Name: Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Keşfedin, kolorektal kanserli farelerde dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonu için mikrocerrahi enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, metastatik tümör biyolojisi ve kanser evrelemesi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (We 3548 / 4-1) ve Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14) tarafından desteklenmiştir.

Burada sunulan hayvan deneyleri bağımsız olarak gözden geçirildi ve bir kurumsal ve resmi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından izin verildi ve FELASA ( Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu ) kurallarına göre gerçekleştirildi. Anestezi ve analjezi ya da gerekirse erken ötanazi dahil olmak üzere acıyı en aza indirmek için olası tüm önlemler alındı. 1. Hücrelerin ve Organoidlerin Hazırlanması NOT: Her bir enjeksiyon için 100.000 hücre ile 20 μL&#39;lik bir hacim kullanın. Sızıntıyı önlemek ve standart enjeksiyon yapılmasını sağlamak için bazal membran matrisini (BMM) kullanın. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için düzenli aralıklarla hücre hattı kimlik doğrulama analizlerini yapın ( örneğin STR profillemesi yoluyla ). <ol><li> Taze dokulardan primer hücre süspansiyonlarının hazırlanması NOT: Steril koşullar altında daima çalışın. Yeni derhal transferHücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için ameliyathaneden buz üzerinde laboratuara rezeke edilen doku gereklidir. Hastanın refahı ve optimal tedavisi her zaman öncelik olmalıdır. Bu nedenle, araştırma için doku numuneleri, sonraki patolojik inceleme ve rezeke edilen tümörün evrelemesine müdahale etmeyecek bir şekilde elde edilmelidir. Çoğu durumda, patolojik tanıya müdahale edilmemesi için, eğitimli bir patolog tarafından elde edilen araştırma numunelerinin olması mantıklıdır. <ol><li> Rezeke edilen örneğin (ideal olarak ~ 1 cm 3 ) steril çıkarılmasından hemen sonra, doku örneğini, önceden 20-30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 50 mL tüp içine yerleştirin. Tüpü buz üzerinde saklayın ve derhal laboratuara nakledin. </li><li> Doku bir Petri kabına koyun ve kalan kanları çıkarmak için iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Dokuyu küçük parçalar halinde (~ 2-4 mm) bir sca ile kesinLpel ( örneğin # 20 veya # 36 bıçakla). </li><li> Tümör dokusunu tek hücreli bir süspansiyona daha da ayırmak için ayrıştırıcıyı üreticinin talimatlarına göre kullanın. Alternatif olarak, enzimatik tümör sindiriminin diğer protokollerini kullanın. </li><li> Elde edilen tek hücreli süspansiyonun hücrelerini sayın ( örn. , Bir coulter sayacı veya bir hemocytometer). </li><li> Santrifüj (1,500 xg&#39;de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda BMM&#39;deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için hücre hatlarının hazırlanması <ol><li> Standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) tüm kolorektal kanser hücre çizgilerini büyütün ve ameliyat gününde hazırlayın. </li><li> Hücreleri standart hücre kültürü protokollerine göre hasat edin, hücreleri sayın ( örn . Bir coulter sayacı veya hemocytometer&#39;de) ve gerekliliğini hesaplayınEnjekte edilecek hayvan sayısına bağlı olarak tüm enjeksiyonların miktarı. </li><li> Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3-5x&#39;i hazırlayın. </li><li> Santrifüj (1,500 g&#39;da 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda BMM&#39;deki hücreleri tekrar süspanse edin ve buz üzerinde saklayın. </li></ol></li><li> Organoit preparasyonu NOT: Tüm 3D organoid kültürler, standart kültür koşullarında (37 ° C,% 5 CO 2 ) yetiştirilir. Organoid kültürü için ayrıntılı protokoller daha önce yayınlanmıştır. 18 , 19 , 20 Konvansiyonel hücre hatlarına benzer şekilde, enjeksiyon başına 100.000 hücre ile 20 uL BMM hacmi önermekteyiz. Organoidler ameliyat gününde aşağıdaki şekilde hazırlanır: <ol><li> Aşağıdaki ortamı hazırlayın (aşağıda belirtilenlerGelişmiş DMEM / F12 +% 1 HEPES (1M) +% 1 Glutamin (200 mM) +% 1 Penisilin / Streptomisin. </li><li> 15 mL tüpleri 1 mL DMEM / F12 +++ ile önceden doldurun. </li><li> Kültür plakasının yüzeyinden organoidleri dikkatlice aspire edin ve 3 ila 5 kuyu içeriğini bir 15 mL tüp içine aktarın. </li><li> Organoidleri, genişletilmiş bir cam pipetle aşağı yukarı pipetleyerek dikkatli bir şekilde daha küçük parçalara ayırın. </li><li> Tüp 5 mL DMEM / F12 + + + ekleyin, bunu takiben 5 dakika 1000 xg&#39;de santrifüj uygulanır. </li><li> Santrifüjden sonra süpernatantı alın, pelleti 600 μL enzimatik ayrışma tamponu içinde tekrar süspansiyon haline getirin ve süspansiyonu bir 6 oyuklu plakalardan birine iyi bir şekilde aktarın. </li><li> 1-5 dakika 37 ° C&#39;de inkübe edin ve daha sonra organoidleri çözmek için süspansiyonu yukarı ve aşağı pipetleyin. NOT: Mikroskop ile sindirimi doğrulayın; Tüm hücre kümeleri ayrıştığında tamamlanırD tek hücrelere. </li><li> Sindirim işlemini başarıyla tamamladıktan sonra sindirimi durdurmak