı. En uygun olarak, polimeraz konsantrasyonu verilerin yorumlanması kolaylaştırmak için doyurarak olmalıdır. 0.4 uM ya da daha yüksek bir polimeraz konsantrasyonu iyi sonuçlar verir. Ek olarak, astar sentezi veya gecikmeli iplikli başlatılması, ya da tek sarmallı DNA bağlayıcı proteinler gibi başka proteinler, etkisi bu şekilde incelenebilir. </li></ol> Bir Rapid-söndürme Enstrüman kullanma 2. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu <ol><li> Reaksiyon karışımlarının hazırlanması <ol><li> 1x tampon, 0.2 mM ATP ve CTP (CTP [32 P α-] 0.5 mCi / mL olmak üzere 0.2 uM GP4 heksamer, 0.2 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP içeren, çözelti A 400 mcL hazırlayın. </li><li> 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Hızlı söndürme akış aracının operasyon <ol><li> rap açınid-söndürme akış enstrüman; Ana menü görünene sonra, cihaz klavyesinde tip 7 ana konumuna şırınga sürücüsü taşımak için. </li><li> &quot;LOAD&quot; Açık tampon şırınga pozisyon. </li></ol></li><li> Yükleme tampon şırıngalar <ol><li> Sürücü şırınga noktasına 10 ml şırınga içeren tampon takın. &quot;LOAD&quot; şırınga topuzu konumunu değiştirin. </li><li> 10 ml şırınga kullanılarak, 10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA ile gösterge tampon hazne A ve B dolum ve söndürme çözeltisi (250 mM EDTA ve% 0.2 SDS) şırınga C doldurun. ve dışarı pistonları iterek hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> &quot;YANGIN&quot; değiştirin topuzu pozisyonları. Tip 2 şırınga sürücü çubuğunun konumunu ayarlamak için. Basın tampon çıkış döngü çıkana kadar şırınga düşürmek için düğmeye &quot;AŞAĞI AYARLA&quot;: (sürekli aşağı 7-gider; 8-büyük bir adım aşağı, 9-küçük bir adım aşağı). Ana menüye dönmek için &quot;ESC&quot; yazın. </li></ol></li><li> yıkama boru <ol><li> Avvakum ach çıkış hattı. Örnek topuzlar için &quot;FLUSH&quot; olarak değiştirin. yatay konuma düğmeleri ayarlayarak yakın tampon şırınga. Vakum açın ve 10 saniye süreyle H 2 O 2 floş döngüler daldırma, daha sonra 10 saniye boyunca MeOH batırın. ~ 15 sn için hava emerek kuru döngüler, veya kuru kadar. </li></ol></li><li> yükleme örnekleri <ol><li> &quot;LOAD&quot; Change örnek topuzu pozisyonu. 1 ml şırınganın içine çözüm A yerleştirin. Numune yük limanlarından birine şırınga takın. Çözelti B için tekrarlayın ve ters örnek yük limanında yerleştirin. </li></ol></li><li> Zaman noktalarında toplanması <ol><li> Ana menüde, söndürme akış çalıştırmak için 1 yazın. Reaksiyon zamanı (ler) ve Enter tuşuna basın, &quot;ENTER&quot;. Reaksiyon döngü numarası gösterilir kullanmak için. Gerekli reaksiyon döngü geçin. Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi. </li><li> Örnek topuzlar için &quot;LOAD&quot; çevirin. Yük reaksiyonu sadece merkezi karıştırma bölmesinin dışına kadar örnek döngüler içinde karışır. tüm düğmelerini açmak için &quot;FIRE &quot;. Bütün kolları doğru konumda olduğundan emin olun. </li><li> çıkış döngü ucuna 1.5 mL tüp yerleştirin. Basın reaksiyonu çalıştırmak için &quot;GO&quot;. Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi. Onlar sürücü vurmak kadar tampon şırıngalar A ve B güncelle. </li><li> İstenen her zaman noktası için adımları yineleyin 2.2.6.2-2.2.6.3. İstisna: Başlangıç reaktifi sıfır zaman noktası kontrolünü söndürülmesi (yani, bu durumda MgCl2) içeren solüsyon yüklemeyin. </li><li> örneklerin toplanması bittiğinde, ana menüye dönmek için &quot;ESC&quot; girin. Basın &quot;7&quot; başlangıç ​​konumuna tampon şırınga sürücüsünü dönün. </li></ol></li><li> Enstrüman temizlik <ol><li> Reaksiyon karışımı şırınga çıkarın. örnek yükleme düğmesini &quot;LOAD&quot; pozisyon çevirin. Vakum altında 10 ml 0.3 NH3 PO 4 ve 10 mL MeOH ve ardından 10 ml 0.2 N NaOH ile her bir örnek döngü yıkayın. </li><li> için &quot;LOAD&quot; pozisyon şırınga topuzlarını çevirin. 3 Syr bastırıninge pistonları reaksiyon ve soğutma tamponlar almak için. Yıkama en az iki kez 5 ml H2O ile şırınga. </li><li> 5 ml H2O ile tekrar şırınga doldurun ve &quot;YANGIN&quot; pozisyon topuzlarını çevirin. Topuzu pozisyon değiştirmek ve adım 2.2.4 deki gibi yıkayın H 2 O. çıkarmak için vakum açın. Cihazı kapatın. Not: adımda 1,7-1,12 tarif edildiği gibi ürünler analiz edildi. Buna ek olarak, T7 DNA polimerazı ve kopyalama proteinleri primer sentezi veya uzantı üzerindeki etkisini analiz etmek için, reaksiyon karışımına ilave edilebilir. </li></ol></li></ol> 3. Tek-ciro Primer Sentez Reaksiyonu NOT: Tek ciro primer sentezi / uzatma deneyleri birkaç büyük farklılıklar, çoklu-ciro reaksiyonlar benzer yürütülmektedir: Bu analizler substratların ancak konsantrasyon, astar veya uzatma ürünleri içine radyoaktif işaretli ATP dönüşüm izleyin ve proteinler considera vardırbly kadar yüksek olur. Buna ek olarak, primer sentezi reaksiyon analizine izin milisaniyelik çözünürlük elde etmek amacıyla, tek bir hızlı-soğutma akış makinesi kullanmak gerekir. <ol><li> Reaksiyon karışımlarının hazırlanması. <ol><li> 1x tamponu, 3 uM GP4 heksamer 6 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP, 1 mM CTP ve 2 nM [P32 γ-] ATP ihtiva eden çözelti, 400 uL hazırlayın. 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Hızlı-soğutma akış işlemi <ol><li> Adım 2.2 &#39;de açıklandığı gibi reaksiyonlar yürütmek. Eğer arzu edilirse, sırasıyla 15 uM ve 20 uM arasında bir konsantrasyonda T7 DNA polimeraz ya da T7 tek kollu DNA bağlanma proteini ekleyin. Bu durumda, uzantı ürünleri reaksiyonun elle örnekleme izin veren bir zaman rejimi birikirler. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> doğrusal olmayan, en hafif sığdır ürün ilerleme eğrilerien küçük kareler yetenekli uyan ve / veya sayısal entegrasyon ticari olarak mevcut yazılım kullanarak kareler modelleri. operasyonun ayrıntıları kullanılan yazılım ile değişir, ancak aşağıda verileri montaj için kullanılan denklemlerin genelleştirilmiş biçimleridir olacaktır. </li><li> lineer bir denklem haline eğrileri ilerlemeye uyan birden fazla devir primer sentezi reaksiyonlarının ürün oluşumunun hızını belirler. Önemli bir kavis ise, tek bir üstel fonksiyon verileri uydurularak başlangıç oranı yöntemi 13, 14 kullanımı: burada: Y (e - k t) = y ürün konsantrasyonu, bir tepkime genlik, k mi gözlenen hız sabiti, t saniye cinsinden zamanı. zaman = 0 teğet çizginin eğimi başlangıçtaki oranıdır. NOT: Bir doğrusal denklem ya da önceden kararlı durum patlama denklemine Fit öncesi kararlı durum primer sentezi reaksiyonları y A (e = - k metTepkime genliği ilk t) + oran ss t, k patlama öncesi kararlı durum patlaması için gözlenen oran sabiti, oran ss kararlı durum oranı ss = k cat [Enzim]) &#39;dir, t zamanı , saniyeler içinde. (- K t e) Tek ciro primer sentezi reaksiyonları tek üstel fonksiyon y = A eğrileri ilerleme takın. GP4 durumunda, ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak, her bir ara enzim ile denge içinde olan, üç NTP kondansasyon adımda, bir model için, sayısal entegrasyonu 15 verileri uygun. </li></ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu deneyler en önemli faktör son derece aktif saflaştırılmış enzim mevcudiyetidir. GP4 ile çalışma sırasında, örneğin, -20 ° C&#39;de% 50 gliserol ihtiva eden tampon maddesi içinde saflaştırılmış enzim depolama (20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde bulunan bir azalmaya yol açar birkaç ay boyunca preparatın spesifik aktivitesi. Bu nedenle, şu anda, saflaştırılmış 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP içinde GP4 ve% 10 gliserol flaş dondurma, küçük numuneleri, sıvı azot kullanı...

