Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Bu mikrocerrahi tekniğin genel amacı, farelerde tekrarlanabilir ve metastatik kolorektal tümörleri indüklemek için kolorektal tümör hücrelerini çekum duvarına enjekte etmektir. Bu yöntem, dolaşımdaki tümör hücresi biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlayabilir, ana avantajları, güvenilir evre tahmini ve dolaşımdaki tümör hücresi tahminine izin veren, yüksek oranda tekrarlanabilir ve tek tip tümörlerdir. Altı ila sekiz haftalık bağışıklığı baskılanmış bir farenin çekumunu dikkatlice dışlamak için atravmatik forseps kullanarak başlayın.

Çekumun kör ucunun, kese kraniyal olarak bakacak şekilde karın üzerine yerleştirilmesi. İntraçekal enjeksiyon için, 30 gauge kanella ile donatılmış standart bir mililitrelik şırıngayı monte edin ve tümör hücreleriyle birlikte bir mikro manipülatöre monte edilmiş bir mikro enjeksiyon pompasına yükleyin. Daha sonra, çekumun ucunu dikkatlice kavramak için atravmatik forseps kullanın ve çekumu aşağı doğru vuruşlarla nazikçe yumuşatmak için ılık tuzlu su ile nemlendirilmiş ikinci bir forseps kullanın.

Şimdi hayvanı bir binoküler cerrahi mikroskop altında hareket ettirin ve kanella doğrudan çekuma paralel ve üzerinde olacak şekilde, çekumun dış ucunun her iki ucundaki dokuyu dikkatlice germek için iki atravmatik forseps kullanın. Çekumu yavaşça kanellanın üzerine çekin, tüm duvar kemerini veya serozayı ilk penetrasyon noktasının ötesine delmemeye dikkat edin ve kanellayı kan damarlarının üzerine ve duvar kemerinin içindeki ince yarı saydam zarın altına yerleştirin. Kanella yerindeyken, 20 saniyelik bir süre içinde 20 mikrolitre hücre enjekte etmek için bir ayak pedalı kullanın.

İnce yarı saydam seroza astarı arasında, intramural kan damarlarının ve muskularisin üzerinde. Tüm hücreler enjekte edildiğinde, kanellayı dikkatlice çıkarın ve çekumun altına kuru bir takas yerleştirin. Yapay peritoneal yayılmayı önlemek için, sızan hücreleri iyice damıtılmış suyla durulayın ve çekumu yavaşça karın boşluğuna geri koyun.

Karın duvarını hızla emilebilir koşu dikişleriyle, cerrahi yara klipsleri ile ciltte kapatın. Ardından, fareyi 38 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısıtma matının üzerine yerleştirin ve tam yaslanana kadar izleyin. Dolaşımdaki tümör hücrelerini izole etmek için, uygun deneysel son noktada, 15 mililitrelik konik tüpleri tüp başına beş mililitre yoğunluk gradyan ortamı ile doldurun ve tümör taşıyan hayvanlardan toplanan tam kan örneklerini yoğunluk gradyan katmanlarına dikkatlice aktarın.

Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve mononükleer hücreleri içeren arayüzü dikkatlice geri kazanın. İkinci bir santrifüjleme için mononükleer hücreleri 15 mililitrelik yeni bir tüpe pipetleyin. Bunu PBS'de tüp yıkamaları takip eder.

İkinci yıkamadan sonra, peletleri EDTA ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve karanlıkta buz üzerinde 20 dakikalık inkübasyon için her numuneye dört mikrolitre anti amp kamp antikoru ekleyin. Daha sonra, numune başına altı santimetrelik steril bir petri kabında yaklaşık bir santimetrelik bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın ve her daireye 700 mikrolitre toplama tamponu ekleyin, ardından 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin yoğunluğunu kontrol etmek için bir mikroskop kullanın ve numunelerin yaklaşık beş dakika çökmesine izin verin.

Ardından, amp kampı pozitifliği için hücre damlasını tarayın ve ilgilenilen hücreleri, amaçlanan sonraki aşağı akış analizi için uygun tamponun 15 mikrolitresine aktarmak için mikromanipülatörü kullanın. Bu modelde kolorektal hücrelerin kullanılması, tümör hücresi enjeksiyonundan sonraki 35 gün içinde, yaklaşık 10 milimetre büyüklüğünde primer tümörler ve karaciğer, akciğer metastazı ve dolaşımdaki tümör hücreleri ile neredeyse her zaman mevcut olan daha fazla abund faresi ile güvenilir bir şekilde sonuçlanır. Ayrıca, dolaşımdaki tümör hücreleri, aşağı akış analizi için kolayca izole edilebilir.

Bir kez ustalaştıktan ve uygun şekilde uygulanırsa, bu teknik 10 dakika içinde gerçekleştirilebilir ve hem terapötik hem de moleküler çalışmalar için kullanılabilecek tek tip ve metastatik tümörlerin oluşumunu kolaylaştırır. Modelin sınırlamaları arasında, kendi sınırlamaları olan hücre lizine bağımlılığı ve her ikisi de mutant kolorektal kanser hücrelerinin kullanılmasıyla üstesinden gelinebilen farelerin immün yetmezliği yer almaktadır. Basitliği nedeniyle, bu model şu anda mevcut olan kolorektal kanser modellerine değerli bir ek olabilir.