Name: Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi İn Vitro İnsan Kan-beyin bariyeri Model (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Öğrenin lenfosit ekstravazasyonunu in vitro insan kan-beyin bariyeri modeli kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem, merkezi sinir sistemi iltihabi hastalıklarını ve tedavi stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, "Multipl Sklerozda Düzenleyici Mekanizmalara Karşı Başlatıcı/Efektör-Hastalıkla Mücadeleye Doğru İlerleme" İşbirlikçi Araştırma Merkezi CRC TR128 tarafından desteklenmiştir (Proje A9'dan H.W. ve C.C.G.'ye, proje B1'den N.S.'ye).

1. Hücre İnsan Beyin mikrovasküler endotel hücreleri Kültürü (HBMEC) <ol><li> hücre kültürü şişelerinde kaplanması <ol><li> Fibronektin, bir çözelti hazırlamak bir 15 mL santrifüj tüpüne 10 ml PBS ekleyin. 150 ul fibronektin ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> alt kapak için bir T-25 hücre kültür şişesi fibronektin çözeltisi 2 ml. kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de en az 3 saat boyunca hücre kültür şişesi inkübe edin. Fibronektin kaplanmış şişeler 37 ° C /% 5 CO2 ile 2 hafta boyunca depolanabilir. </li></ol></li><li> Tohumlama ve HBMEC hücre kültürü <ol><li> Hücre kültür şişesi altından aspire fibronektin çözeltisi. 6 ml ECM-b ortamda süspansiyon haline getirilmiş 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² ekle (= ECM-b,% 5 fetal sığır serumu,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 endotel hücre büyüme takviyesi ile takviye edilmiştir). 37 ° C /% 5 CO2 ile inkübe edin. Bir mikroskop kullanılarak günlük hücre büyümesini kontrol edin. </li><li> 3 günde ortamı değiştirin.Hasat veya HBMEC yaklaşık% 80 konfluansa ulaşmalarına bölünmüş hücreleri. HBMEC fizyolojik özellikleri kaybını önlemek için geçit 1 ile 15 arasında kullanılmalıdır. </li></ol></li><li> Hasat HBMEC. <ol><li> 1 oranında PBS ile Accutase (1x) ile muamele Accutase çözelti hazırlayın: 1 arasındadır. sonraki kullanıma kadar bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de Accutase çözüm tutun. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre kültür şişesi ECM-b ortamı aktarın. Hücre kültür şişesinin dibinde 5 ml PBS ilave edilerek HBMEC yıkayın. PBS aspire ve yıkama adım iki kez daha tekrarlayın. </li><li> 2 mL Accutase önceden ısıtılmış solüsyonu ekleyin. 2 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Sonrasında HBMEC sıkıca hücre kültürü şişesi birkaç kez dokunarak yeniden askıya alınır. Hücre kopması, bir mikroskop kullanılarak kontrol edilir </li><li> Daha önce, bir 15 ml tüp içinde saklanan ECM-b-orta kısa HBMEC ayırmak için başlangıç ​​olarak geri hücre kültür şişesi içine ilave edilir. En HBMEC kadar tekrar tekrar şişenin alt durulayınyeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Süpernatant atılır ve 1 mL ECM-b ortamda hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayımı ve ml ECM-b ortamı başına 3 x 10 5 HBMEC bir son konsantrasyon elde etmek için bir hücre süspansiyonu seyreltin. </li></ol></li></ol> Hücre Kültürü ekler 2. hazırlanması <ol><li> hücre kültürü ekler kaplanması Önemli not: hücre kültürü ekler zarını dokunmaktan kaçının. <ol><li> Her bir hücre kültürü eki 100 uL fibronektin çözeltisi (1.1.1 bakınız) (Şekil 1A) ve bir 96-gözlü düz tabanlı plakanın bir kuyu (optik kontrol çukur) ekleyin. 