için 1.4 mL DMEM / F12 +++ ekleyin. Daha sonra sindirilmiş organoidlerin tüm kuyularını 50 mL&#39;lik bir tüpe aktarın. </li><li> Hücreleri sayın ve tüm enjeksiyonlar için gerekli miktarı hesaplayın. </li><li> Pipetleme kayıplarını ve enjektör şırıngasının ölü hacmini hesaplamak için gerçekten gerekli hacmin 3 - 5 katı kadarını hazırlayın </li><li> Santrifüj (1,500 xg&#39;de 5 dakika) ve hücre süspansiyonunu PBS ile iki kez yıkayın. </li><li> BMM&#39;deki hücreleri 5 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyona kadar yeniden askıya alıp buzda tutun. </li></ol></li></ol> 2. Ortotopik Fare Modeli <ol><li> Ameliyat için alıcı hayvanların hazırlanması NOT: Alıcılar olarak 6-8 haftalık NOD.Cg-Prkdc scid IL2rg tm1Wjl / SzJ (NOD scid gama, NSG) farelerini kullanın. 21 NSG, olgun B, T ve NK hücrelerinden yoksun en bağışıklığı baskılanmış fareler arasındadır, bunun yanında çoklu bağışıklık sistemi de fazladırtama yaptığı. 21 Onlar güvenilir düşük hücre sayıları enjekte bile tümörleri büyümeye ve uzak metastaz son derece yatkındır. NSG fareleri mükemmel yetiştiricilerdir ve geleneksel spesifik patojen içermeyen (SPF) birimler içerisinde tutulabilirler. <ol><li> İlk insizyon öncesinde subkutan olarak 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin. </li><li> Genel anestezi için sevofluran&#39;ı% 3-3.5 hacimde kullanın. Parmak çakma refleksi kaybı, yeterli anestezi anlamına gelir. </li><li> Korneanın kurutulmasını önlemek için anestezi uygulanmış farelerin gözlerini oftalmik merhemle örtün. </li><li> Fareleri küçük bir masanın üzerinde yatay bir konumda tutun. </li><li> Karını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin (alternatif olarak kaşıntı kremi kullanılabilir) ve en az 3 kez klorheksidin / iyot ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. </li><li> Cerrahi alanı steril perdeler ile örtün. NOT: Perioperatif antibiyotik kullanımı isteğe bağlıdır ve kurumsal yönergelere tabidir. </li></ol></li><li> Orta hat laparotomisi ve çekumun maruziyeti <ol><li> Alt karın cildinde küçük bir orta hat kesisi (3-5 mm) yapmak için makas kullanın (alternatif olarak kepek kullanılabilir). Forseplerle karın duvar kaslarını kaldırın ve makasla dikkatli bir şekilde kesip karın boşluğunu açın. </li><li> Atrofik forseps ile çekumun belirlenmesi ve dikkatli bir şekilde dışa vurulması. Kornere işaret eden karnın üzerindeki çekumun körü kesecek keseğini kafa yuvasına yerleştirin. </li><li> Dışa aydınlatıldıktan sonra, çekmeceyi sıcak salin svapları kullanarak nemli tutun. </li></ol></li><li> Ortotopik enjeksiyon, karın kapanması ve postoperatif iyileşme <ol><li> İntracekal enjeksiyon için, 30 G kanül içeren standart bir 1 mL şırınga kullanın. Bu şırıngayı, bir mikromanipülatöre monte edilen bir mikroenjeksiyon pompasına monte edin. </li><li> Çekumatik forseps ile çekumun ucunu dikkatlice tutun ve aşağı doğru vurarak hafifçe pürüzsüz hale getirinD ikinci kez forseps ile sıcak salinle nemlendirildi. </li><li> Kanül doğrudan çekumun üzerine yerleştirin. </li><li> Görsel kontrol altında binoküler bir cerrahi mikroskop ile aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Çekumun dışarı çekilmiş kısmının her iki ucuna iki atravmatik forseps kullanarak çekumun dikkatli bir şekilde kavranmasını hafifçe gerin ve ardından paralel ve doğrudan yukarıda bulunan kanül üzerine yavaşça çekin. Sızıntıya ve peritoneal yayılıma yol açacağı için tüm bağırsak duvarını perfore etmek (böylece lümen içine hücreleri enjekte etmek) değil, serozayı başlangıçtaki penetrasyonun ötesine perfore etmek için de önemlidir. <ol><li> Bağırsağı kanüle doğru, bağırsağa doğru götürünüz. Bağırsağı iki forseps arasında tutun ve gerin. Sarsıntıyı azaltmak için cerrahın elleri bir yüzey üzerine oturmalıdır. </li></ol></li><li> Hücreleri seroza enjekte edin (çok ince, şeffaf astar olarak görülüyor.E intramural kan damarları) ve muskularis. Bu nedenle kanül, kan damarlarının üstünde ve yarı saydam zarın altında görsel olarak yerleştirilmelidir. </li><li> Kanül bağırsak duvarı içerisindeyken titreme azaltmak için enjeksiyona başlamak için bir ayak anahtarı kullanın. </li><li> Kanül yerleştirildikten sonra enjeksiyona başlayın. Pompanın kontrol ünitesinde 1 μL / s ayarla sonuçlanan 20 saniye süreyle kullanın. NOT: Hasarlı bir kan damarına veya yakınına yapılan enjeksiyon doğrudan intravasküler yayılım ve uzak metastaz yol açar ve bu nedenle kaçınılmalıdır. </li><li> Enjeksiyonun tamamlanmasından sonra, kanülü geriye doğru çekerek dikkatlice çıkarın. </li><li> Sızdırılmış hücreleri kirletmek ve böylece suni peritoneal yayılımı önlemek için çekumun altına kuru bir çubuk yerleştirin ve ardından çekumun damıtılmış suyla iyice durulayın. </li></ol></li><li> Karın kapanması ve postoperatif iyileşme <ol><li> R sonraİçeri çekerken, çekumu hafifçe karın boşluğuna geri verin. </li><li> Karın duvarını 6-0 hızlı emilebilen koşu sütürleri ile kapatın. </li><li> Cerrahi yara klipsleri ile cildi kapatın. </li><li> Fareyi, anesteziden