Name: Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Öğrenin, farelerde multipl skleroz EAE modelinde optik nörit ve beyin enflamasyonunu biyoparlaklık görüntüleme ile canlı olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, tedavi etkinliğini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) ve araştırma fonu programı Hessen, Translasyonel Tıp ve Farmakoloji TMP Araştırma Merkezi Devlet &quot;Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) ve Else Kröner-Fresenius Vakfı tarafından desteklenen (EKFS), Araştırma Eğitim Grubu Translational Araştırma Yenilik - Pharma (AÇMA).

SJL 1. EAE İndüksiyon / J Fareler <ol><li> fareler <ol><li> 11 haftalık dişi SJL / J fareler kullanın ve onları yaklaşık 7 gün boyunca deneysel odasına alıştırmak için izin verir. Grup başına n = 10 fare kullanın. </li><li> ilaç etkilerinin değerlendirilmesi için, sürekli olarak içme suyu yoluyla ya da 3 ya da 5 gün Aşıdan sonra (n = 10 grup başına) başlangıç ​​gıda pelet yoluyla kontrol grubunda ilaç ve plasebo yönetmek. Hastalığın zirve sırasında, süt ya da% 3 şekerli su ile ıslatılmış mısır gevreği ile ilaç ya da plasebo yönetmek. </li></ol></li><li> Aşılama malzemesi <ol><li> Tam Freund katkı maddesi (CFA, ısı ile öldürülmüş Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) ve 2 şişeler (5 ug her biri) ile bir emülsiyon içinde bir EAE indüksiyon kiti antijenini içeren (proteolipid protein peptidi, PLP139-151, 1 mg / ml emülsiyon) kullanarak liyofilize boğmaca toksin (PTX). </li><li> 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde PTX (2 ug / ml) (PBS içinde çözülür, yani, &lt;/ Em&gt;), aynı bir pipet ucu ile kaldırma, iyice karıştırın ve 50 ml bir tüp içinde 1 mL PBS ile eklemek için, her PTX tüpüne PBS 1.5 mL eklemek; iyice karıştırın. </li></ol></li><li> aşılama <ol><li> kuyruk dibinde, 2 kısım halinde, her 100 uL, her iki PLP / CFA deri altına enjekte edilir. Üst sırt ya da boyun deride herhangi bir immün reaksiyonlar baş ve omurilik görüntüleme rahatsız olacaktır, çünkü boyun arkasına enjekte etmeyin. </li><li> aşılamadan sonra 2 saat ve 24 saat sonra ikinci - iki kez, fare başına intraperitonal PTX (ip), 100 uL, önce, 1 enjekte edilir. </li><li> kontrol fareleri için, PLP olmadan PLP olmadan CFA (100 uL 2 porsiyon) artı PTX enjekte edilir. </li></ol></li><li> Fare aşılama sonrası işleme <ol><li> farelere günde 7 her geçen gün yukarı tartılır ve daha sonra onları her gün tartın. NOT: Fareler yaklaşık 1 kaybetmek - EAE sırasında vücut ağırlığının 2 g. düşüş EAE başlangıcına işaret. </li><li> gün 7 anlaşmanın günlük klinik semptomları değerlendirmekmotor fonksiyonlarda belirgin bir değişiklik; 0.5 puan: Standart skorlama sistemlerine ing (yani 0 Skor kuyruk distal felç; 1 puan: tam kuyruk paralizi; 1,5 puan: Bir veya her iki arka bacaklarda hafif parezi; 2 puan: arka ayakları şiddetli parezi; skoru 2.5: bir arka bacak tam paralizi; skoru 3: Her iki arka ayakları tam felç, 3.5 puan. arka ayakları ve bir ön bacak parezi tam felç 3.5 veya daha yüksek puanları ile fareler Euthanize &gt; 12 saat. </li></ol></li><li> EAE ders ve görüntüleme zamanı <ol><li> aşılamadan sonra 12 - fareler günde 10 civarında oluşacak puanları&gt; 1, ulaştığınızda, hastalığın başlangıcında ilk görüntüleme gerçekleştirmek. </li><li> 3 gün - ilk belirtileri gelişebilir sonra 1 ya da 2 gün ulaşılacaktır ve 1 sürecek zirve, ikinci görüntüleme gerçekleştirmek. NOT: Daha sonra, fareler tamamen 7 ila 10 gün içinde iyileşir. aralarda görüntüleme hala vasküler sızıntıları gösterebilirancak inflamasyon göstergeleri negatif olmalıdır. </li></ol></li></ol> 2. Bioluminescent ve Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Yakın kızılötesi görüntüleme <ol><li> Görüntüleme sisteminin Kur <ol><li> Biyolüminesans ve yakın kızılötesi sinyallerin analizi için izin veren herhangi bir ekipman ile in vivo görüntüleme gerçekleştirin. </li><li> Tüm görüntüleme işlemleri sırasında% 2.5 izofluran anestezisi - 2 altında fareler tutun. </li><li> Pozisyon bir veya orta gaz tedarikini kullanarak aygıtında yanyana iki fare. merkezde üst omurga