Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Bu biyokimyasal protokolün genel amacı, her iki kardeş histon üzerindeki translasyon sonrası modifikasyon reaksiyonlarının eş zamanlı olarak haritalanmasında kullanılmak üzere, farklı izotoplarla işaretlenmiş kardeş histonlara sahip nükleozomlar üretmektir. Bu biyokimyasal protokolün genel amacı, her iki kardeş histon üzerindeki translasyon sonrası modifikasyonların eş zamanlı olarak haritalanmasında kullanılmak üzere, farklı izotoplarla işaretlenmiş kardeş histonlara sahip nükleozomlar üretmektir.

Kütle spektrometrisi gibi post-translasyonel modifikasyonları haritalamak için kullanılan yüksek çözünürlüklü tekniklerle kombinlenen bu yöntem, simetrik olarak modifiye edilmiş nükleozomların oluşumuna hangi mekanizmaların katkıda bulunduğu gibi kromatin biyolojisindeki temel sorulara yanıt vermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, standart nükleozom yeniden kurulum protokollerini yaygın protein saflaştırma metodolojileriyle birleştirmesi sayesinde bir biyokimya laboratuvarında kolayca uygulanabilmesidir. Oktamer yeniden kurulumu için iki histon H3 havuzu kullanılacaktır.

Amino terminusinde polihistidin etiketi bulunan Azot 15 işaretli H3 ve amino terminusinde streptavidin afinite etiketi bulunan Karbon 13 işaretli H3. Bu prosedüre, iki tip histon H3 dahil olmak üzere liyofilize histon alikotlarını açılma tamponu içinde çözerek başlayın. Yaklaşık beş miligram histon içeren her tüpe bir mililitre açılma tamponu ekleyin ve pipetleme yaparak karıştırın, ancak vortekslemeden kaçının.

Tam açılmayı sağlamak için tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Ardından, her bir histonun kesin konsantrasyonunu belirlemek için 280 nanometrede absorbansı ölçün. İki histon H3 havuzunun her birinden %50 oranında eklediğinizden emin olarak, çekirdek histonlarını eşit molar oranlarda karıştırın.

Nihai protein konsantrasyonunu yaklaşık mililitre başına bir miligrama ayarlamak için açma tamponu kullanın. Karışımı altı kilodalton kesim sınırlı bir diyaliz membranına aktarın. Ve dört santigrat derecede, bir ila iki litre soğutulmuş yeniden katlanma tamponuna karşı diyaliz yapın.

Ertesi gün, diyalize edilmiş materyali toplayın ve bir mikrosantrifüjde, maksimum hızda, dört derece santigrat sıcaklıkta beş dakika santrifüj ederek çökelekleri uzaklaştırın. Oktamer konsantrasyonunu belirledikten sonra, oktameri yaklaşık iki mililitrelik bir son hacme yoğunlaştırmak için 10 kilodalton kesim limitli santrifüj filtre ünitesi kullanın. 50 ile 100 mikromolar arasında bir oktamer konsantrasyonu elde edilmelidir.

Gel filtrasyon kolonunu bir FPLC sistemine bağlayarak gel filtrasyonu için hazırlık yapın. 0,22 µm filtrelenmiş ve gazı alınmış refolding tamponu ile iki kolon hacmi (CV) kadar dengeleme yapın. Konsantre materyali dakikada 1 mL akış hızında enjekte edin ve 1 ila 1,5 mL'lik fraksiyonlar toplayın.

Bu prosedüre başlamak için, saf oktamerler içeren ilgili fraksiyonları birleştirin ve konsantrasyonu daha önce açıklandığı şekilde belirleyin. FPLC sistemine bir mililitrelik nikel nitrilotriasetik asit veya nikel NTA kolonu bağlayın. Ardından, dakikada bir mililitre akış hızında, 0,22 mikrometre süzülmüş ve gazı alınmış refolding tamponu ile 10 CV boyunca dengeleyin.

Saflaştırılmış oktameri, dakikada bir mililitre akış hızıyla nikel NTA'dan geçirin. Akıştaki materyali toplayın. Dakikada bir mililitre akış hızıyla, 250 milimolar imidazol içeren 10 CV yeniden katlanma tamponu ile elüsyon yapın.

Nikel NTA elüsyonunu toplayın. Streptavidine dayalı saflaştırma işlemi ideal olarak soğuk odada gerçekleştirilmelidir. Parti yerçekimi akış düzeneği kullanarak, ticari bir streptavidinle hazırlanan bir mililitrelik afinite kolonunu 250 milimolar imidazol içeren 10 CV refolding tamponu ile dengeleyin.