tamamen kuruyana kadar 38 ° C&#39;ye ayarlanmış ısıtma haritasına yerleştirin. </li><li> Farelerin postoperatif koşullarını 48 saat boyunca yakından izleyin. Sıkıntı yaşarsanız, 12 saatte bir 0.05 mg / kg buprenorfin ile tedavi edin. </li><li> Fareler, tümör gelişimine bağlı olarak sıkıntı işaretleri için günde en az bir kez izleyin. </li></ol></li></ol> 3. Tüm Kan Örneklerinden Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu NOT: Anestezi uygulanmış farelerde transkutanöz kardiyak ponksiyon ile kan alın ve bunu ötanazi izlemelisin. İdeal olarak, 100 μL antikoagülan (Etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) veya heparin) ile önceden doldurulmuş bir şırınga içine 1.000 μL kan çekilir. Bir anti-insan-EpCAM (epitel hücre adezyonuMolekül) antikorunu belirtir. Fare modelinde insan epitelyal hücre hatları kullanılıyorsa, bu çok iyi çalışır. Diğer aletler için farklı antikorlar gerekebilir. <ol><li> CTC zenginleştirmesi: <ol><li> 15 mL&#39;lik tüpleri 5 mL yoğunluk dereceli ortam ile önceden doldurun ve dikkatli bir şekilde 15 mL tüp içine kan aktarın. </li><li> Santrifüjleyin (frensiz 300 xg&#39;de 30 dakika) ve dikkatli bir şekilde üst üst fazı çıkarın. </li><li> Geri kalanını yeni bir 15 mL tüp içine boşaltın ve santrifüjleyin (15 dakika, frenli 300 xg). </li><li> Mononükleer hücreleri içeren ara fazı kurtarın (gerisini atın) ve hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. </li><li> Pelet 200 uL PBS /% 1 EDTA içinde süspansiyon haline getirin ve 4 μL EpCAM antikoru ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Eleme ve toplama <ol><li> Aşağıdaki tamponu hazırlayın (aşağıda toplama tamponu olarak anılır): PBS +% 10 fetal buzağı serumu (FCS) +% 1 penisilin / STreptomisin (% 1) +% 0.8 EDTA. </li><li> 6 cm&#39;lik steril bir Petri kabında (akışkanın çanakta dağılmasını önleyen) ~ 1 cm&#39;lik bir daire çizmek için bir PAP kalemi kullanın ve bu daire içine tampon toplamanın pipet 700 μL&#39;ini kullanın. </li><li> Daire içerisinde 700 mcL toplama tamponuna 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroskop ile hücrelerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa, numuneyi farklı yemeklere bölün. </li><li> Hücrelerin çökelmesini bekleyin (~ 5 dak). </li><li> Lekeli (= EpCAM-pozitif) hücreler için hücre süspansiyonunun damlasını tarayın. </li><li> Bir hücre bulundu sonra, mikromanipülatör ile hücreyi seçin ve amaçlanan aşağı akım analizine ( örn. , RNA ekstraksiyon tamponu veya kültür ortamı) bağlı olarak 50 μL tampona koyun. </li><li> İstenen aşağı akım analizlerine bağlı olarak, EpCAM negatif hücreleri ve / veya ortamı negatif kontroller olarak izole edin. </li><li> Aşağı akım analizleri ile devam edin ( örn. , Hücre kültürü, PCR). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26742998">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639298">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.smartscitech.com/index.php/CCM/article/view/323">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li>
<li>Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer%3A+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li>
<li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priceless+GEMMs%3A+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+combined+with+TLR7%2F8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li>
<li>Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li>
<li>Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mouse-models-of-colorectal-cancerderived-circulating-tumor-cells-2161-0444-1000389.pdf">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li>
<li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma%28c%29%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL%2F6J+and+C57BL%2F6N+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82(2013).</li>
<li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL%2F6J+Mice%3A+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit+Basic+Res%22%5BJournal%5D)">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484(2007).</li>
<li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+PI3K%2FMEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type%2C+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li>
<li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+BRAF+and+PI3K%2FmTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF%28V600E%29+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li>
<li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Deri altındaki fare modellerinde klinik olarak kanıtlanmış etkinliklerine rağmen yeni bileşiklerin büyük çoğunluğu klinik araştırmalarda başarısız olur ve kliniğe asla ulaşmazlar. 11, deri altı fare modellerinde bu bariz yetmezliği doğru tümörlerin biyoloji ve büyüme kalıpları doğrudan orijinal organ, tümör hücrelerinin enjeksiyonundan göre ortotopik fare modellerinin geliştirilmesine yol açmıştır simüle edilmiştir. Ortotopik fare modelleri, solid tümörlerin biyolojis...