yerleştirin. </li><li> ilaç etkilerinin değerlendirilmesi çiftleri karşılaştırmak için, aynı anda iki fare, grup başına birini kullanın. Bu bio-ışıldar görüntüleme için önemlidir. </li><li> siyah bezle bağışıklama siteyi kalkan ve fare / farelerin doğru konumlandırma değerlendirmek için bir fotoğraf ve temel görüntü almak. Tüm görüntüler için kameraya 6.5 cm mesafe ile B-odak kullanın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon ve biyolojik olarak ışık veren inflamasyon prob görüntüleme <ol><li> In vivo görüntüleme sistemi ayarları kullanın: 8 binning Epi-BLI, Em açık filtre, Ex filtre bloğu, fStop 1, B = 6.5 cm, reklam maruz kalma 120 s odak; temel bir görüntü çekmek. </li><li> Hazır kullanımlı kemilüminesan bir reaktif (40 mg / ml), 100 uL ip enjekte edilir. şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın. </li><li> biyolüminesans görüntüleri 5, 10, ve enjeksiyon sonrası 15 dakika yakalayın. biyolüminesans zirve zaman ders hayvanlar arasında farklılık gösterir. NOT: pik 5 oluşacak - enjeksiyondan sonra 10 dakika; 15 dakika bir düşüş başka görüntüler gerekli olduğunu göstermektedir. nedeniyle farklı zaman kursları küçük önyargıları ortadan kaldırmak için kontrol ve tedavi grupları fare çiftleri kullanınız. </li><li> deney ile ilgili açıklamalarda doldurun. otomatik olarak açılır bir iletişim kutusu gözlemlemek; Böyle fare suşu, cinsiyet, zaman noktasında, sonda enjeksiyon, grubun, vb gibi bilgileri içerir. Dosyaları tüm o kaydetne klasör; Onlar zaman etiketleri ve tüm açıklamaları olacaktır. </li></ol></li><li> BBB bütünlüğü için yakın kızılötesi floresan nanopartiküller Enjeksiyon ve görüntüleme <ol><li> B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. pegile floresan nanopartiküllerin uyarma / emisyon maxima 675/690 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 binning 2 s pozlama, kullanabilir ve fStop 2. bir temel görüntü çekin. </li><li> kuyruk damar yoluyla pegile floresan kızılötesi nanopartiküllerin 70 mcL iv enjekte edilir ve fareler 3 saat ve üzeri ayarları kullanarak enjeksiyondan sonra 24 saat düşünün. şırınga doldurmadan önce çözüm iyice karıştırın. </li><li> sinyalin özelliğini değerlendirmek için gerekli olacak kontrol farelerinde,% 0.9 sodyum klorür enjekte edilir. </li></ol></li><li> Enjeksiyon ve MMP aktivitesi için yakın kızılötesi flüoresan probun görüntüleme <ol><li> Tıraş veya baş atmaktadır ve uBazal görüntüsünü almadan önce dikkatli bir gün pper omurga bölgesi. Cilt yaralı olmamalıdır. </li><li> B-odak (6.5 cm mesafe) yakın-kızılötesi Epifloresans görüntüleme kullanın. MMP aktive edilebilir prob uyarım / emisyon maksimum 680/700 nm. Ex640 / Em700 ve Ex675 / Em720 farklı dalga boylarında, iki görüntü yakalamak; 8 kutulamanın 1-s maruz kullanımı ve fStop 2. Bir taban çizgisi görüntüsü al. </li><li> 10 fareler için yeterli olacak şekilde hazır kullanım çözeltisi (1 x PBS içinde 20 nmol / 1.5 mL) içinde 1.5 mL bir tüpe 200 uL 1x PBS ilave et; şırınga doldurmadan önce iyice karıştırın. NOT: sağlanan hacim bazı ses şırınga doldurma ve enjeksiyon sırasında kaybolur dikkate almaz. </li><li> görüntüleme önce kuyruk damar yoluyla 24 saat sonda iv 150 mcL enjekte edilir. sinyalin özelliğini değerlendirmek için tek kontrol hayvanlarında PBS enjekte edilir. </li><li> enjeksiyondan 24 saat sonra, en az iki dalga boylarında, Ex640 / Em700 ve Ör 675 / E&#39;de Epi-FL görüntüleri çekmekM720, ayarları (8 ve Fstop 2 binning 1-s pozlama odak B) Yukarıda açıklanan. NOT: İki dalga boyu kullanımı belirsiz sinyal çıkarılarak spektral unmixing sağlar. </li></ol></li></ol> 3. Görüntü Analizi <ol><li> Biyoparlaklık analizi (BLI) <ol><li> açmak için yazılım çift tıklatın. </li><li> Üst menü çubuğunda, deney klasörün dizine gidin ve onu seçin, dosya tarayıcı ikonuna tıklayın; Bu tablodaki klasördeki tüm dosyaları açacak. </li><li> deney ile ilgili açıklamalar gösteren sütunları yapılandırın. </li><li> kalite kontrolü için, EAE sinyallerinin özgüllüğünü kontrol etmek EAE ve / veya naif fare semptomu olmayan bir yanıtsızlık fare dosyasına çift tıklayın. NOT: naif farelerde ve