Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Bu deneyin genel amacı, ligand kaplı manyetik mikroboncuklar ve adhezyon reseptörlerine zorunlu uygulama kullanarak gerilime yanıt olarak aktive olan biyokimyasal yolları araştırmaktır. Bu yöntem, mekanotransdüksiyon alanındaki, dışsal helometriklerin mekanik geriliminin onları farklılaşmaya nasıl yönlendirdiği veya doku kompliyansının transformasyonlarını nasıl tetiklediği gibi soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, spesifik adhezyon reseptörü alt kümelerine gerilim uygulamak için boncuklar kullanarak, kimyasal analiz için birçok hücrenin stimüle edilebilmesidir.

Başlamak için, süper paramanyetik tosyl-aktive boncukları orijinal şişe içerisinde en az 30 saniye vorteksleyerek tamamen resüspande edin. Resüspande edilen süperparamanyetik boncuklardan 40 µL'yi, içinde 1 mL 0.1 M sodyum fosfat pH 7.4 bulunan 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından, manyetik boncukları solüsyondan ayırmak için tüpü bir manyetik ayırma standına yerleştirin.

Süpernatanı atın ve tüpü manyetik ayırma standından çıkarın. Boncukları bir mililitre 0.1 molar sodyum fosfat pH 7.4 içerisinde yeniden süspanse edin. Boncukları iki kez yıkadıktan sonra, boncukları bir mililitre aynı tampon içerisinde yeniden süspanse edin.

Ardından, boncuklara 100 µg sığır fibronektini veya başka herhangi bir hücre adezyon reseptörü ligandı ekleyin ve vortekslayın. Negatif kontroller için ligandı BSA, poli-D-lizin veya apotransferrin ile değiştirerek bu adımı tekrarlayın. Boncukları, ligand içeren çözelti ile birlikte bir rotor üzerinde 37 °C'de 12 ila 24 saat inkübe edin.

Reaksiyon gerçekleştikten sonra boncuk agregatları oluşursa, 10 ila 20 saniyeden fazla olmamak üzere sonikasyon uygulayın. Ardından, bir manyetik ayırma standı kullanarak boncukları izole edin ve kalan çözeltiyi aspire edin. Daha sonra, %0,2 sığır serum albüminu ile desteklenmiş bir mL PBS çözeltisi ekleyin.

37 °C'de bir rotor üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Bir mıknatıs kullanarak, boncukları %0,2 sığır serum albümini eklenmiş 1 mL PBS çözeltisi ile iki kez yıkayın. Ardından bunları aynı tampon çözeltiden 1 mL içerisinde yeniden süspande edin.

Topaklanmalar görülürse boncukları 20 ila 30 saniyeden fazla olmayacak şekilde sonikasyona tabi tutun. Hücre analizlerine geçin veya boncukları dört degrees Celsius'ta bir aya kadar saklayın. Adherent hücreleri, %80 konfluense ulaşana kadar uygun büyüme ortamında 60 mililitrelik bir doku kültürü kabında kültüre edin.

Ligand kaplı boncuklar çöktürüldükten sonra, peleti %0,2 bovine serum albumen ile desteklenmiş bir mililitre PBS solüsyonunda yeniden süspande edin. Ligand kaplı boncuk solüsyonundan 100 mikrolitreyi beş mililitre ılık kültür ortamına ekleyin ve vorteksleyin. Ardından, 60 mililitrelik bir kültür kabındaki ortamı aspire edin ve boncuklarla desteklenmiş beş mililitre ılık büyüme ortamı ekleyin.

Boncukların çökelmesine ve hücrelere tutunmasına izin vermek için süspansiyonu hücre kültürü koşullarında 20 dakika inkübe edin. Boncuklar fagositoz yoluyla hücre içine alınabileceği için 20 dakikayı aşmamak kritik önem taşır. Ardından, boncukları 10X veya 20X objektif kullanarak bir ışık mikroskobu altında gözlemleyin.

Yapışmış ve yüzen boncukları ayırt etmek için kabı hafifçe sallayarak boncuk yapışmasını kontrol edin. Normal bir 60 milimetrelik kültür kabı kapağının üst yüzeyine yuvarlak bir 38 milimetrelik neodimyum mıknatıs yerleştirin ve kapağın alt yüzeyine konumlandırılmış iki adet daha küçük 13 milimetrelik neodimyum mıknatıs kullanarak sabit tutun. Gerilime maruz bırakılan hücreleri istenen zaman noktalarında ve hücre kültürü koşullarında inkübe edin.

Normal kapak yerine mıknatıslı kapağı takın. Mıknatıslar çok güçlü olduğundan, onları dikkatli bir şekilde kullanın. İşlemden sonra kabı buz üzerine yerleştirin ve kaptaki tüm besiyerini dikkatlice aspire edin.

300 µL hücre lizis tamponu ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Ardından, lizatı bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve önceden soğutulmuş 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın. Manyetik ayırma standı kullanarak manyetik boncukları çöktürün ve toplam hücre lizatını yeni, önceden soğutulmuş 1,5 mL mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Western blot analizi için boncuk ayırma işleminden sonra elde edilen toplam hücre lizatından 15 µL'lik bir alikot alın. Boncukları, bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, boncuk peletine 50 µL örnek tamponu ekleyin.

Süspansiyon vorteksleme ile karıştırıldıktan sonra, kuru blok ısıtıcı kullanarak 95 °C'de beş dakika boyunca kaynatın. Bu fraksiyon, izole edilmiş adezyon komplekslerini içerir. Biyokimyasal analize geçin veya fraksiyonu -20 °C'de saklayın.

Bu şekil, adezyon komplekslerinin saflaştırılmasını göstermek amacıyla sunulmuştur. GAPDH immünoblotlama, toplam hücre lizatı için yükleme kontrolü olarak ve adezyon komplekslerinin saflığını kontrol etmek için kullanılmıştır. Saflaştırılmış adezyon kompleksi fraksiyonunda sitoplazmik sinyalin yokluğunu doğrulamak için uzun pozlama uygulanmıştır.

Gerilime yanıt olarak adezyon komplekslerinde zamanla meydana gelen mekanotransdüksiyon süreçlerini incelemek için fibronektin kaplı boncuklar kullanıldı. Adezyon kompleksi fraksiyonunun manyetik ayrımının ardından, lizat ve adezyon kompleksi fraksiyonu western blot ile analiz edildi. Yükleme kontrolü ile mekanik gerilime yanıt olarak adezyon komplekslerine katıldığı veya burada fosforile olduğu bilinen adaylar immunoblote edildi.

Gerilim, Paxillin'in adezyon komplekslerine katılımını etkilememiş olsa da, tirozin 31 üzerindeki fosforilasyonu hem toplam hücre lizatında hem de adezyon kompleksi fraksiyonunda mekanik gerilime yanıt olarak artmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, manyetik boncuklar kullanarak adezyon yüzey proteinlerine gerilme kuvvetlerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde iki saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedür uygulanırken güçlü mıknatıslarla dikkatli olunması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, kinaz aktivitesinin gerilim tarafından düzenlenip düzenlenmediği gibi ek soruları yanıtlamak için western blotlar, aktin polimerizasyon testi veya enzimatik test gibi biyokimyasal çalışmalar gerçekleştirilebilir. Bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların hücrelerdeki manyetik duyarlı sinyal yolaklarını keşfetmelerine yardımcı olabilir.