Kolorektal kanser (CRC), batı ülkelerinde kanser ölümünün en yaygın nedenlerinden biridir. Primer tümör genellikle rezeke edilebilir olsa 1, uzak metastaz oluşumu önemli ölçüde ölüme götürecek sıklıkla prognozu kötüleştirir ve. 2 , 3 Metastazın biyolojik korelasyonu, tümörden ayrılan dolaşımdaki tümör hücreleridir (CTC&#39;ler), dolaşımda hayatta kalır, hedef organdaki epitele bağlanır, organı istila eder ve nihayetinde yeni lezyonlara doğru büyür. Dolaşımda bulunan tümör hücreleri prognostik alaka, 5, 6, 7, 8, olduğu bilinmektedir, ancak 4, 9 biyoloji kısmen CRC bunların çok nadir bir sonucu olarak anlaşılmaktadır. 10 Fare modelleri güçlü bir tOol kanser biyolojisinin çeşitli yönlerini incelemek. Klasik, subkütan tümör modelleri, alıcı camlara tümör hücrelerinin subkütan enjeksiyonuyla üretilir; bu, bağışıklık kazandıran (eş merkezli tümör hücreleri kullanılıyorsa) veya immün yetmezlik gösterebilir. Subkütan tümör modelleri ucuzdur ve verileri hızlı bir şekilde üretir; Uç nokta tümör büyümesi kolaylıkla ve invaziv olarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu tür modellerde antitümör aktivite sergileyen yeni bileşiklerin% 88&#39;i klinik araştırmalarda başarısız olur. 11 Bu kısmen insanlarla fare arasındaki farklılıklar nedeniyle; Bununla birlikte, bu başarısızlığın büyük bir kısmı subkutan fare modellerinin düşük prediktif değerinden kaynaklanmaktadır. Tümör hücrelerinin orijin organına enjekte edildiği ve böylece orijinal mikro ortamda büyüdüğü ortotopik fare modelleri, kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılır. 11 , 12 , </sUp&gt; 13 , 14 Ortotopik modeller sadece lokal tümör büyüme koşullarını simüle etmekle kalmaz; Ortotopik fare modelleri, tümör büyümesinin anatomik olarak doğru bir yerinin bir sonucu olarak, metastazın gerçekçi simülasyonunu sağlar ve bu nedenle CRC&#39;deki farklı tedavilere 8 , 15 , 16 veya CTC biyolojisini incelemek için kullanılır. 13 , 17 Ortotopik fare modellerinin en büyük dezavantajı, teknik karmaşıklığıdır. Hücrelerin enjekte edileceği organa bağlı olarak, deneyci, tekrarlanabilir tümörleri indükleyene kadar öğrenme eğrisinin oldukça uzundur. Bu, özellikle tümör hücrelerinin bağırsak duvarına enjekte edilmesi gerektiği için kolorektal kanser modelleri için geçerlidir, bu genellikle perforasyon, tümör hücresi sızıntısı veya endoluminal tümör hücre kaybına neden olur. Bu birBu makale, birincil doku numunelerinden, 2D hücre çizgilerinden ve 3D organoid kültüründen hücre hazırlama yöntemini ve bunların farelerin çekumuna enjekte edilmesini amaçlamaktadır. Burada tarif edilen teknik, enjeksiyon için kullanılan hücre hattının tümör biyolojisine bağlı olarak, alıcı farelerde uzak metastazların ve CTC&#39;lerin tekrarlanabilir formasyonuna yol açarak, oldukça tekdüze tümörlere yol açar. 15