non-cevap farelerde az sinyal sinyal olmalıdır. <ol><li> pro enjeksiyonundan önce bazal görüntüyü kontrolsinyalin özgüllük daha kontrol olarak her fare için olacak; negatif olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir görüntüyü seçmek için, ilk EAE fare ilk dosyasına çift tıklayın ve biyolüminesens yoğunluğunu (LUT çubuğu aralık) ve yerelleştirme kontrol edin. Tüm görüntüleri teker teker kontrol edin. Her fare için en düşük yoğunlukla dosyayı kapatın (yani, her fare için 2 out of 3 görüntüleri tutmak). </li><li> Görüntü ayarı ve ihracat <ol><li> sayısal olarak ilk dosyasını çift tıklatın. Yeni bir penceresi açılır gözlemleyin. &quot;Seçenekleri&quot; (üst menü) altında, her görüntüde görüntülemek için etiketleri özelleştirebilirsiniz. </li><li> Doğru aracı paletinde, gidin &quot;görüntü ayarı.&quot; Varsayılan olarak, minimum ve maksimum şiddetleri &quot;auto&quot; olarak ayarlanır ve gökkuşağı Pseudocolor görüntülenir. Gerekirse ayarları değiştirmek için &quot;el&quot; i seçin. NOT: Örneğin, tüm ihraç görüntüleri aynı LUT çubukları (aynı minima ve maxima) olabilir kolayca karşılaştırılabilir olması.asgari ve azami ayarlanması nicel sonuçlar üzerinde hiçbir etkisi yoktur. </li><li> görüntü ihracat seçin png, dizin ve bir resim adını tıklayın </li></ol></li><li> İlgi Bölgeler miktarının belirlenmesi (YG) <ol><li> araç paletinde &quot;ROI&quot; aracı gidin. ROI yöntemi (daire, dikdörtgen, otomatik ya da serbest el) ve ROI sayısını seçin. ROI pencere görüntü penceresinde açılır gözlemleyin. </li><li> Fareyi kullanarak, boyutunu ve konumunu ayarlamak. Otomatik ROI aracı kullanıldığı takdirde tüm görüntüler için aynı ROI eşikleri kullanın. YG boyutları ve konumları elle (örneğin, dairesel ROI) tanımlanmış olup olmadığını tüm görüntüler için aynı yerlerde kullanın. </li><li> RO.I. yeni penceresi açılır gözlemleyin ölçmek &quot;üzerine tıklayın. Sütunları özelleştir (örneğin, dosya adı, hayvan sayısı, grup, deney, alan, toplam sayım, ortalama sayısı, SD sayımı, min ve max sayar, alan, zaman nokta, sonda enjeksiyonu, vb) zamanı. özelleştirilmiş ayarları kaydedin. ne zaman yenidenady, bütün (Ctrl + A) seçin ve kopyalayıp bir elektronik tabloya tablo yapıştırın. </li><li> yerinde ROI ile png görüntü olarak dışa aktarın. Kaydet ve görüntü dosyasını kapatın. </li></ol></li><li> sayısal gereken tüm resim dosyaları için - prosedürü tekrarlayın (3.1.7 3.1.6 adımlar). elektronik tabloya tüm ROI quantifications kopyalayın. NOT: Burada, sonuçları vb grubunda, zaman noktasında, sıralanabilir ve istatistiksel analiz edildi. istatistiksel analizler için ROI biyolüminesens sinyallerinin toplam sayılarını kullanın. </li></ol></li><li> Floresan nanopartiküllerin Near-Infrared (NIR) analizi <ol><li> Yazılımda kontrolleri kullanarak, görüntünün eşiğini ayarlayın. NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. </li><li> Görme sinyalin özelliğini değerlendirmek için Ex / Em 675/720 ve Ex / Em 640/700 çekilen görüntüleri karşılaştırın. </li><li> kantitatif analiz için Ex / Em 675/720 yakalanan görüntüleri kullanın (uyarma maksimum: 680 nm). Otomatik ROI aracı kullanılabileceği için İB&#39;leri, tanımlayın. Otomatik ROI eşiğini ayarlamak ve tüm görüntüler için kullanabilirsiniz. ROI toplam radyant verimlilik ölçmek (adım 3.1). </li></ol></li><li> Proteaz duyarlı prob Near-Infrared (NIR) analizi <ol><li> Yazılım denetimlerini kullanma, görüntünün eşiğini ayarlayın. NOT: Bu nicel sonuç üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. otomatik floresans spektral Karışmama gerçekleştirin. Karışmama aracı Image Yaşayan uygulanmaktadır. Otomatik Karışmama otomatik floresan görüntü olarak özel ve 675/720 Ex / Em 640/700 kullanır. </li><li> karışmamış görüntü seçin ve yukarıda açıklandığı gibi, ROI tanımlar. Nicel ve istatistiksel analizler için ROI toplam radyant verimlilik kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(08)61620-7/abstract">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dunn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+mobility+impairment+on+the+burden+of+caregiving+in+individuals+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Pharmacoecon+Outcomes+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of mobility impairment on the burden of caregiving in individuals with multiple sclerosis.</a> Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 10 (4), 433-440 (2010).</li>