37 ° C&#39;de en az 3 saat süreyle inkübe edin. İnkübasyon aspirat fibronektin çözeltisi sonra. </li><li> 100 uL HBMEC hücre kültürü ekler süspansiyonun ve iyi optik kontrol ekleyin. Hücrenin alt bölmeye 600 ul ECM-b orta ekleyinkültür ekleri. , 37 ° C / 5 bariyer bütünlüğünü (Şekil 1B) kadar% CO2 ulaşıldığında 4 gün de optik kontrol HBMEC mikroskopik değerlendirme hücre büyümesini kontrol - 3 inkübe edin. Not: Dört gün ötesinde Hücre büyümesi önerilmez. </li><li> İsteğe bağlı: enflamatuvar koşulları taklit etmek için alt bölmeden orta aspire ve 24 saat göç deneyi öncesinde 500 U / ml IFN-γ / TNF-a ile takviye ECM-b ortamı ile değiştirin. </li></ol></li></ol> Hicret Testinin gününde Evans Blue ile 3. Kalite Kontrolü <ol><li> Evans mavisi çözeltisinin hazırlanması <ol><li> 15 ml santrifüj tüpü kullanılarak 200 ul B27 eki ile, PBS / B27 çözeltisi karışımı 10 ml PBS hazırlamak. Evans mavi stok çözeltisi ile seyreltilir (20 mg / ml PBS) 1: PBS / B27 1.000. </li></ol></li><li> Evans mavisi geçirgenlik deneyi <ol><li> Üst bölme, ardından alt bölmeden orta aspirekonfluent tek tabaka HBMEC ihtiva eden bir hücre kültürü ucun. hücre kültürü eki 100 mcL Evans mavisi solüsyonu ekleyin. </li><li> Alt bölmeye 600 uL PBS / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 &#39;de 60 dakika boyunca inkübe edin. Dikkatle forseps kullanarak hücre kültürü eki çıkarın. </li></ol></li><li> Evans mavisi ölçüm <ol><li> alt bölme PBS / B27 çıkarın ve siyah bir polistirol 96-gözlü düz dipli levhanın iki oyuklarına 100 uL her aktarın. bir Tecan Sonsuz M200 Pro plaka okuyucuda plaka yerleştirin ve optimal z konumunu belirler. </li><li> (Örneğin: eksitasyon: 620 nm, emisyon: 680 nm, bant genişliği eksitasyon: 9 nm, emisyon bant genişliği: 20 nm, 175x geliştirme, 25 yanıp söner, entegrasyon süresi: 20 us) Evans mavisi kullanılarak ilgili ayarlar Ölçü uyarım. </li><li> HBMEC bariyer fonksiyonu tohum sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavi geçirgenliğini tasvir eden bir standart eğriye elde edilen veriler karşılaştırma belirlemek içining hücreler (sağ Şekil 1B). </li></ol></li></ol> 4. Yer değiştirme tahlili <ol><li> periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinin (PBMC) hazırlanması. <ol><li> 15 ml lik santrifüj tüpüne 10 ml RPMI ekleyin ve 200 uL B27 ek ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de PBMC ve santrifüj hücreleri sayın. 5 x 10 6 hücre / ml RPMI / B27 bir nihai konsantrasyona kadar PBMC yeniden askıya. </li></ol></li><li> göç deneyi kunnak <ol><li> Konfluent HBMEC mono tabakalar (Şekil 1A) ihtiva eden hücre kültürü eklerin üst bölme ve ardından alt bölmeden orta aspire. Donör başına başına 24 oyuklu plakanın bir oyuk (in vitro kontrol), hücre kültürü ekler 100 uL PBMC süspansiyonu, her ekleme ve. </li><li> In vitro kontrol ait PBMC hücre kültürü ekler ve 500 uL alt bölmeye 600 uL RPMI / B27 ekleyin ve 37 ° C /% 5 CO2 de 6 saat inkübe edilir. </li&gt; </ol></li><li> Taşınan PBMC&#39;nin Hasat <ol><li> forseps kullanılarak hücre kültürü eki çıkarın ve dikkatli bir şekilde membran dokunmadan 400 uL PBS ile alt yıkayın. Hücre kültürü eki atın. </li><li> 20 uL akış sayısı flüoro ekleme hücre kültürünün alt bölüme (yaklaşık 1.000 boncuk / uL) in vitro kontrol için hem de eklemek ve iyice karıştırın. borular akış sitometrisi PBMC süspansiyonun devri 1 ml. </li></ol></li></ol> 5. Akış Sitometri <ol><li> örnek hazırlama <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin PBMC. </li><li> 100 ul florokrom-eşlenik antikorlar ekleyerek antikor çözeltisi hazırlayın numune başına (PBS /% 1 BSA / 2 mM EDTA) içinde tampon akış sitometrisi. 