<table><tbody><tr><td><güçlü>Hücre kültürü Ortamı ve Bileşenleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM F12</td><td>Canlandırıcı</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ orta</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ orta</td></tr><tr><td>Glutamax-I Takviyesi (200 mM)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++ orta</td></tr><tr><td>Penisil/ Streptomisin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ orta</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>2D hücre hatlarının temel ortamı (DMEM/%10 FCS)</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>2D hücre hatlarının temel ortamı (DMEM/%10 FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express enzimatik ayrışma tamponu</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel bazal membran matrisi (BMM, fenol kırmızısı içermez)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Hali</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,25, Fenol-Kırmızı)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>6/48 kuyulu kapaklı plakalar</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>hücre kültürü şişesi 75 cm&sup2;, 250 mL</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>hücre kültürü şişesi 150 cm&sup2;, 600 mL</td><td>Corning B.V. Yaşam Bilimleri</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri 1,5 mL / 2 mL</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 mL, 50 mL santrifüj tüpleri</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 Sayma Slaytları (TC20 Sayma Makinesi için)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri (cam, 150 mm)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>bir bunsen brülörü kullanılarak ince bir şekilde çekilir</td></tr><tr><td>GentleMACS Ayrıştırıcı</td><td>Miltenyi Primer</td> tümör dokusu hazırlığı için Biotec <td>130-093-235</td><td>Primer tümör dokusu hazırlığı için</td></tr><tr><td>MACSmix Tüp Döndürücü</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>gentMACS C Tüpleri</td><td>Primer tümör dokusu hazırlığı için</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td></tr><tr><td>Primer tümör dokusu hazırlığı</td><td></td><td></td><td></td> için İnsan Tümörü Dissosiyasyon Kiti Miltenyi Biotec 130-095-929</tr><tr><td>Falcon 70 ve mikro; </td><td>primer tümör dokusu hazırlığı için</td> m Hücre Süzgeci <td>Corning BV Yaşam Bilimleri</td><td>352350</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar< / strong</td></tr><tr><td>>Cerrahi Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co.</td> <td>KG-Medical</td><td></td></tr> <tr><td>oxygen</td><td>Air Liquide Medical</td><td></td> GmbH-Buprenorfin <td></td></tr><tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- oftalmik merhem</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>Normal salin% 0.9 (E154)</td> <td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Şırınga (ölü hacim olmadan) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>30G enjeksiyon iğnesi</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>selüloz çubuklar</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forseps</td><td>FST - Güzel Bilim Araçları</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas - ToughCut</td><td>FST - Güzel Bilim Araçları</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Olsen-Hegar İğne Tutucu</td><td>FST - Güzel Bilim Araçları</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kiti</td><td>FST - Güzel Bilim Araçları</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (cerrahi sütür)</td><td>Johnson & Johnson Medical GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>Masa Üstü Araştırma Anestezi Makinesi, O2 Yıkama ve Sevofluran Buharlaştırıcı ile</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>Micro4 Denetleyicili UltraMicro Pompa</td><td>World Precision Instruments</td><td>Yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için</td><td>UMP3-4</td> ekipmanı</tr><tr><td>SYS-Micro4 Kontrol Cihazı için Ayak Pedalı</td> World <td>Precision Instruments</td><td>15867</td><td>Yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman</td></tr><tr><td>Üç eksenli Manuel Mikromanipülatör</td><td>World Precision Instruments</td><td>M325</td><td>yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör için Manyetik Stand</td><td>World Precision Instruments</td><td>Yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için</td><td>M10 ekipmanı M10</td></tr><tr><td>Manyetik Stand için Çelik Taban Plakası</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>5479</td><td>yüksek kontrollü ortotopik enjeksiyon için ekipman</td></tr><tr><td>Sıcak Plaka 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - Saç tıraş makinesi</td><td>AESCULAP - Braun-Binoküler</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cerrahi Mikroskop</td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CTC izolasyonu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>Yoğunluk gradyanı orta &ndash; Ficoll</td><td>Kök Hücre - Lenforep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-insan CD326 (EpCAM) Antikor klonu 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-fare CD326 (EpCAM) Antikor klonu G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı, &oslash; 60 x 15 mm, 21 cm&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Floresan Hücre Kültürü Mikroskobu</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Mikromanipülatör</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>aspirasyon pompası mikromanipülatöre bağlı</td></tr><tr><td>Dmz Üniversal Mikroelektrot Çektirme</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>tek hücreli aspirasyon için mikro kılcal damarların üretimi için gerekli</td></tr><tr><td>Prizma Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td>toplama tamponu</td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>toplama tamponu</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>toplama tamponu</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>toplama</td></tr> <tr><td>tamponuName</td><td>Company</td><td>Katalog Numarası</td><td>Comments</td></tr><tr><td>İmmünohistokimya</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış anti-insan CD326 (EpCAM) antikor klonu 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM immünohistokimyası (bkz., şekil 2C)</td></tr><tr><td>HRP tavşan anti-fare IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM immünohistokimyası (cf, şekil 2C)</td></tr></tbody></table>

