Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Bu prosedürün genel amacı, hepatik akut faz yanıt medyatörlerine karşı CRP ve IL6 gibi enflamatuar sitokinlerin ekspresyonunu ve sekresyonunu incelemek için fonksiyonel fare hepatositlerini başarıyla izole etmektir. Bu yöntem, hepatosellüler fonksiyonlara ve kronik böbrek hastalığında görülen uzun süreli enflamatuar ortama hepatik sitokinlerin katkısına dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı; hepatik metabolomik ve enflamasyonun yanı sıra ilaçlara verilen yanıtın basit, hızlı ve tekrarlanabilir bir analizi için güçlü bir araç sağlamasıdır.

Başlamak için, karaciğer perfüzyon ortamını ve karaciğer sindirim ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutun. Bir perfüzyon pompasını burada gösterildiği gibi kurun. Ardından, pompanın tüp sistemini dikkatlice önceden doldurmak için karaciğer perfüzyon ortamını kullanın.

Sistemde hava kabarcığı oluşmamasına özen gösterin. Stereotaktik mikroskobu perfüzyon prosedürü için hazırlayın. Ardından, donör fareyi metin protokolüne uygun olarak anesteziye aldıktan sonra, anestezi altındaki hayvanı emici bir pedin üzerine yerleştirin.

Farenin ekstremitelerini sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Ardından, farenin abdomenini tıraş edin ve dezenfekte edin. Daha sonra, pubisten karaciğerin kranial sınırına kadar ventral laparotomi gerçekleştirmek için ucu küt ve keskin cerrahi makas kullanın.

Karın duvarını, diyaframın kaudal pozisyonunda her iki taraftan kesin. Steril pamuklu çubuklar kullanarak bağırsakları dikkatlice sağ tarafa çekip vena cava inferior'u veya IVC'yi açığa çıkarın. İnce cerrahi makaslar ve keskin uçlar yardımıyla, suprahepatik diyafram boyunca lateral insizyonlar yapın ve toraks boşluğunu açın.

Ardından, torasik IVC'yi bağlamak için 5-0 cerrahi ipek kullanın. Korumalı bir IV kateter ile infrarenal IVC'yi kanüle edin. Perfüzyon pompasını bağlayın ve karaciğer perfüzyonuna başlayın.

Doğru şekilde uygulandığında, karaciğer hemen beyazlamaya ve şişmeye başlamalıdır. Ardından, ince cerrahi makaslarla portal veni kesin ve kan ile perfüzyon ortamının uygun şekilde drenajını sağlayın. Karaciğeri yaklaşık 30 mililitre karaciğer perfüzyon ortamı ile perfüze ettikten sonra perfüzyon pompasını durdurun.

Karaciğer sindirim ortamına geçin ve pompayı yeniden çalıştırın. Perfüzyon tamamlandığında kanülü çıkarın. Karaciğerin merkez bölgesini nazikçe açığa çıkarın ve karaciğer loblarını birbirine bağlayan bağ dokusunu bulun.

Merkezi bağlantı liflerini tutun ve karaciğeri yerinde tutan tüm dokuları dikkatlice diseke edin. Ardından karaciğeri nazikçe çıkarın. Organı hemen, 15 mililitre karaciğer sindirim medyumu içeren 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe aktarın.

Hücre kültürü kabininde çalışırken, karaciğeri 50 mililitrelik polipropilen konik tüpten steril bir doku kültürü kabına aktarın. Steril pensler yardımıyla, karaciğerin dört lobunu nazikçe parçalayın. İşlem doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, hepatositlerin karaciğerden izole edilmesi nedeniyle sindirim ortamı bulanıklaşmalıdır.