Nikel NTA elüsyonunu streptavidin afinite kolonundan geçirin. Akış sıvısını toplayın. 2,5 millimolar desthiobiotin içeren 10 CV refolding tamponu ile elüe edin.

Elüsyonu toplayın. Elüsyondaki oktamer konsantrasyonunu ölçtükten sonra, 10 kat daha az miktarda TEV proteaz ekleyin ve reaksiyonun dört santigrat derecede gece boyunca sürmesine izin verin. Ertesi gün, karışımı 50 kilodalton kesimli bir diyaliz membranına aktarın ve refolding tamponuna karşı dört santigrat derecede gece boyunca diyaliz edin.

Saflaştırılmış asimetrik oktameri, 10 kilodalton kesim noktalı bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak bir ila iki mililitre hacme kadar konsantre edin. Beklenen oktamer konsantrasyonu 20 ila 50 mikromolar düzeyindedir. Nükleozom yeniden oluşumu, nükleozom konumlandırma dizisi içeren DNA gerektirir.

DNA tuz konsantrasyonunu, beş molar sodyum klorür stok çözeltisi kullanarak iki molar sodyum klorür olacak şekilde ayarlayın. DNA'yı, küçük ölçekli bir testle belirlenen optimum oktamer-DNA oranıyla oktamer ve yeniden katlanma tamponu ile karıştırın. Oktamerin ve DNA'nın iki molardan daha düşük bir tuz konsantrasyonunda karışma olasılığını önlemek için oktameri en son ekleyin.

Karışımı altı kilodalton kesim sınırına sahip bir diyaliz membranına aktarın ve dört santigrat derecede gece boyunca bir litre refolding tamponuna karşı diyalize edin. Ertesi gün, diyaliz tamponundaki tuz konsantrasyonunu kademeli olarak düşürün. Örneği her bir sodyum klorür tamponunda en az üç saat boyunca bekletin.

Ardından, diyaliz membranını bir litre analiz tamponu içeren bir behere aktarın ve diyalize dört santigrat derecede gece boyunca devam edin. Ertesi gün,le diyaliz edilmiş örneği toplayın. Mikrofüj kullanarak maksimum hızda, dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ederek oluşan çökelekleri uzaklaştırın.

Numuneyi, 30 kilodalton kesim sınırına sahip bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak yaklaşık 300 microliters son hacme kadar konsantre edin. DNA konsantrasyonunu 260 nanometers dalga boyunda ölçün. Son konsantrasyon 10 ile 20 micromolar aralığında olmalıdır.

Örneği dört derece Celsius'te birkaç haftaya kadar saklayın. Yeniden katlanmış histon karışımının jel filtrasyon elüsyon profili, histon oktamerlerinin yaklaşık 70 mililitrede elüe olduğunu göstermektedir. Bir SDS page jeli, doğru histon stokiyometrisini göstermektedir.

Üç oktamer türünü içeren yeniden konstitüe edilmiş oktamerik havuz, ardışık bir afinite saflaştırma şemasına tabi tutulur. Asimetrik türlerin izolasyonu, afinite etiketinin varlığıyla doğrulanır. Afinite etiketleri daha sonra TEV proteaz ile uzaklaştırılır.

DNA'nın oktamere karşı farklı molar oranlarının kullanıldığı küçük ölçekli bir nükleozom rekonstitüsyonu, bire bir oranının optimal olduğunu göstermiştir. Optimize edilmiş DNA/oktamer molar oranı kullanılarak büyük ölçekli bir nükleozom rekonstitüsyonu gerçekleştirilmiş ve dört çekirdek histonun doğru stokiyometrisi gözlemlenmiştir. Farklı izotoplarla işaretlenmiş nükleozomların NMR spektroskopisi, azot 15 işaretli ve karbon 13 işaretli kardeş H3 histonlarının varlığını doğrulamıştır.

Bu uygulama örneğinde, farklı izotoplarla işaretlenmiş ve histon H3'ün 10. karbonil halkasında asimetrik olarak fosforile edilmiş nükleozomlar, GCN5 asetiltransferaz ile reaksiyona sokulmuştur. Her iki H3 kopyasındaki histon H3 lizin 14 asetilasyonu, NMR spektroskopisi ile gerçek zamanlı olarak takip edilmiştir. Analiz, histon H3'ün 10. karbonil halkasındaki fosforilasyonun, GCN5 tarafından gerçekleştirilen histon H3 lizin 14 asetilasyonunu cis konumda, trans konuma kıyasla daha fazla stimüle ettiğini ortaya koymuştur.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde beş günde tamamlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı özelliklere sahip kardeş histonlar içeren nükleozomların nasıl yeniden konfigüre edileceğine dair iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.