kolorektal kanserli bir ortotopik fare modelinde dolaşan tümör hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Kolay uygulanabilirlik ve maliyet etkinliğinin avantajlarına rağmen, subkutan fare modelleri ciddi sınırlamalara sahiptir ve tümör biyolojisi ve tümör hücresi yayılımını doğru bir şekilde simüle etmemektedir. Ortotopik fare modelleri bu sınırlamaların üstesinden gelmek için sunulmuştur; Bununla birlikte, bu tür modeller teknik olarak özellikle büyük bağırsak gibi içi boş organlarda talep ederler. Güvenilir bir şekilde büyüyen ve metastaz yapan tek tip tümörler üretmek için, standartlaştırılmış tümör hücresi hazırlama teknikleri ve enjeksiyon önemlidir. Oldukça üniform bir tümör geliştiren ve tümör biyolojisi çalışmaları ve terapötik denemeler için kullanılabilen bir ortotopik fare modelinde kolorektal kanser (CRC) geliştirdik. Primer tümörler, 2 boyutlu (2D) hücre dizileri veya 3 boyutlu (3D) organoidlerden gelen tümör hücreleri çekum içine enjekte edilir ve enjekte edilen tümör hücrelerinin metastatik potansiyeline bağlı olarak oldukça metastatik tümörler oluşturur. Ek olarak,CTC&#39;ler düzenli olarak bulunabilir. Burada, 2D hücre çizgilerinin ve 3D organoidlerin yanı sıra primer tümör dokusundan, cerrahi ve enjeksiyon tekniklerinin yanı sıra tümörlü farelerden CTC&#39;lerin izolasyonu ve mevcut sorun giderme ipuçlarından tümör hücresi hazırlama tekniğini açıklıyoruz.