DNA replikasyon bütün hücresel yaşam korunmuş bir özelliğidir. Çoğaltma bileşenlerinin kimlik ve sayısı çok çeşitlilik gösterirken, genel mekanizmalar evrim 1 arasında paylaşılır. Burada, T7 replizom bileşenleri ile in vitro koşullarında geri kalmış iplikli DNA sentezinin kinetik anlamaya yönelik radyoaktif substratlar kullanılarak jel bazlı, sürekli olmayan kinetik deneyler tarif eder. Bakteriyofaj T7 çoğaltma makineleri sadece dört protein (DNA polimeraz, GP5, ve processivity faktörü, E coli tiyoredoksin, iki fonksiyonlu primaz-sarmal GP4, ve tek sarmallı DNA bağlama proteini, GP2 oluşan çok basittir. 5) 2. Bu özellik, DNA replikasyonu katılan korunmuş biyokimyasal mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistem yapar. Özel önem, T7 DNA ile ribonükleotid primerlerin oluşumunun yerleştirilir bir Critica primazDNA sentezinin başlamasından l adımı. Buna ek olarak, bir de, reaksiyon karışımına ekleyerek, T7 DNA polimerazı veya başka kopyalama proteinlerine bu primerlerin kullanımı incelenebilir. T7 primaz-helikaz, GP4 primaz tanıma siteleri ya da PRS olarak adlandırılan özel DNA dizileri DNA sentezi için primerlerin oluşmasını (5&#39;-GTC-3 &#39;) katalize eder. PRS sitozin sitenin tanınması için gerekli olan, şifreli, ancak ürünün 3 kopyalanır değildir. GP4 ile astar sentezlenmesinde birinci basamak, daha sonra bir trimer genişletilmiş ve fonksiyonel olarak tetranukleotıd primerlere pppACCC, pppACCA veya pppACAC şablon 4 sekansına bağlı olan dinükleotidin pppAC, oluşturulmasını içerir. Bu primerler daha sonra da GP4 destekli proses 5, 6, DNA sentezini başlatmak için T7 DNA polimerazı ile kullanılabilmektedir. Bu bağlamda, primazetki, çıkmalarını engelleyen, şablonla son derece kısa tetraribonucleotides stabilize polimeraz aktif bölge 7 içine astar / şablon güvence için elverişli bir şekilde DNA polimeraz yürütmektedir. Bu adımlar (RNA primer sentezi, polimeraz primer yayınım ve uzatma) gecikmeli iplikçik çoğaltmak için birden fazla döngüleri tekrarlanır ve lider sarmalı replikasyonu ile koordine edilmelidir. Burada tarif edilen deneyler, son derece hassas olan ve bir orta seviyede bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, nispeten düşük verimlilik ve büyük bir dikkatle radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertaraf olunmalıdır. Reaksiyon, bir sabit veya önceden kararlı durumda ya reaksiyon zamanı derslerin anlamlı analiz için mükellef zaman ölçeklerinde örnekleri ulaşmak için hızlı-söndürme cihazı istihdam olabilir hangi hızına bağlı olarak. Son zamanlarda, biz deneyleri Evidenc sağlamak için burada açıklanan kullanılanOkazaki parçaları başlamasında GP4 ve primaz alanından astar salınımının önemi, e. Ayrıca, verimli astar oluşumu ve kullanımı 8. teşvik, protein, gp2.5 bağlayıcı T7 tek iplikli DNA için bir düzenleyici rolünün kanıt bulunamadı.