<li>Dutta, R., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neuronal+dysfunction+and+degeneration+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neuronal dysfunction and degeneration in multiple sclerosis.</a> Prog Neurobiol. 93 (1), 1-12 (2011).</li>
<li>Sawcer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+risk+and+a+primary+role+for+cell-mediated+immune+mechanisms+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic risk and a primary role for cell-mediated immune mechanisms in multiple sclerosis.</a> Nature. 476 (7359), 214-219 (2011).</li>
<li>Schmitz, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-flurbiprofen+attenuates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> EMBO Mol Med. 6 (11), 1398-1422 (2014).</li>
<li>Balls, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+early+days+of+the+Three+Rs+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Altern+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The origins and early days of the Three Rs concept.</a> Altern Lab Anim. 37 (3), 255-265 (2009).</li>
<li>Barthelmes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis+in+Mice+and+Evaluation+of+the+Disease-dependent+Distribution+of+Immune+Cells+in+Various+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues.</a> J Vis Exp. (111), (2016).</li>
<li>Leahy, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+trajectory+of+osteoarthritis+development+in+a+mouse+model+by+serial+near-infrared+fluorescence+imaging+of+matrix+metalloproteinase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the trajectory of osteoarthritis development in a mouse model by serial near-infrared fluorescence imaging of matrix metalloproteinase activities.</a> Arthritis Rheumatol. 67 (2), 442-453 (2015).</li>
<li>Scales, H. E., et al. Assessment of murine collagen-induced arthritis by longitudinal non-invasive duplexed molecular optical imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScales%2C+HE+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22">Rheumatology (Oxford)</a>. 55 (3), 564-572 (2016).</li>
<li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+channel+optical+tomographic+imaging+of+leukocyte+recruitment+and+protease+activity+in+the+healing+myocardial+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Dual channel optical tomographic imaging of leukocyte recruitment and protease activity in the healing myocardial infarct.</a> Circ Res. 100 (8), 1218-1225 (2007).</li>
<li>Eaton, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tomographic+imaging+of+near+infrared+imaging+agents+quantifies+disease+severity+and+immunomodulation+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo.</a> J Neuroinflammation. 10, (2013).</li>
<li>Kandagaddala, L. D., Kang, M. J., Chung, B. C., Patterson, T. A., Kwon, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activation+of+matrix+metalloproteinase-9+and+NADPH+oxidase+in+tissues+and+plasma+of+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Expression and activation of matrix metalloproteinase-9 and NADPH oxidase in tissues and plasma of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice.</a> Exp Toxicol Pathol. 64 (1-2), 109-114 (2012).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fluorescence+imaging+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ fluorescence imaging of myelination.</a> J Histochem Cytochem. 58 (7), 611-621 (2010).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.jneurosci.org/content/31/7/2382">Longitudinal near-infrared imaging of myelination.</a> J Neurosci. 31 (7), 2382-2390 (2011).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+involved+in+T+cell+migration+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier.</a> J Neural Transm. 113 (4), 477-485 (2006).</li>