Bu modelde başarılı ve tekrarlanabilir nesil kolorektal tümörlerin oluşması, hücrelerin dökülmeden veya sızıntı olmadan doğru şekilde enjekte edilmesine bağlıdır. Bu elde edilirse, bu model son derece güvenilirdir ve nadiren yapay periton yayılımı ile sonuçlanır. Tümörlerin büyüme kinetiği ve yayılma şekilleri, kullanılan organoidlerin ve hücrelerin biyolojisine bağlıdır. HCT116 hücreleri güvenilir, bu modelde, karaciğere metastaz 15 birlikte, SW620 hücre formu or...

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC&#39;lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Bu mikrocerrahi tekniğinin genel amacı, farelerde tekrarlanabilir ve metastatik kolorektal tümörler oluşturmak için kolorektal tümör hücrelerini sekum duvarına enjekte etmektir. Bu yöntem, dolaşımdaki tümör hücreleri biyolojisi alanındaki temel sorulara yanıt verebilir; temel avantajları ise güvenilir evre tahmini ve dolaşımdaki tümör hücresi öngörüsüne olanak tanıyan, yüksek derecede tekrarlanabilir ve tek tip tümörler sağlamasıdır. İşleme, altı ila sekiz haftalık immün yetmezliği olan bir farenin sekumunu atraumatik forseps kullanarak dikkatlice dışarı çıkararak başlayın.Sekumun kör ucunu, kese kranyal yöne bakacak şekilde abdomen üzerine yerleştirin. Sekum içi enjeksiyon için, 30 gauge kanül takılmış standart bir mililitrelik şırıngayı tümör hücreleri ile doldurup mikromanipülatöre monte edilmiş bir mikro enjeksiyon pompasına yerleştirin. Ardından, sekumun ucunu dikkatlice kavramak için atraumatik pensi kullanın ve sıcak salin ile nemlendirilmiş ikinci bir pens yardımıyla sekumu aşağı doğru vuruşlarla nazikçe düzeltin.Şimdi hayvanı binoküler cerrahi mikroskobun altına yerleştirin ve kanül sekum ile doğrudan paralel ve üzerinde olacak şekilde konumlandırılmışken, iki adet atraumatik forseps kullanarak sekumun dışarı çıkarılan ucunun her iki ucundaki dokuyu dikkatlice gerin. Tüm duvar kuşağını veya başlangıç penetrasyon noktasının ötesindeki serozayı perfore etmemeye dikkat ederek sekumu yavaşça kanülün üzerine çekin ve kanülü kan damarlarının üzerine, duvar kuşağının içindeki ince şeffaf membranın altına yerleştirin. Kanül yerleştiğinde, bir ayak pedalı kullanarak 20 saniyelik bir süre boyunca 20 µL hücre enjekte edin.İntramural kan damarlarının üzerinde ve muscularis ile ince şeffaf seroza astarı arasında. Tüm hücreler enjekte edildikten sonra, kanülü dikkatlice çıkarın ve sekumun altına kuru bir swap yerleştirin. Yapay peritoneal yayılımı önlemek için, sızan hücreleri distile su ile iyice durulayarak lizleyin ve sekumu nazikçe abdominal kaviteye geri yerleştirin.Karın duvarını hızlı emilen sürekli dikişlerle, cildi ise cerrahi yara klipsleriyle kapatın. Ardından fareyi, tam olarak uyanana kadar izlenmek üzere 38 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma matına yerleştirin. Dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etmek için, uygun deneysel bitiş noktasında, 15 mL'lik konik tüplerin her birini beş mL yoğunluk gradyanı ortamı ile doldurun ve tümör taşıyan hayvanlardan toplanan tam kan örneklerini dikkatlice yoğunluk gradyanı katmanlarının üzerine aktarın.Hücreleri santrifüj ile ayırın ve mononükleer hücreleri içeren ara fazı dikkatlice toplayın. Mononükleer hücreleri, ikinci bir santrifüj işlemi için yeni bir 15 mililitrelik tüpe pipetleyin. Ardından tüpleri PBS ile yıkayın.İkinci yıkamadan sonra, peletleri EDTA ile desteklenmiş 200 µL PBS içinde yeniden süspande edin ve her bir örneğe dört µL anti amp camp antikoru ekleyerek karanlıkta, buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Ardından, örnek başına bir adet steril 6 cm'lik petri kabının içine hidrofobik bariyer kalemi ile yaklaşık 1 cm çapında bir daire çizin ve her daireye 700 µL toplama tamponu, ardından 50 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin yoğunluğunu kontrol etmek için mikroskop kullanın ve örneklerin yaklaşık beş dakika boyunca çökmesine izin verin.Ardından, hücre damlasını cAMP pozitifliği açısından tarayın ve ilgilenilen hücreleri, planlanan sonraki analizler için uygun olan 15 µL tampon çözeltiye aktarmak için mikromanipülatörü kullanın. Bu modelde kolorektal hücrelerin kullanılması, tümör hücresi enjeksiyonundan sonraki 35 gün içinde farelerde güvenilir şekilde daha bol tümör oluşumuyla sonuçlanır; primer tümörler yaklaşık 10 mm boyutundadır ve karaciğer ile akciğer metastazı ve dolaşan tümör hücreleri neredeyse her zaman mevcuttur. Ayrıca, dolaşan tümör hücreleri sonraki analizler için kolayca izole edilebilir.Bu teknik uzmanlaşıldığında ve doğru şekilde uygulandığında 10 dakika içinde tamamlanabilir; böylece hem terapötik hem de moleküler çalışmalar için kullanılabilecek homojen ve metastatik tümörlerin oluşumu kolaylaşır. Modelin kısıtlamaları arasında, kendi sınırlamaları olan hücre lizine bağımlılık ve farelerin immün yetmezliği yer almakta olup, her iki durum da mutant kolorektal kanser hücreleri kullanılarak aşılabilir. Basitliği nedeniyle bu model, mevcut kolorektal kanser modellerine değerli bir ek olabilir.

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Çekum üzerine bir kanser hücre süspansiyonu çekal duvar subkutan tümörün bir parçasının veya transplantasyon içine enjeksiyon: İki teknikleri bu modeli kurmak için kullanılan olabilir. Bu model, kolorektal kanseri doğal bir ilerleme eğitim ve kolorektal kansere karşı yeni tedavi ajanları test için yararlıdır.