<table><tbody><tr><td>Tris önceden ayarlanmış kristaller pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris bazı</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit potasyum tuzu monohidrat</td><td>SIGMA</td><td>G1501 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür hekzahidrat</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiyotreitol</td><td>JT Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>MP Biyomedikaller</td><td>811030</td><td></td></tr> <tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraasetik asit, disodyum tuzu, dihidrat</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>4931-04</td><td></td></tr> <tr><td>[&alpha; -32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radyoaktif, koruyucu önlemler alın</td></tr> <tr><td>[&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radyoaktif, koruyucu önlemler alın</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>dört dNTP,</td></tr><tr><td>setin bir parçası 100 mM, ATP ve CTP</td>, <td>Epicentre</td><td>, RN02825</td>, <td>NTP setinin bir parçası</td></tr><tr><td>, ssDNA yapıları,</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td>, <td>N/A</td><td>, özel diziler&nbsp;</td></tr><tr><td>metanol ve nbsp;</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromofenol mavisi</td><td>SIGMA</td><td>B8026 ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Silen, ksiyanol&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>akrilamid</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toksik</td></tr><tr><td>N, N&prime; -Metilenbisakrilamid</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>zehirli</td></tr><tr><td>Üre</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Borik asit</td><td>Mallinckrodt Kimyasalları</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Söndürme-Akış Cihazı&nbsp;</td><td>Kintek A.Ş.</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Kaşif</td><td>Kintek A.Ş.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>Sinerji Yazılımı</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kaplama dna sentezinin kinetiği<em&gt; İn vitro</em&gt; bakteriyofaj t7 çoğaltma proteinler tarafından