<li>Badawi, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+EAE+and+prevention+of+blood-brain+barrier+breakdown+after+vaccination+with+novel+bifunctional+peptide+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Suppression of EAE and prevention of blood-brain barrier breakdown after vaccination with novel bifunctional peptide inhibitor.</a> Neuropharmacology. 62 (4), 1874-1881 (2012).</li>
<li>Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+heterogeneity+of+multiple+sclerosis+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals.</a> Trends in immunology. 34 (8), 410-422 (2013).</li>
<li>Lin, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+fMRI+detects+white-matter+dysfunction+in+mice+with+acute+optic+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Diffusion fMRI detects white-matter dysfunction in mice with acute optic neuritis.</a> Neurobiol Dis. 67, 1-8 (2014).</li>
<li>Knier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+IL-17+protects+the+optic+nerve+from+autoimmune+pathology+and+prevents+retinal+nerve+fiber+layer+atrophy+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Neutralizing IL-17 protects the optic nerve from autoimmune pathology and prevents retinal nerve fiber layer atrophy during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Autoimmun. 56, 34-44 (2015).</li>
<li>Schellenberg, A. E., Buist, R., Yong, V. W., Del Bigio, M. R., Peeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+of+blood-spinal+cord+barrier+disruption+in+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging of blood-spinal cord barrier disruption in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Magn Reson Med. 58 (2), 298-305 (2007).</li>
<li>Mori, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+pathological+alterations+of+lower+lumbar+cords+detected+by+ultrahigh-field+MRI+in+a+mouse+multiple+sclerosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Early pathological alterations of lower lumbar cords detected by ultrahigh-field MRI in a mouse multiple sclerosis model.</a> Int Immunol. 26 (2), 93-101 (2014).</li>
<li>Bittner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+TWIK-related+potassium+channel-1+%28TREK1%29+regulates+immune-cell+trafficking+into+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial TWIK-related potassium channel-1 (TREK1) regulates immune-cell trafficking into the CNS.</a> Nat Med. 19 (9), 1161-1165 (2013).</li>
<li>Theien, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+treatment+with+a+small-molecule+VLA-4+antagonist+before+and+after+onset+of+relapsing+EAE%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential effects of treatment with a small-molecule VLA-4 antagonist before and after onset of relapsing EAE.</a> Blood. 102 (13), 4464-4471 (2003).</li>
<li>Hawkins, B. T., Davis, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%2Fneurovascular+unit+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease.</a> Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).</li>
<li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> J Immunol. 182 (10), 5909-5913 (2009).</li>
<li>Andresen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-resolution intravital microscopy.</a> PLoS One. 7 (12), e50915(2012).</li>
<li>Bukilica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+suppression+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress-induced suppression of experimental allergic encephalomyelitis in the rat.</a> Int J Neurosci. 59 (1-3), 167-175 (1991).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Mevcut Video SJL / J farelerinde EAE in vivo görüntüleme biyolüminesans ve yakın kızılötesi floresan teknikleri göstermektedir. Biz bir enflamasyon duyarlı prob kullanılarak biyolüminesans görüntüleme esas optik nörit gösterir ve miktar EAE şiddetinin klinik değerlendirme ve ilaç etkileri ile uyumlu olduğunu göstermektedir. Sinyal omurga tarafından emilir Ancak, biyolüminesans görüntüleme yöntemi olasılıkla, EAE tezahürü 17 birincil site lomber spinal kord, iltihabı tespit etmek mümkün d...