Sindirilmemiş doku parçacıklarını ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için, bulanık sindirim ortamını 25 mililitrelik steril bir pipet ucu kullanarak 70 mikrometrelik naylon hücre süzgeci üzerinden yeni bir 50 mililitrelik polipropilen konik tüpe süzün. Birleştirilmiş filtratı dört derece Celsius'ta iki dakika boyunca 50 ×g hızında santrifüjleyin, ardından fazla hücre kalıntılarını içeren süpernatantı aspire edin ve hücreleri nazikçe yeniden süspande etmek için 25 mililitre soğuk 1X William's Medium E kullanın. Hepatositlerin süzme ve yıkama işlemlerini üç kez tekrarladıktan sonra, fazla hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatantı aspire edin.

Hücreleri, primer hepatosit çözme ve ekim takviyeleri içeren 25 mililitre sıcak 1X William's Medium E içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu yeni bir 70 mikrometre naylon hücre süzgeci aracılığıyla 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Hücreler sayıldıktan sonra, primer hepatosit çözme ve ekim takviyeleri içeren iki mililitre William's Medium E içinde, kolajen kaplı altı kuyucuklu bir hücre kültürü plağına ekimleyin. Hücreleri aç bırakmak için iki kez ortam değişimini takiben; hücreleri serumsuz ortamda araç olarak PBS, 25 nanogram per mililitre FGF23, 100 mikrogram per mililitre LPS veya 50 nanogram per mililitre IL6 ile muamele edin.

Kültürleri 24 saat boyunca inkübe edin. Üretici talimatlarına uygun olarak bir spin kolon kiti kullanarak RNA hazırladıktan sonra, izole edilen RNA'dan 200 nanogramı bir PCR tüpüne ekleyin. Ardından tüpe 14 mikrolitre endonükleaz içermeyen su ve dört mikrolitre ters transkriptaz ekleyin.

PCR tüpünü termosikletöre yerleştirin ve cDNA üretmek için aşağıdaki ters transkripsiyon programını çalıştırın. Kantitatif PCR gerçekleştirmek için, aşağıdaki QPCR master mix bileşenlerini buz üzerinde bir tüpte birleştirin. Master mix'i vorteksleyin.

Ardından, çözeltiden dokuz mikrolitreyi 96 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna paylaştırın. Her örnek için üç kuyucuk hazırlayacak şekilde, her kuyucuğa dikkatlice bir mikrolitre cDNA ekleyin. Son olarak, örnekleri gerçek zamanlı PCR cihazında çalıştırın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin.

Primer izole edilmiş ve kültüre edilmiş hücrelerin temsili bir ışık mikroskopisi görüntüsü burada gösterilmiştir. İmmünositokimyasal analiz, izole hepatositlerin albumin ve fibroblast büyüme faktörü reseptörü 4'ü yüksek düzeyde eksprese ettiğini göstermektedir. Bu deneyde, primer izole hepatositler 24 saat boyunca FGF23, LPS veya IL6 ile muamele edilmiş ve CRP ile IL6 mRNA düzeyleri kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmiştir.

LPS, IL6 ve FGF23; CRP ve IL6 ekspresyonunu önemli ölçüde artırmıştır. Burada gösterildiği üzere, izole primer hepatositlerden elde edilen hücre kültürü süpernatantları, CRP seviyeleri için ELISA ile analiz edilmiştir. QPCR analizi ile kanıtlandığı üzere, LPS, IL6 ve FGF23 uygulamaları, PBS ile işlem görmüş hücrelerle karşılaştırıldığında, hücre süpernatantlarındaki CRP seviyelerini önemli ölçüde artırmıştır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken steril bir ortamın sürdürülmesinin önemli olduğunu hatırlamak gerekir. Primer kültürle çalışıldığı için, optimal sonuçlar elde etmek adına olası kontaminasyon riskini en aza indirmek büyük önem taşır.

Bu videoyu izledikten sonra, hepatik sitokinlerin ekspresyonu ve sekresyonu gibi çeşitli hepatosellüler fonksiyonları incelemek amacıyla murine hepatositlerin nasıl başarıyla izole edileceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.