1 uL CD4-FITC aşağıdaki sonuçları elde etmek için, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5 @, 1 uL, CD56-PY7, 1 uL CD8-A700 ve 1 uL CD16-A750 numune başına kullanılmıştır. </li><li> PB Re-askıyaAntikor çözeltisinin 100 uL MC ve 4 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 250 uL, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de tampon ve santrifüj akış sitometrisi ekleyin. </li></ol></li><li> Numune toplama <ol><li> gereken miktarda PBMC askıya yeniden akış sitometrisi tampon maddesiyle (kullanılan akış sitometresi bağlı olarak değişir). </li><li> akış sayısı flüoro tespit etmek için 525 ile 700 nm dalga boyunda arasında aktif detektörü ile akış sitometresiyle lekeli PBMC Edinme (eksitasyon 488 nm, emisyon 525-700 nm). (Aşağıdaki adımlar Kaluza G yazılımı ile çalışan sitometresi Gallios akış kullanıldığında bir örnektir. (1) başlatın işletim sistem tamamen dolu olduğu zaman (2), renkli &quot;sitometresinde&quot; tuşuna basarak akış sitometresi başlangıç . (3) &quot;açık protokol&quot; düğmesine basarak ilgili edinim protokolünü yükleyin. (4) gerekli protokolü seçin ve &quot;açık&quot; seçeneğini seçin. (5) sağ ile tıklayarak her numune için protokol çoğaltınSanal atlıkarınca ve &quot;yinelenen&quot; sahada sol klik görünür protokolüne fare düğmesi. (6) örnek bir liste her bir örnek olarak etiketleyin. (7) döner piramit belirtilen pozisyonlarında örnekleri aktarın ve satın alma başlar.) </li></ol></li><li> Numune analizi <ol><li> İlgili yazılım kullanarak veri sitometrisi Açık çıkan akışı. In vitro kontrol gözlerinden elde transmigrant PBMC ilgi olarak hücre alt popülasyonlarının sayısını belirler ve ilgili analiz yazılımı kullanılarak sayım flüoro akar. (Yolluk stratejinin bir örneği (Şekil sonuç bölümünde 1 C verilmiştir: İleri saçılma kanalı (FSC) grafiği yana doğru bir dağılım kanalı (SSC) içerisinde lenfositleri seçmek için, ilk, NK-hücre alt setlerinin bir transmigrasyonu, analiz etmek lenfositlerdir. daha sonra bir CD56 grafiği CD3 ve CD56 +, CD3 görüntülenen -. NK hücreleri seçilmektedir NK-hücre alt kümeleri arasında ayrım yapmak için, NK hücreleri de gösterildiBir CD56 CD16 karşı grafiğidir ve CD56 parlak CD16 / dim - hem de CD56 loş CD16 + NK hücreleri seçilmektedir. Buna ek olarak, akış sayısı florosferler bunların sayısını belirlemek için zamana karşı 525 ila 700 nm arasında bir emisyon ile bir kanalın bir arsa görüntülenen daha sonra FSC SSC karşı grafiğinden seçilir ve.) </li><li> Her numunenin toplam hücre sayısını hesaplamak için, akış sayısı flüoro kullanarak hücrelerin tespit sayısını normalize: <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Toplam geçen hücre ve in vitro kontrol toplam hücrelerin arasındaki oran olarak yayılan hücrelerin yüzdesini belirlemek. </li></ol></li></ol>