Kolorektal Kanser Ortotopik Fare Modeli

Bu videoda, kolorektal kanser hastadan türetilmiş ksenogreftlerin veya PDX'lerin spontan metastaz fare modelini oluşturmak için kullanılan protokol açıklanmaktadır. Bu ksenogreft modelleri, insan karsinomlarının özelliklerini kısmen taklit eder ve invazyon ve metastaz dahil olmak üzere insan malignitelerinin kritik yönlerini anlar.

Spontan Metastaz Fare Modelleri: Ortototopik Olarak Enjekte Edilen Kolorektal Kanser Hücrelerinin Metastatik Potansiyelini İncelemek İçin Bir Platform

Bu videoda, immün yetmezliği olan bir farenin dalağına GFP lentivirus ile etiketlenmiş PDX'ten türetilmiş CRC organoidleri tarafından metastaz oluşturma protokolü açıklanmaktadır. Diğer organları kolonize eden kanser mikrometastazları, GFP ekspresyonunu değerlendirmek için bir floresan mikroskobu kullanılarak tespit edilebilir.

Deneysel Metastaz Fare Modelinin Kurulması: Mikrometastazları Tespit Etmek için PDX Modelinde GFP İfade Eden CRC Organoid Hücrelerinin İmplante Edilmesi

Videoda, yüksek derecede homojen tümörlere sahip ortotopik bir fare modeli geliştirmek için kanserli hücrelerin intracekal enjeksiyonu tekniği açıklanmaktadır. Bu nedenle, ortotopik fare modeli, metastazın gerçekçi simülasyonuna izin vererek, tümör büyümesi ve yayılması sırasındaki fenotip değişikliklerini incelemek için değerli bir araç sağlar.

İntracekal Tümör Hücresi Enjeksiyonu: Ortotopik Kolorektal Kanser Fare Modeli Oluşturmak için Kanser Hücreleri Verme Tekniği

Bu videoda, ötenazi uygulanmış bir kolorektal tümör fare modelinin tam kan örneğinden dolaşımdaki tümör hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Bu izole CTC'ler kültürlenebilir ve amaçlanan aşağı akış analizi için kullanılabilir.

Tam Kan Örneğinden CTC İzolasyonu: Murin Kolorektal Kanser Modelinden CTC Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) tümör metastazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Burada, hepatosellüler karsinom (HCC) metastazı sinjeneik fare tümörü modelinin tam kanından CTC'lerin izolasyonu ve yayılması için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kanser Modeli Tümör Hücreleri Sirkülasyon İzolasyonu ve Yayılım

Biz son derece hassas yayılmasından insan kolorektal kanseri tespiti (CRC) hücre dokuları kolonileşmesi izin vermek için burada PDX kaynaklı CRC organoid hücrelere yeşil flüoresan protein (GFP) lentiviral parçacıkların verimli iletim için bir protokol göster stereo-floresan mikroskobik gözlem ile alıcı fareler içine onların enjeksiyon önce.

Bir hasta kaynaklı kolon tümöründen kültürlü GFP Lentivirus transduced Organoids tarafından oluşturulan Micrometastases yüksek-duyarlı tespiti

Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Kolorektal kanser (KRK) organoidlerinin portal ven enjeksiyonu stroma bakımından zengin karaciğer metastazı oluşturur. CRC hepatik metastazının bu fare modeli, tümör-stroma etkileşimlerini incelemek ve adeno ilişkili virüs aracılı gen terapileri gibi yeni stroma yönelimli terapötikler geliştirmek için yararlı bir araçtır.

Karaciğer Metastazı Stromasını İncelemek için Kolorektal Kanser Organoidlerinin Portal Ven Enjeksiyonu

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Bu çalışma, bir murin modelinde ışıldayan kolorektal kanser hücrelerinin in vivo deri altı indüksiyonuna ve ardından bir görüntüleme sistemi kullanılarak lüminesans ölçümüne odaklanmaktadır. Prosedür, gerçek zamanlı izleme ve terapötik değerlendirme için tekrarlanabilir bir tümör büyüme modeli oluşturmayı amaçlamaktadır.

Antitümör Etkinliğini Değerlendirmek için Atimik Çıplak Farelerde İnsan Kolorektal Kanser Hücrelerinin Deri Altı Enjeksiyonu

Keşfedin, kolorektal kanserli farelerde dolaşan tümör hücrelerinin izolasyonu için mikrocerrahi enjeksiyon tekniğini. Bu yöntem, metastatik tümör biyolojisi ve kanser evrelemesi araştırmalarında tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet