Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Bu deneyin genel amacı, ligand kaplı manyetik mikro boncuklar ve yapışma reseptörlerine zorla uygulama kullanılarak gerilime yanıt olarak aktive edilen biyokimyasal yolları araştırmaktır. Bu yöntem, ekspres helometriden gelen mekanik gerilimin onları farklılaşmadan nasıl yönlendirdiği veya doku uyumunun dönüşümlerini nasıl yönlendirdiği gibi mekanik işlem alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, birçok hücrenin, yapışma reseptörlerinin spesifik alt kümesine gerilim uygulamak için boncuklar kullanılarak kimyasal analiz için uyarılabilmesidir.

Başlamak için, en az 30 saniye girdaplama yaparak orijinal şişedeki süper paramanyetik tosilaktive edilmiş boncukları iyice yeniden süspanse edin. 40 mikrolitre yeniden süspanse edilmiş süperparamanyetik boncukları, bir mililitre 0.1 molar sodyum fosfat pH 7.4 içeren 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne alıkoyun. Ardından, manyetik boncukları çözeltiden ayırmak için tüpü manyetik bir ayırma standına yerleştirin.

Süpernatanı atın ve tüpü manyetik ayırma standından çıkarın. Boncukları bir mililitre 0.1 molar sodyum fosfat pH 7.4'te yeniden süspanse edin. Boncukları iki kez yıkadıktan sonra, boncukları aynı tamponun bir mililitresinde tekrar süspanse edin.

Daha sonra, 100 mikrogram sığır fibronektini veya başka herhangi bir hücre yapışma reseptör ligandını boncuklara ve girdaba birleştirin. Negatif kontroller için ligandı BSA, poli-D-lizin veya apotransferrin ile değiştirerek bu adımı tekrarlayın. Boncukları, bir rotor üzerinde 37 santigrat derecede 12 ila 24 saat boyunca ligand içeren çözelti ile inkübe edin.

Reaksiyon meydana geldikten sonra boncuk agregaları ortaya çıkarsa, 10 ila 20 saniyeden fazla olmamak üzere sonikat yapın. Ardından, manyetik bir ayırma standı kullanarak boncukları izole edin ve kalan çözeltiyi aspire edin. Daha sonra% 0.2 sığır serum albümini ile desteklenmiş bir mililitre PBS çözeltisi ekleyin.

37 santigrat derecede bir rotor üzerinde bir saat inkübe edin. Bir mıknatıs kullanarak, boncukları iki kez% 0.2 sığır serum albümini ile desteklenmiş bir mililitre PBS çözeltisi ile yıkayın. Onları aynı tamponun bir mililitresinde yeniden askıya almadan önce.

Agregalar 20 ila 30 saniyeden fazla görünmüyorsa boncukları sonikleştirin. Hücre tahlillerine devam edin veya boncukları bir aya kadar dört santigrat derecede saklayın. Yapışık hücreleri, 60 mililitrelik bir doku kültürü kabında% 80 birleşmeye ulaşana kadar uygun büyüme ortamında kültürleyin.

Ligand kaplı boncukları peletledikten sonra, peleti% 0.2 sığır serum albümini ile desteklenmiş bir mililitre PBS çözeltisinde yeniden süspanse edin. Beş mililitre ılık kültür ortamına ve girdaba 100 mikrolitre ligand kaplı boncuk çözeltisi ekleyin. Daha sonra, ortamı 60 mililitrelik bir kültür kabında aspire edin ve boncuklarla desteklenmiş beş mililitre ılık büyüme ortamı ekleyin.

Boncukların çökelmesini ve hücrelere yapışmasını sağlamak için süspansiyonu hücre kültürü koşulları altında 20 dakika inkübe edin. Boncuklar fagositoz ile içselleştirilebileceğinden 20 dakikayı geçmemek çok önemlidir. Ardından, 10X veya 20X objektif kullanarak boncukları ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Bağlı ve yüzen boncuklar arasında ayrım yapmak için tabağı hafifçe sallayarak boncuk yapışmasını kontrol edin. Normal bir 38 milimetre kültür kabı kapağının üst yüzüne yuvarlak bir 60 milimetre neodimyum mıknatıs yerleştirin ve kapağın alt yüzüne yerleştirilmiş iki küçük 13 milimetre neodimyum mıknatıs kullanarak yerinde tutun. İstenilen zaman noktaları ve hücre kültürü koşulları için gerilime maruz kalan hücreleri inkübe edin.

Normal tabak kapağını mıknatıslı bir kapakla değiştirin. Mıknatıs çok güçlü olduğundan, onları dikkatlice manipüle edin. İşlemden sonra, çanağı buzun üzerine yerleştirin ve tüm ortamı tabaktan dikkatlice aspire edin.

300 mikrolitre hücre lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak lizatı toplayın ve önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Manyetik ayırma standını kullanarak manyetik boncukları peletleyin ve toplam hücre lizatını yeni, önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Western blot analizi için boncuk ayrılmasından sonra elde edilen toplam hücre lizatından 15 mikrolitrelik bir alikotu çıkarın. Boncukları bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Sonra, boncuk peletine 50 mikrolitre numune tamponu ekleyin.

Süspansiyonu girdaplama ile karıştırdıktan sonra, kuru bir blok ısıtıcı kullanarak 95 santigrat derecede beş dakika kaynatın. Bu fraksiyon, izole edilmiş yapışma komplekslerini içerir. Biyokimyasal analize devam edin veya fraksiyonu eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Bu şekil, yapışma komplekslerinin saflaştırılmasını göstermek için gösterilmiştir. GAPDH immünoblotlama, toplam hücre lizatı için bir yükleme kontrolü olarak ve adezyon komplekslerinin saflığını kontrol etmek için kullanılır. Saflaştırılmış yapışma kompleksi fraksiyonunda sitoplazmik sinyalin yokluğunu doğrulamak için uzun bir pozlama kullanıldı.

Fibronektin kaplı boncuklar, gerilime yanıt olarak yapışma komplekslerinde zamanla meydana gelen mekano-transdüksiyon süreçlerini araştırmak için kullanıldı. Adezyon kompleksi fraksiyonunun manyetik olarak ayrılmasından sonra, lizat ve adezyon kompleksi fraksiyonu western blot ile analiz edildi. Yükleme kontrolü ve mekanik gerilime yanıt olarak adezyon komplekslerinde işe alındığı veya fosforile edildiği bilinen adaylar immünoblotlandı.

Gerilim, Paxillin'in adezyon komplekslerine alımını etkilemezken, tirozin 31 üzerindeki fosforilasyonu, hem toplam hücre lizatında hem de adezyon kompleksi fraksiyonunda mekanik gerilime yanıt olarak arttırıldı. Bu videoyu izledikten sonra, manyetik boncuklar kullanarak yapışma yüzey proteinlerine gerilim kuvvetlerinin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa iki saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, güçlü mıknatıslara karşı dikkatli olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kinaz aktivitesinin gerilim tarafından düzenlenip düzenlenmediği gibi ek soruları yanıtlamak için western blotları, aktin polimerizasyon testi veya enzimatik test gibi biyokimyasal çalışmalar yapılabilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların hücrelerdeki manyetik hassas sinyal yollarını keşfetmelerine yardımcı olabilir.