Yazar(lar), bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili olarak aşağıdaki potansiyel çıkar çatışmalarını beyan etmişlerdir: A.S.-M. ve U.B.'nin herhangi bir mali açıklaması yoktur. T. S.-H. Biogen'den seyahat ve konferans masraflarını aldı. NS, Biogen ve Novartis Pharma'dan konuşmacı ve danışma kurulu ücretlerinin yanı sıra Biogen'den seyahat masraflarını aldı. HW, Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis ve Sanofi-Genzyme'ın Bilimsel Danışma Kurullarında/Yönlendirme Komitelerinde görev yaptığı için tazminat aldı. Ayrıca Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis ve Sanofi-Genzyme'den konuşmacı fahri ve seyahat desteği aldı. Biogen, Merck Serono, Novartis ve Sanofi-Genzyme'den danışman olarak tazminat aldı. H.W. Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Almanya ve Sanofi ABD'den araştırma desteği aldı. CCG, Genzyme, Novartis Pharma GmbH ve Bayer Health Care'den toplantılara katılmak için konuşmacı ücreti ve seyahat masrafları aldı.

Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS&#39;ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir. Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bundan başka, 24 saat önce deney, ...

dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS&#39;ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir<html> hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah. Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = &quot;xref&quot;&gt; 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar. Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering&#39;i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar. In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim - NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>CaCl 2 veya MgCl <2 / sub ></td></tr> <tr><td>Sığır plazmasından</td> <td>1 mg / mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td></tr> olmayan <tr><td>T-25 hücre kültürü şişesi</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Endotel hücre büyüme</td><td>takviyesi ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>şeffaf, 6.5 mm çap, 3.0 & mikro; m gözenek boyutu</td></tr><tr><td>96 oyuklu düz alt plaka</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>stok çözümü: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x konsantre</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu siyah düz tabanlı plaka</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sayısı Florosferler</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10 renkli akış sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gama;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>klonu UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>klonu N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>klonu 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>klonu RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>klonu B9.11</td></tr></tbody></table>

bir kullanma lenfosit ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn vitro</em&gt; İnsan kan-beyin bariyeri model

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS&#39;de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini - Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.

NK-hücresi ve insan kan-beyin bariyeri modeli (Şekil 1A) kullanılarak T-hücresi alt kümelerinin bir transmigrasyonu, Örnek teşkil eden sonuçlar gösterilmektedir. HBMEC tek tabaka bütünlüğü sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçülmesi, ve Evans mavisi geçirgenlik (Şekil 1B) lekelenmesi ile doğrulandı. 3 sonra - 4 gün kültür HBMEC sıkı bir bağlantı molekülü ZO-1 (sol Şekil 1B,) olarak ifade edilmiştir....