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Burada, bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinleri tarafından in vitro olarak gecikmeli iplikli DNA sentezinin kinetik incelemesi için protokoller sunuyoruz. T7 replizomu, biyokimyasal deneyler için çekici bir özellik olan sadece dört proteinden oluşan, bilinen en basit replikasyon sistemlerinden biridir. DNA polimeraz tarafından DNA sentezini başlatmak için kullanılan T7 primaz-helikaz tarafından ribonükleotid primerlerinin sentezine özel önem verilir. DNA replikasyon mekanizmaları evrim boyunca korunduğundan, bu protokoller diğer model sistemlerini kullanan araştırmacılara uygulanabilir veya kavramsal bir sıçrama tahtası olarak yararlı olmalıdır. Burada açıklanan protokoller oldukça hassastır ve deneyimli bir araştırmacı bu deneyleri gerçekleştirebilir ve yaklaşık bir gün içinde analiz için veri elde edebilir. Gerekli olan tek özel ekipman parçası, hızlı bir söndürme akış cihazıdır, ancak bu ekipman parçası nispeten yaygındır ve çeşitli ticari kaynaklardan temin edilebilir. Bununla birlikte, bu tahlillerin en büyük dezavantajları, radyoaktivite kullanımını ve göreceli düşük verimi içerir.

El ile birden fazla devir koşulları altında GP4 tarafından katalize edilen bir primer sentezi reaksiyonu örnekleme ile, örneğin, bir protokol aşama 1 &#39;de tarif edildiği gibi, şekil 1A&#39;da gösterilen sonuçlar elde edilmiştir. Burada, jel elektroforezinden sonra bir ürün yelpazesi primer sentezi reaksiyonlarının (Şekil 1A) α-konumunda 32 P ile etiketlenmiş CTP kullanılarak gözlemlenebilir. işaretli ön madde, CTP ...

Bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinlerini kullanarak gecikmeli iplik başlatmanın kinetiğini incelemek için hassas, jel bazlı süreksiz tahlilleri tanımlıyoruz.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Bu prosedürün genel amacı, primer ve geciken zincir DNA sentezinin kinetiğini incelemektir. Bu yöntem, primerlerin DNA primaz tarafından nasıl oluşturulduğu, DNA polimeraza nasıl aktarıldığı ve nasıl kullanıldığı gibi DNA replikasyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, Okazaki fragmanı sentezi sırasındaki kritik basamakların belirlenmesine olanak sağlamasıdır.Bu deneyde radyoaktif malzemeler kullanıldığından, radyoaktif malzemelerin güvenli kullanımı ve bertarafına ilişkin tüm kurumsal düzenlemelere uyulmalıdır. Analiz edilecek zaman noktalarının sayısına eşit olan sekiz adet 1,5 mililitrelik polipropilen tüpe iki mikrolitre formamid boya tamponu ekleyerek başlayın. Ardından; tampon, ATP, alfa-fosfat grubu P32 ile işaretlenmiş CTP, tek zincirli DNA kalıbı ve gen dört proteini veya GP dört primaz helikazdan oluşan 20 mikrolitrelik bir karışım hazırlayın.Karışımı oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakika sonra, bir pipetle karışımdan 2 µL alın ve bunu daha önce hazırlanan 1,5 mL tüplerden birinde 2 µL formamid boya tamponu ile karıştırın. Bu, reaksiyonsuz kontrol grubudur.Reaksiyon karışımına iki mikrolitre 0.1 molar magnezyum klorür ekleyin ve hemen bir zamanlayıcı başlatın. 10 saniyelik aralıklarla, reaksiyon karışımından manuel olarak iki mikrolitrelik örnekler alın ve bunları 1.5 mililitrelik tüplerdeki formamid boyasıyla karıştırın. Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, örnekleri bir ısıtma bloğunda 95 derece Celsius'ta beş dakika boyunca ısıtın.Numune alikotlarını elektroforez için denatüre edici bir jale yükleyin. Bu prosedüre reaksiyon karışımlarını hazırlayarak başlayın. Tampon, GP four hekzamer, tek zincirli DNA kalıbı, dNTP'ler, ATP ve alfa-fosfat grubu P32 ile işaretlenmiş CTP içeren 400 microliters çözelti A hazırlayın.Bir X tamponu ve 20 millimolar magnezyum klorür içeren 400 microliter çözelti B hazırlayın. Ardından, hızlı söndürme akış (rapid quench flow) cihazını kurun. Cihazı açın ve ana menü göründükten sonra, şırınga sürücüsünü başlangıç konumuna getirmek için cihaz klavyesinde yediye basın.Yükleme yapmak için tampon şırınga konumunu açın. C şırıngasını söndürme çözeltisiyle doldurun, ardından 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak cihazın A ve B tampon rezervuarlarını tampon ile doldurun. Pistonları içeri ve dışarı iterek hava kabarcıklarını giderin.Düğme konumlarını ateşleme moduna getirin. Şırınga sürücü çubuğunun konumunu ayarlamak için ikiye basın. Tampon çıkış döngüsünden gelene kadar, şırıngayı aşağı indirmek için ayarla aşağı düğmesine basın.Ana menüye dönmek için escape tuşuna basın. Boruları yıkamak için çıkış hattını bir vakuma bağlayın. Numune düğmelerini durulama konumuna getirin.Tampon şırıngasını kapatmak için düğmeleri yatay konuma getirin. Vakumu açın, iki yıkama döngüsünü (flush loops) 10 saniye boyunca suya, ardından 10 saniye boyunca metanole daldırın. Döngüleri yaklaşık 15 saniye boyunca veya kuruyana kadar hava çekerek kurutun.Numuneleri yüklemek için numune düğmesi konumunu yükleme (load) konumuna getirin. Çözelti A'yı bir mililitrelik bir şırıngaya yerleştirin ve şırıngayı numune yükleme portlarından birine takın; aynı şekilde, çözelti B'yi karşıdaki numune yükleme portuna yerleştirin. Bir quench flow çalışması için ana menüde bir yazarak zaman noktalarının toplanmasını başlatın.Reaksiyon süresini girin ve enter tuşuna basın. Kullanılacak reaksiyon döngüsü numarası görüntülenecektir. Gerekli reaksiyon döngüsüne geçiş yapın.Tüpü daha önce gösterildiği şekilde yıkadıktan sonra, numune düğmelerini yükleme konumuna getirin. Reaksiyon karışımlarını, merkezi karıştırma bölmesinin hemen dışına kadar numune döngülerine yükleyin. Tüm düğmeleri ateşleme konumuna getirin ve tüm düğmelerin doğru konumda olduğunu onaylayın.Çıkış döngüsünün ucuna 1,5 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Reaksiyonu başlatmak için "go" düğmesine basın. Boru yıkama prosedürünü tekrarladıktan sonra, tampon şırınga sürücüsüne çarpana kadar A ve B tampon şırıngalarını yeniden doldurun.Sıfırıncı zaman noktası kontrolü söndürülürken çözüm B'yi yüklememek kaydıyla, reaksiyonu çalıştırma adımlarını istenen her zaman noktası için tekrarlayın. Numune toplama işlemi tamamlandığında, ana menüye dönmek için escape tuşuna basın. Tampon şırınga sürücüsünü başlangıç konumuna getirmek için yediye basın.Reaksiyon karışımı şırıngalarını çıkararak cihaz temizliğine başlayın, numune yükleme düğmesini yükleme konumuna getirin. Vakum altında, her bir numune döngüsünü sırayla 10 mililitre sodyum hidroksit, fosforik asit ve metanol ile yıkayın. Reaksiyon ve söndürme tamponlarını geri almak için üç şırınga pistonuna da bastırın.Şırıngaları en az iki kez beş mililitre su ile yıkayın. Şırıngaları tekrar beş mililitre su ile doldurun, düğmeleri ateşleme konumuna getirin, vakumu açın ve suyu uzaklaştırmak için klavye komutuyla sürücüyü aşağı indirin. Tüpleri daha önce gösterildiği şekilde yıkayın.Son olarak, hızlı söndürme akış cihazını kapatın. Numuneler daha sonra metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edilir. Bu sonuçlar, çoklu turnover koşulları altında GP four tarafından katalize edilen bir primer sentez reaksiyonunun manuel olarak örneklenmesiyle elde edilmiştir.İşaretli öncül CTP en yüksek mobiliteyi göstererek jelin altına doğru göç eder; bunu, boyaya ve GP four tarafından sentezlenen tetraribonükleotidlere karşılık gelen daha yavaş göç eden türler izler. İnkübasyon süresine ve şablon dizi bağlamına bağlı olarak, daha yüksek oligomerlere karşılık gelen ek işaretli ürünler gözlemlenebilir. GP four tarafından katalize edilen reaksiyonu saniyelerden birkaç ms'ye kadar olan zaman ölçeklerinde incelemek için hızlı söndürme cihazı kullanıldığında, primer birikiminin lineer olmadığı, aksine düz çizgi ile belirtilen bifazik bir profil sergilediği açıkça görülmektedir.Bu durum, ürün oluşumunun hızlı olduğunu ve kararlı durumda salımın hız belirleyici adım olduğunu göstermektedir. Kesikli çizgi, GP four tarafından primer oluşumunun bir ön-kararlı durum patlaması (pre-steady state burst) ile gerçekleşmediği durumda ortaya çıkacak varsayımsal bir ilerleme eğrisini temsil etmektedir. Tek çevrimli (single-turnover) bir primer sentezi deneyi, substratın ürüne dönüştürülmesi sırasında ara türlerin oluşumu ve yıkımı hakkında bilgi sağlar.Tetramer oluşumunun zaman seyri jel görüntüsü ile gösterilmiştir. Grafik, ara ürün oluşumunun zamana karşı değişimini göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütülmek kaydıyla işlem 90 dakika içinde tamamlanabilir.Radyoaktif reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun zırhlama gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bir çarpışma replisome kaderi ile baş-RNA polimeraz (RNAP) bilinmiyor. Biz DNA RNAP yerinden sonra uzama replisome baş RNAP ile çarpışması üzerine tezgahları, ancak devam eder ki bulabilirsiniz. MFD çarpışmadan sonra RNAP yerinden kolaylaştırarak çoğaltma işlemini yeniden başlatın teşvik etmektedir.

Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

T7 bakteriyofaj numaralandırmak için bir tekrarlanabilir, doğru ve zamanı verimli kantitatif PCR (qPCR) yöntemi burada açıklanmıştır. Protokol açıkça fajının genomik DNA hazırlık, PCR reaksiyon hazırlama, qPCR Bisiklet koşullarını ve qPCR veri analizi açıklar.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Drosophila oogenezi, mitokondriyal proliferasyon ve kalıtım çalışmalarında son derece yararlı olmaya devam ediyor. Bu el yazması, Drosophila yetişkin yumurtalıklarındaki replikasyon yapan mitokondriyal DNA'yı (mtDNA) 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ile etiketlemek için kullanılan ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır, bu da daha önce tartışmalı olan mitokondriyal kalıtımla ilişkili mekanizmaların ortaya çıkarılmasını kolaylaştırmaktadır.

Edu Boyama tarafından Drosophila Yetişkin Yumurtalıkların Mitokondriyal DNA replikasyonu Yerinde Etiketlenmesi içinde

Burada, hücre izolasyonundan dizileme sonuçlarının temel analizine kadar, genom çapında memeli replikasyon zamanlamasını haritalamak için nispeten hızlı ve basit bir yaklaşımı açıklıyoruz. Protokolü takiben temsili bir replikasyon programının genomik haritası sağlanacaktır.

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Öğrenin bakteriyofaj T7 çoğaltma proteinleriyle gecikmiş zincir DNA sentezi kinetiğini incelemeyi. Bu jel bazlı yöntem, Okazaki parçacıkları sentezindeki kritik adımları belirlemeye ve DNA primaz ile polimeraz arasındaki primer transferini anlamaya yardımcı olur.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği

Daha fazla video keşfet