Multipl skleroz, beyin ve omurilikteki miyelin kılıfının otoimmün aracılı saldırısı ve yıkımı sonucu oluşur1. Kadınlarda yılda 100.000 kişi başına yaklaşık 3.6 vaka ve erkeklerde yaklaşık 2.0 vaka insidansı ile MS, travmatik yaralanmalardan sonra genç erişkinlerde nörolojik engelliliğin ikinci en yaygın nedenidir2,3. Hastalık patolojisine genetik ve çevresel faktörler katkıda bulunur4 ancak hala tam olarak anlaşılamamıştır. Otoreaktif T lenfositleri merkezi sinir sistemine girer ve beynin, omuriliğin ve optik sinirin beyaz cevherinde fokal infiltrasyonlara neden olan inflamatuar bir kaskadı tetikler. Çoğu durumda, bu sızıntılar başlangıçta geri dönüşümlüdür, ancak kalıcılık nüks sayısı ile artar. Hastalığın patolojisini incelemek için bir dizi kemirgen modeli geliştirilmiştir. SJL/J farelerinde nükseden-düzelen EAE ve C57BL6 farelerde birincil-progresif EAE en popüler modellerdir.
Motor fonksiyon eksikliklerinin derecesini ve vücut ağırlığını tanımlayan klinik EAE skorları, EAE şiddetini değerlendirmek için altın standartlardır. Bu klinik belirtiler, omurilikteki immün hücre infiltrasyonu ve miyelin yıkımının derecesi ile uyumludur ve insanlarda ilaç tedavisi etkinliğini orta derecede tahmin eder5. Bununla birlikte, bu işaretler esas olarak omurilikteki ventral lif yollarının tahribatını yansıtır. Şu anda, canlı farelerde in vivo beyin infiltrasyonu ve optik nöriti değerlendirmek için kolay, invaziv olmayan, güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem yoktur. 
 in vivo görüntüleme, Russel ve Burch'un (1959) hayvan deneylerinin Ryerleştirmesi, Rindüksiyonu ve Rarıtması olduğunu iddia eden 3 "R" ilkesiyle uyumludur6, çünkü görüntüleme bir hayvanın okumalarını birkaç zaman noktasında artırır ve toplam sayıların azaltılmasına izin verir. Şu anda, inflamasyon veya miyelin durumu esas olarak immünohistokimya, FACS analizi veya farklı moleküler biyolojik yöntemler yoluyla ex vivo olarak değerlendirilmektedir 7, tümü belirli zaman noktalarında ötenazi fareleri gerektirir. 
Deri, eklemler ve vasküler sistemdeki iltihabı değerlendirmek için bir dizi in vivo görüntüleme sistemi probu geliştirilmiştir. Teknikler, miyeloperoksidaz (MPO), matris metaloproteinazlar (MMP'ler<), sup class='xref'>8 ve katepsins9 veya siklooksijenaz2 dahil olmak üzere doku peroksidazları tarafından biyolüminesan veya yakın kızılötesi floresan substratların aktivasyonuna dayanır. Bu problar esas olarak artrit veya ateroskleroz modellerinde doğrulanmıştır9,10. EAE11'in floresan moleküler tomografik görüntülemesi için katepsine duyarlı bir prob da kullanılmıştır. MMP'ler, özellikle MMP2 ve MMP9, EAE'de proteaz aracılı BBB bozulmasına katkıda bulunur ve bağışıklık hücresi infiltrasyonu bölgelerinde yukarı regüle edilir12, bu probların EAE görüntüleme için yararlı olabileceğini düşündürmektedir. Aynısı peroksidaz veya katepsin bazlı problar için de geçerlidir. Teknik olarak, beyin veya omurilikteki iltihabın görüntülenmesi önemli ölçüde daha zordur çünkü kafatası veya omurga biyolüminesan ve yakın kızılötesi sinyalleri emer. 
Enflamasyon göstergelerine ek olarak, özellikle miyeline bağlanan ve miyelinasyon13'ün miktar tayinine izin verebilecek floresan kimyasallar tanımlanmıştır. Yakın kızılötesi bir floresan probu olan 3,3'-dietiltiyatrikarbosiyanin iyodürün (DBT), miyelinli liflere spesifik olarak bağlandığı bulundu ve primer miyelinasyon kusurlarının fare modellerinde ve cuprizone ile uyarılmış demiyelinizasyon14. EAE'de, miyelin liflerinin iltihaplanmasını yansıtan DBT sinyali oldukça artmıştır5. 
EAE ve MS'nin ek bir ayırt edici özelliği, vasküler geçirgenliğin artmasına ve kan hücrelerinin, hücre dışı sıvının ve makromoleküllerin CNS parankimine ekstravazasyonuna neden olan BBB parçalanmasıdır. Bu, ödem, iltihaplanma, oligodendrosit hasarına ve sonunda demiyelinizasyon15,<sup class='xref'>16'ya yol açabilir. Bu nedenle, normalde kandan dokuya çok yavaş dağılan florokrom etiketli sığır serum albümini5 gibi floresan problar kullanılarak BBB sızıntısının görselleştirilmesi, EAE'yi değerlendirmek için yararlı olabilir.
Bu çalışmada, EAE'deki farklı probların kullanışlılığını değerlendirdik ve en güvenilir ve sağlam biyolüminesan tekniğinin prosedürünü gösterdik. Ek olarak, MMP aktivitesi ve BBB bütünlüğü için yakın kızılötesi probların artılarını ve eksilerini tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, ABD</td><td>NEV10149</td><td>Görüntüleme probu, pegile nanopartiküller, kan beyin bariyeri bütünlüğünün görüntülenmesi için yararlıdır</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, ABD</td><td>NEV10126</td><td>Görüntüleme probu, matris metaloproteinazlar tarafından aktive edilebilir, iltihabın görüntülenmesi için yararlıdır</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect İnflamasyon Probu</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, ABD</td><td>760535</td><td>Oksidazlar tarafından aktive edilebilen, inflamasyonun görüntülenmesi için yararlı</td></tr><tr><td>olan görüntüleme probu PLP139-151 / CFA emülsiyonu &nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE indüksiyon kiti</td></tr><tr><td>Boğmaca Toksini</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>EAE indüksiyon kiti</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, ABD</td><td></td><td>Biyolüminesans ve Kızılötesi Görüntüleme Sistemi</td></tr><tr><td>LivingImage 4.5 yazılımı&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, ABD</td><td>CLS136334</td><td>IVIS analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, ABD</td><td>26675-46-7</td><td>Anestezi</td></tr></tbody></table>

