Kaplama DNA sentezinin kinetiği İn Vitro Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Bu prosedürün genel amacı, primer ve gecikmeli iplikçik DNA sentezinin kinetiğini incelemektir. Bu yöntem, DNA replikasyonu alanındaki, DNA primazı tarafından oluşturulan primerlerin DNA polimeraza nasıl aktarıldığı ve DNA polimeraz tarafından nasıl kullanıldığı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, Okazaki parça sentezi sırasında anahtar adımların tanımlanmasına izin vermesidir.

Bu deneyde radyoaktif malzemeler kullanıldığından, radyoaktif maddelerin güvenli kullanımı ve bertarafı ile ilgili tüm kurumsal düzenlemelere uyulmalıdır. İki mikrolitre formamid boya tamponunu, analiz edilecek zaman noktalarının sayısına eşit olan sekiz adet 1.5 mililitrelik polipropilen tüpe alikotlayarak başlayın. Daha sonra, alfa-fosfat grubu üzerinde P32, tek sarmallı DNA şablonu ve gen dört proteini veya GP dört primaz helikaz ile etiketlenmiş tampon, ATP, CTP, CTP'den oluşan 20 mikrolitrelik bir karışım hazırlayın.

Karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonra, karışımın iki mikrolitresini çıkarmak için bir pipetleyici kullanın ve daha önce hazırlanan 1.5 mililitrelik tüplerden birinde iki mikrolitre formamid boya tamponu ile karıştırın. Bu reaksiyon kontrolü yok.

Reaksiyon karışımına iki mikrolitre 0.1 molar magnezyum klorür ekleyin ve hemen bir zamanlayıcı başlatın. 10 saniyelik aralıklarla, reaksiyon karışımının iki mikrolitrelik numunesini manuel olarak çekin ve 1.5 mililitrelik tüplerde formamid boya ile karıştırın. Tüm zaman noktaları toplandıktan sonra, numuneleri beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir ısı bloğunda ısıtın.

Numunelerin alikotlarını elektroforez için denatüre edici bir jel üzerine yükleyin. Reaksiyon karışımlarını hazırlayarak bu işleme başlayın. Alfa-fosfat grubu üzerinde P32 ile etiketlenmiş tampon, GP dört heksamer, tek sarmallı DNA şablonu, dNTP'ler, ATP, CTP ve CTP içeren 400 mikrolitre çözelti A hazırlayın.

Bir X tamponu ve 20 milimolar magnezyum klorür içeren 400 mikrolitre B çözeltisi hazırlayın. Ardından, hızlı söndürme akışı cihazını ayarlayın. Enstrümanı açın ve ana menü göründükten sonra, şırınga sürücüsünü başlangıç konumuna getirmek için enstrüman klavyesinde yedi yazın.

Yüklemek için tampon şırınga konumunu açın. Şırınga C'yi söndürme solüsyonu ile doldurun, ardından 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, alet tampon rezervuarları A ve B'yi tamponla doldurun. Pistonları içeri ve dışarı iterek hava kabarcıklarını çıkarın.

Ateş etmek için düğme konumlarını değiştirin. Şırınga sürücü çubuğunun konumunu ayarlamak için iki yazın. Tampon çıkış döngüsünden çıkana kadar şırıngayı indirmek için ayar düğmesine basın.

Ana menüye dönmek için escape yazın. Hortumu yıkamak için çıkış hattını bir vakuma takın. S'yi değiştirinample düğmeleri yıkamak için.

Tampon şırıngayı kapatmak için düğmeleri yatay konuma getirin. Vakumu açın, iki yıkama halkasını 10 saniye suya batırın ve ardından 10 saniye metanole batırın. İlmekleri yaklaşık 15 saniye veya kuruyana kadar hava emerek kurutun.

Numuneleri yüklemek için, yüklemek için numune düğmesi konumunu değiştirin. Çözelti A'yı bir mililitrelik şırıngaya yerleştirin, şırıngayı numune yükleme portlarından birine takın, aynı şekilde çözelti B'yi karşı numune yükleme portuna yerleştirin. Bir su verme akışı çalıştırması için ana menüye bir tane yazarak zaman noktaları toplamaya başlayın.