Burada, lenfositlerin merkezi sinir sistemine in vitro göçünü araştırmayı sağlayan bir insan kan-beyin bariyeri modelini açıklıyoruz.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Bu transmigrasyon deneyinin genel amacı, lenfositlerin merkezi sinir sistemine ekstravazasyonunu in vitro olarak incelemektir. Bu yöntem, merkezi sinir sisteminin inflamatuar hastalıklarına dair anlayışımızın geliştirilmesine ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin bazı avantajları, kolayca erişilebilir olması ve nadir lenfosit popülasyonlarının tek hücre düzeyinde analizine olanak tanımasıdır.Bu yöntem, lenfositlerin kan-beyin bariyerini aşarak göç etmesi hakkında bilgi sağlayabilir ve kan-beyinomspinal sıvı bariyeri üzerinden gerçekleşen göç çalışmalarına uygulanabilir. Ek olarak, kan-beyin bariyeri modelinin bütünlüğünü değerlendirmek için Evans blue permeasyon analizi gerçekleştirilebilir. Bir T-25 hücre kültürü flaskının tabanını, 37 °C ve %5 karbondioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe en az üç saatlik bir inkübasyon için iki mL taze hazırlanmış fibronektin çözeltisi ile kaplayarak başlayın.İnkübasyon sonunda, fibronektin çözeltisini altı mililitre komple ECM-b medyumunda bulunan 7,2 x 10⁴ insan beyin mikrodamar endotel hücreleri (HBMEC) ile değiştirin ve flaskı inkübatöre geri yerleştirin. HBMEC'ler %80 konfluense ulaştığında, süpernatanı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışık hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücrelerin üzerine iki mililitre önceden ısıtılmış Accutase çözeltisi ekleyerek 37 °C'de iki dakika bekletin.Ardından erlene birkaç kez kuvvetlice vurun ve hücrelerin ayrıldığını ışık mikroskobu ile doğrulayın. Hücreler erlen tabanından ayrılmaya başladığında, HBMEC'lerin çoğu süspanse olana kadar erleni topladığınız süpernatant ile defalarca durulayın. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüj işlemi için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve sayım yapmak için peleti bir mililitre taze ECM-b medyumunda yeniden süspanse edin.Bir transmigrasyon deneyi için hücre kültürü insertlerini hazırlamak üzere, öncelikle her bir inserte ve 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın bir kuyucuğuna 100 µL fibronektin çözeltisi ekleyin. 37 °C'de üç saat beklettikten sonra, fibronektin çözeltisini 100 µL HBMEC ile değiştirin ve hücre kültürü insertlerinin alt bölmelerine 600 µL taze ECM-b ortamı ekleyin. Ardından plakaları üç ila dört gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.Bariyer bütünlüğünün sağlanıp sağlanmadığını test etmek için, bir hücre kültürü insertinin alt ve üst bölmelerindeki medyumu aspire edin ve insertin içine 100 µL taze hazırlanmış Evans blue çözeltisi ekleyin. Alt bölmeye B27 ile desteklenmiş 600 µL PBS ekleyin ve plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Bir saat sonra, bir pens yardımıyla inserti dikkatlice çıkarın ve alt bölmeden 100 µL PBS B27'yi siyah, polistiren, 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın iki ayrı kuyucuğuna aktarın.Ardından plakayı çok modlu bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve optimal z-konumunu belirleyin. HBMEC bariyer fonksiyonunu belirlemek için, uygun ayarları kullanarak Evans blue boya çözeltisinin eksitasyonunu ölçün ve elde edilen verileri, ekimden sonraki farklı zaman noktalarında HBMEC üzerinden Evans blue permeasyonunu gösteren bir standart eğri ile karşılaştırın. Hücre monokatmanının oluşumu doğrulandıktan sonra, periferik kan mononükleer hücre (PBMC) örneğini, B27 takviyeli RPMI besiyerinde 5 × 10⁶ hücre/mL konsantrasyona yeniden süspande edin.Ardından, konfluen HBMEC monokatmanlarını içeren uygun sayıda hücre kültürü insertinin alt ve üst bölmelerindeki medyumu aspire edin ve her donör için 100 mikrolitre PBMC'yi