farelerde multipl skleroz eae modeli optik nörit ve beyin enflamasyon biyoparlaklık ve yakın-kızılötesi görüntüleme

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

SJL / J farelerde deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) tekrarlayan-düzelen multipl skleroz (RRMS) için bir modeldir. fonksiyon kayıpları tarif Klinik EAE puanları omurilik bağışıklık aracılıklı iltihaplanma temel okumalar vardır. Ancak, puanları ve vücut ağırlığı, beyin iltihabı ve optik nörit in vivo değerlendirilmesi için izin vermez. İkincisi yaklaşık 2/3 MS hastalarının erken ve sık bulgusudur. Burada, bir in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak canlı farelerde biyolüminesans ve EAE optik nörit uyarılmış değerlendirmek için yakın kızıl ötesi canlı görüntüleme, beyin iltihabı ve kan-beyin bariyeri (KBB) bozulması için yöntemler göstermektedir. oksidazlar ile aktive olan bir biyolüminesens alt tabaka öncelikle optik nörit gösterdi. Sinyal özgü ve klinik skorları paralel ilaç etkileri ve hastalık süresi derslerin görselleştirme, izin verdi. vasculatur içinde kalmıştır pegile floresan nanopartiküllerUzun bir süre için, e KBB devamlılığını değerlendirmek için kullanıldı. Yakın-kızılötesi görüntüleme hastalığının zirvesinde BBB sızıntısı tespit edildi. Sinyal göz çevresindeki en güçlü oldu. Matris metaloproteinazların için yakın kızılötesi alt-tabaka EAE uyarılmış iltihabı değerlendirmek için kullanıldı. Otomatik floresans ölçümü için spektral Karışmama gerektiren sinyaline müdahale. Genel olarak, biyoparlaklık görüntüleme EAE ilişkili optik nevrit ve ilaç etkilerini değerlendirmek için güvenilir bir yöntem olduğunu ve sinyal özgüllük, sağlamlık, ölçme kolaylığı ve maliyet açısından yakın kızılötesi tekniklerden üstündü.

Optik nörit Bioluminescence Zaman Kursu inflamasyon prob biyoparlaklık sinyal göz çevresindeki en güçlü ve optik nevrit EAE farelerde sadece oluştu. Bir sinyal olmayan EAE fareler ne de inflamasyon probu ile enjekte olmayan farelerde ne oluştu. fareler kurtarıldı zaman sinyal kayboldu. Bu nedenle, bir sinyal, optik nevrit özgüdür, ve sinyal tepe Klinik EAE puanları tepe paraleldir. Şekil 1 EAE...

Biz, in vivo canlı biyolüminesans ve yakın kızılötesi SJL / J farelerinde multipl skleroz için deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) modelinde optik nevrit ve ensefalit görüntüleme tekniğini göstermektedir.

Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Bu görüntüleme tekniğinin genel amacı, yaşayan farelerdeki multipl skleroz EAE modelinde optik nörit ve beyin inflamasyonunu görselleştirmek ve nicelleştirmektir. Yöntem, EAE ve multipl sklerozun seyrini etkileyen yeni mekanizmalar gibi nöroimmünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, EAE tarafından tetiklenen optik nörit ve beyin inflamasyonunun, hastalığın seyri boyunca yaşayan farelerde gözlemlenebilmesi ve nicelleştirilebilmesidir.Bu tekniğin etkileri tedaviye doğru genişlemektedir çünkü EAE skorlarından anlaşılamayan ilaç etkilerini gözlemleyebilmekteyiz. Bu prosedürde, PTX'i 1x PBS içinde iki mikrogram/mililitre konsantrasyonda çözün ve iyice karıştırın. Ardından, kısa süreli isoflurane anestezisi altında 100 mikrolitre PLP/CFA'yı farelerin kuyruk tabanına iki kez deri altına enjekte edin.Ense bölgesine enjeksiyon yapmayın, çünkü üst sırt veya boyun derisindeki herhangi bir immün reaksiyon, baş ve omurilik görüntülemesini bozacaktır. İmmünizasyondan bir ila iki saat sonra, farelere intraperitonal olarak 100 microliters PTX enjekte edin. Ardından, immünizasyondan 24 saat sonra, farelere tekrar 100 microliters PTX enjekte e

