İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu prosedürün genel amacı, uzun hücre kültürü komplikasyonlarından kaçınırken heterolog sistemlerde iyon kanalları ekspresyonunu kontrol etmek için uygun bir yol sağlamaktır. Böylece, deneyler arasındaki koşulları kontrol etmek ve daha tekrarlanabilir sonuçlar üretmek için bir yol sağlar. Bu yöntem, iyon kanalı alanındaki araştırmaları kolaylaştırmaya yardımcı olabilir.

Farmakolojide kanal özelliklerinin karakterize edilmesi gibi. Mevcut yöntemler ya karmaşıktır ya da tutarsız protein ekspresyonu gösterir. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten kısa bir süre içinde bireysel deneyler için uyarlanmış çok çeşitli proteinlerin kontrollü ekspresyon seviyelerine ulaşabilmemizdir.

Bu prosedüre başlamak için, TREX 293 hücrelerini, yüzde 50 birleşme oluşturmak için oyuk başına 0,9 mililitre tam DMEM ile hazırlanan 12 oyuklu bir plakaya aktarın. Ve hücreleri bir CO2 inkübatörde gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, burada gösterilen ilgilenilen gen olan DMEM, inert bir plazmit olan TRPV1 ve lipid transfeksiyon reaktifinden oluşan bir transfeksiyon karışımı hazırlayın.

Elektrofizyolojik deneyler için, başarılı bir şekilde transfeksiyon geçiren hücreleri görselleştirmek için transfeksiyon kokteyline memeli ekspresyon plazmidine EGFP'yi dahil edin. Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, transfeksiyon karışımını 12 oyuklu plakadaki kaplanmış hücrelere damla damla pipetleyerek hücreleri transfekte edin.

DNA ve transfeksiyon reaktifinin homojen dağılımını sağlamak için plakayı kuvvetlice sallayın. Daha sonra, transfekte edilmiş hücreleri gece boyunca 27 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, elektrofizyoloji yapılıyorsa, bir UV lambası altında EGFP'nin floresan sinyalini gözlemleyerek hücrelerin başarılı bir şekilde transfekte edildiğini doğrulayın.

Elektrofizyoloji yapılıyorsa, hücreleri 12 oyuklu plakadan 500 mikrolitre tam DMEM'de PDL kaplı kapak kızaklarına aktarın. Kalsiyum görüntüleme yapıyorsanız, PDL kaplı kalsiyum görüntüleme odalarına yaklaşık 20.000 hücre tespit edin. Bu prosedürde, çift damıtılmış suda mililitre başına bir miligramda bir doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın.

Stok çözeltisini üç haftaya kadar dört santigrat derecede ışıktan koruyun. Uzun süreli depolama için, doksisiklin stok çözeltisini eksi 20 santigrat derecede tutun. Daha sonra, tam DMEM'de taze doksisiklin çözeltisi hazırlayın.

Ve 37 santigrat dereceye ısıtın. Elektrofizyolojik kayıtlar için, mililitre başına bir mikrogramda nihai bir doksisiklin konsantrasyonu oluşturmak için her bir oyuğa mililitrede iki mikrogramda 500 mikrolitre doksisiklin çözeltisi pipetleyin. Kalsiyum görüntüleme için, mililitre başına bir mikrogramda nihai bir doksisiklin konsantrasyonu elde etmek için her bir oyuğa mililitre başına üç mikrogramda 100 mikrolitre doksisiklin çözeltisi ekleyin.

Numuneyi 37 santigrat derecede indüksiyon için istenen süre boyunca ve yüzde beş CO2'de inkübe edin. Kalsiyum görüntüleme yoluyla protein ekspresyonunu kalibre etmek için Ringer solüsyonunu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye ısıtın. esterlerinin dağılmasına yardımcı olmak için, sulu çözeltilerdeki Fura-2 gibi bir fluesan iyon indikatörü, DMSO'da iyonik olmayan bir F-127 çözeltisi hazırlar.

İyonik olmayan F-127 çözülene kadar çözeltiyi 27 santigrat dereceye ısıtın. Daha sonra iyonik olmayan F-127 çözeltisini oda sıcaklığında saklayın ve kullanmadan önce tekrar 37 santigrat dereceye ısıtın. Bundan sonra, iki ila üç mikromolar Fura-2, mililitre başına 02 miligram iyonik olmayan F-127 ve 10 milimolar D-glikoz ile desteklenmiş Ringer çözeltisinden bir Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın.