Tepki süresini girin ve enter tuşuna basın. Kullanılacak reaksiyon döngü numarası görüntülenecektir. Gerekli reaksiyon döngüsüne geçin.

Tüpü daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, yüklemek için numune düğmelerini çevirin. Reaksiyon karışımlarını, merkezi karıştırma bölmesinin hemen dışına kadar numune döngülerine yükleyin. Tüm düğmeleri ateşlemek için çevirin ve tüm düğmelerin doğru konumda olduğunu onaylayın.

Çıkış halkasının ucuna 1,5 mililitrelik bir tüp yerleştirin. Tepkiyi çalıştırmak için git tuşuna basın. Boru yıkama prosedürünü tekrarladıktan sonra, tampon şırınga sürücüsüne çarpana kadar tampon şırıngaları A ve B'yi yeniden yükleyin.

İstenen her zaman noktası için reaksiyonu çalıştırma adımlarını tekrarlayın, bir istisna dışında, sıfır zaman noktası kontrolünü söndürürken B çözeltisini yüklemeyin. Örnek toplama işlemi bittiğinde, ana menüye dönmek için escape tuşuna basın. Tampon şırınga sürücüsünü başlangıç konumuna döndürmek için yediye basın.

Reaksiyon karışımı şırıngalarını çıkararak cihazı temizlemeye başlayın, numune yükleme düğmesini yük konumuna çevirin. Vakum altında, her bir numune halkasını 10 mililitre sodyum hidroksit, fosforik asit ve metanol ile yıkayın. Reaksiyonu almak ve tamponları söndürmek için üç şırınga pistonunun tümüne bastırın.

Şırıngaları en az iki kez beş mililitre su ile yıkayın. Şırıngaları tekrar beş mililitre su ile doldurun, düğmeleri ateş konumuna getirin, vakumu açın ve suyu çıkarmak için klavye komutuyla sürücüyü aşağı indirin. Hortumu daha önce gösterildiği gibi yıkayın.

Son olarak, hızlı söndürme akışı cihazını kapatın. Numuneler daha sonra metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edilir. Bu sonuçlar, çoklu devir koşulları altında GP four tarafından katalize edilen bir primer sentez reaksiyonunun manuel olarak örneklenmesiyle elde edildi.

Etiketli öncü CTP, en yüksek hareketliliği gösterir ve jelin dibine doğru göç eder, ardından GP dört tarafından sentezlenen boya ve tetraribonükleotidlere karşılık gelen daha yavaş göç eden türler gelir. İnkübasyonun uzunluğuna ve şablon dizisi bağlamına bağlı olarak, daha yüksek oligomerlere karşılık gelen ek etiketli ürünler gözlemlenebilir. GP dört tarafından katalize edilen reaksiyonu birkaç ms'ye kadar saniye aralığındaki zaman ölçeklerinde incelemek için hızlı bir söndürme cihazı kullanıldığında, primer birikiminin doğrusal olmadığı, ancak katı çizgi ile gösterilen iki fazlı bir profil gösterdiği açıktır.

Bu, ürün oluşumunun hızlı olduğunu ve serbest bırakmanın kararlı durumda hız sınırlayıcı olduğunu gösterir. Noktalı çizgi, GP dördüncü tarafından primer oluşumunun kararlı bir durum patlaması öncesi ilerlememesi durumunda ortaya çıkacak varsayımsal bir ilerleme eğrisini temsil eder. Tek devirli bir primer sentezi deneyi, substratın ürüne dönüştürülmesi sırasında ara türlerin oluşumu ve bozunması hakkında bilgi sağlar.

Tetramer oluşumunun bir zaman seyri jel görüntüsü ile gösterilmiştir. Grafik, zamana karşı ara oluşumu gösterir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa 90 dakika içinde yapılabilir.

Radyoaktif reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun koruma gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.