bioluminescence-near-infrared-imaging-optic-neuritis-brain

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, bir EAE fare modelinde kan-beyin bariyeri bozulmasını değerlendirmek için bir prosedürü göstermektedir. Farklı boyutlardaki floresan boyalar retro-orbital olarak enjekte edilir ve beynin kan damarlarında dolaşır. Daha küçük boya, boşluklardan beyin dokusuna sızarken, daha büyük boya, yalnızca bozulma şiddetli olduğunda girer ve bariyer hasarının derecesi ile ilişkilidir.

Bir EAE Fare Modelinde Floresan Boyalar Kullanılarak Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Belirlenmesi

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Kaynak: Breid, S., et. al. Alfa-sinüklein Fibrillerinin Periferik Aşılanmasından Sonra Transgenik Farelerde Nöroinflamasyonun Biyolüminesans Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, transgenik farelerde nöroinflamasyonun biyolüminesans görüntülemesini göstermekte ve aktive edilmiş astrositlerde lusiferaz-lusiferin reaksiyonlarını göstermektedir. Protokol, astrositik aktivasyonun non-invaziv olarak ölçülmesini sağlayarak CNS inflamasyonu ve terapötik etkinlik üzerine çalışmalara yardımcı olur.

Transgenik Bir Farede Nöroinflamasyonun Biyolüminesans Görüntülemesi

style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Source: Schmitz, K., et al., Farelerde Multipl Skleroz EAE Modelinde Optik Nörit ve Beyin İltihabının Biyolüminesansı ve Yakın Kızılötesi Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, optik sinirde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit veya EAE'nin neden olduğu iltihabı görselleştirme ve izleme yöntemini göstermektedir. biyolüminesans görüntüleme. Fareyi konumlandırmayı, reaktif enjeksiyonunu ve zaman içinde biyolüminesanstaki...

EAE Fare Modelinde Biyolüminesans Görüntüleme

Deneysel otoimmün ensefalomiyeliti incelemek için yetişkin farelerin açıkta kalan omurilikleri üzerine cam pencerelerin implante edilmesi ve bakımı için bir yöntem açıklıyoruz. Bu pencereler, iki foton mikroskobu kullanarak canlı hayvanlarda hücre altı düzeyde hücre dinamiklerini izlemek için omuriliğe kronik optik erişim sağlar.

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows&#39;u implante

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü spektral etki alanı optik Koherens tomografi gibi görüntüleme teknikleri açıklar ve lazer ophthalmoscopy tarama bir oftalmik görüntüleme platformu üzerinde bilgi edinme sistemiyle küçük Rodents yararlı olabilir dağıtım, hücre sırasıyla retina kalınlığı ve mikroglial.

Vivo Tayf alanlı optik Koherens tomografi ve lazer Ophthalmoscopy tarama Cx3cr1gfp/gfp muhabir farelerin görüntüleme

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu protokol, miyelin oligodendrosit glikoprotein kullanılarak bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelitin indüklenmesini ve klinik bir skorlama sistemi kullanılarak hastalık sürecinin izlenmesini açıklamaktadır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit ile ilişkili semptomlar, hastalık sürecini kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için fare femur mikro-bilgisayarlı tomografi analizi ve açık alan testi kullanılarak analiz edilir.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitin İndüksiyonu ve Çeşitli Değerlendirme Göstergeleri

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl sklerozun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Bu makalede EAE'de spinal kord inflamasyonu, demiyelinizasyon ve aksonal yaralanmayı skorlamaya yönelik bir yaklaşım anlatılmaktadır. Ek olarak, canlı farelerde aksonal hasarın değerlendirilmesini kolaylaştıran, fare serumundaki çözünür nörofilament ışık seviyelerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelitte Merkezi Sinir Sistemi İnflamasyonu, Demiyelinizasyon ve Akson Hasarının Skorlanması

Öğrenin, farelerde multipl skleroz EAE modelinde optik nörit ve beyin enflamasyonunu biyoparlaklık görüntüleme ile canlı olarak değerlendirmeyi. Bu yöntem, tedavi etkinliğini gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

Farelerde Multipl Skleroz EAE Modeli Optik Nörit ve Beyin Enflamasyon Biyoparlaklık ve Yakın-Kızılötesi Görüntüleme

Daha fazla video keşfet