Daha sonra ortamı odacıklardaki hücrelerden aspire edin ve Fura-2 yükleme solüsyonu ile değiştirin. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Daha sonra Fura-2 solüsyonunu aspire edin.

Ekstra hücresel boyayı çıkarmak için hücreleri Ringer ve 10 milimolar D-glikoz çözeltisi ile yıkayın. Her birinde 200 mikrolitre Ringer ve 10 milimolar D-glikoz çözeltisi bırakın. Ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, hazneyi mikroskop burun parçasının üzerindeki sahneye yerleştirin ve tutucu ile sabitleyin. Daha sonra, istenen nihai konsantrasyona göre TRPV1'e özgü agonist kapsaisin'in bir çalışma konsantrasyonunu hesaplayın ve hazırlayın. Ardından, lambayı, kamerayı ve mikroskobu açın ve 510 nanometre dalga boyunda emisyonu tespit etmek için Fura-2 filtresini seçin.

İstenilen büyütmeyi ayarlayın ve mikroskop düğmelerini kullanarak bu parametreleri manipüle ederek hücreleri seçilen alana odaklayın. Karanlıkta, arka plan ışığını çıkarın ve pozlama süresini ayarlayın. Resim örneklemesini istenen oranda ayarlayın.

Ardından, Fura-2 yüklü hücrelerin floresan tepkisini 340 nanometre ve 380 nanometre dalga boylarında uyararak kaydederek başlayın. 340 ila 380 sinyalin oranı, hücre içi kalsiyum konsantrasyonunun ve dolayısıyla TRPV1 aktivitesinin bir göstergesidir. Daha sonra, TRPV1'in ekspresyon seviyesini değerlendirmek ve TRPV1 yanıtını analiz etmek için bir mikromolar kapsaisin nihai doymuş konsantrasyonunu oluşturmak için 200 mikrolitre Ringer çözeltisine iki mikromolar kapsaisin ekleyin.

Tek kanallı kayıt için ideal indüksiyon süresini belirlemek için önce banyoyu ve pipet çözeltilerini hazırlayın. Ardından, 10 ila 12 megaohm'luk bir dirence kadar ateşle parlatılmış birkaç cam pipet hazırlayın. Hedeflenen hücrenin zarı üzerinde bir sızdırmazlık oluşturarak tüm hücre yama kelepçesi gerçekleştirin.

Ardından, tutma potansiyelini negatif 40 milivolta ayarlayın. Ve negatif basınç uygulayarak zarı yırtın. Daha sonra, mikromanipülatörü kullanarak, mebran yaması ile pipeti hücreden kaldırın.

Ardından füzyon sistemini doğrudan zar yamasını içeren pipetin yanına yerleştirin. Bessel filtresini ve çıkış kazancını sırasıyla iki ila beş killahurtz ve 10 ampere düşürün. Bunu takiben, doymuş agonist konsantrasyonlarını zar yaması üzerine bol miktarda dökün.

Ardından, hücrelere uygulanan indüksiyon süresine karşı başarıyla kaydedilen tek kanallı yamaların sayısını analiz edin ve indüksiyon süresini istenen sonuçlara göre ayarlayın. Burada, kapsaisin uygulamasından önce ve sonra RTRPV1'i geçici olarak eksprese eden TREX 293 hücrelerinin sahte renkli görüntüleri gösterilmektedir. Ve burada, tedavi edilen, transfekte edilmiş TREX 293 hücrelerinde hücre içi kalsiyum seviyelerinin zamanla karşılık gelen değişiklikleri verilmiştir.

Her grafik ortalama 50 hücreyi temsil eder. TRPV1 kayıtlarında tek kanallı yamanın başarı oranı, indüksiyon süresine bağlıdır. İşte iki saat ve dört saatlik indüksiyondan sonra RTRPV1'i geçici olarak eksprese eden TREX 293 hücrelerinden gelen yamaların mevcut izleri.

Ve bu grafik, belirtilen indüksiyon zamanından sonra bir yamadaki kanal sayısını tanımlar. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa, transfeksiyondan sonraki 12 saat içinde kontrollü ekspresyonu olan bir proteinin analizini bize verebilir. Bu prosedürü denerken, farklı proteinler için transfeksiyon konsantrasyonlarını ve indüksiyon süresini standartlaştırmayı hatırlamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, seçtiğiniz iyon için zaman açısından verimli bir şekilde kontrol edilebilir bir ifade sisteminin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.