hücre kültürü insertlerine ve her bir in vitro kontrol için 24 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin. Hücre kültürü insertlerinin alt bölmelerine 600 mikrolitre RPMI artı B27, in vitro kontrol kuyucuklarına ise 500 mikrolitre ekleyin ve plakaları altı saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin. İnkübasyon sonunda, membranlara dokunmadan alt kısımları 400 mikrolitre PBS ile dikkatlice durulayarak, hücre kültürü insertlerini pensle çıkarın.Ardından, deneysel ve in vitro kontrol kuyucuklarındaki hücrelerle 20 µL Flow-Count Fluorospheres'i iyice karıştırın ve elde edilen PBMC süspansiyonlarından bir mL'sini uygun karşılık gelen akış sitometrisi tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjle toplayın ve her örneğe, 100 µL akış sitometrisi tamponu içinde ilgilenilen florokrom-konjuge antikorları ekleyin. Dört °C'de 30 dakika bekledikten sonra, hücreleri 250 µL taze akış sitometrisi tamponu ile yıkayın ve peletleri analiz için uygun hacimdeki akış sitometrisi tamponu içinde yeniden süspanse edin.Tüm veriler elde edildiğinde, uygun akış sitometrisi analiz yazılımını açın. NK hücre alt küme transmigrasyonunu analiz etmek için öncelikle yan saçılma (side scatter) ile ileri saçılma (forward scatter) kanalı grafiğinde lenfositleri seçin ve hücreleri CD3'e karşı CD56 nokta grafiğinde görüntüleyin. Ardından CD56-pozitif, CD3-negatif NK hücrelerini seçin.Transmigre NK hücre alt kümelerini ayırt etmek için, hücreleri bir CD56'ya karşı CD16 grafiğinde görüntüleyin ve CD56bright, CD16dim veya negatif ile CD56dim, CD16-pozitif hücreler için kapı belirleyin. Ardından, ileriye saçılma karşı dik saçılma grafiğinden Flow-Count Florosferleri seçin. Boncuk sayısını belirlemek için, seçilen verileri 525 ile 700 nanometre arasındaki bir emisyon dalga boyunu kapsayan bir kanalın zamana karşı grafiğinde görüntüleyin.Son olarak, göç eden NK hücrelerinin yüzdesini, göç eden toplam hücre sayısının in vitro kontroldeki toplam hücre sayısına oranı olarak belirleyin. Üç ila dört günlük kültürün ardından, HBMEC'ler sıkı bağlantı molekülü Zonula occludens-1 eksprese etmiş ve transendotel elektriksel direnç gösteren ve Evans mavisi boya permeasyonu azalmış tek katmanlar halinde büyümüştür. Tüm PBMC transmigrasyon testi öncesinde endotel hücre tek katmanının 24 saat boyunca interferon gamma ve TNF alfa ile stimüle edilmesi, analiz edilen tüm lenfosit popülasyonlarının göçünde artışla sonuçlanır.İlginç bir şekilde, CD56bright, CD16dim veya negatif NK hücreleri, hem uyarılmamış hem de sitokinle aktive edilmiş HBMEC'lerde CD56dim, CD16-pozitif NK hücrelerine göre daha yüksek migrasyon kapasitesi sergiler. Her ne kadar inflamasyonlu bir hücre monotabakasından transmigrasyonun göreceli artışı genel olarak CD56dim hücreler için daha yüksek olsa da, bu durum CD56bright, CD16dim-negatif NK hücrelerinin intratekal bölmede zenginleştiğine dair in vivo gözlemleri taklit etmektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik 10 saat içinde tamamlanabilir.İn vitro transmigrasyon düzeneğinin interferon gamma ve TNF alfa ile ön işlemi, lenfosit migrasyonunun inflamatuar koşullar altında incelenmesine olanak tanır. Protokolümüz, merkezi sinir sistemine lenfosit transmigrasyonu için daha gelişmiş bir model sağlamak amacıyla, kayma kuvvetleri uygulanarak veya astrositler gibi kan-beyin bariyerinin diğer hücreleri ile ko-kültür yapılarak modifiye edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modelini kullanarak lenfosit transmigrasyonunun nasıl araştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir kan-beyin bariyeri (BBB) endotel modeli boyunca lenfosit transgöçünün deneysel bir araştırmasını göstermektedir. İnsan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin (HBMEC'ler) tek tabakası in vitro olarak üretilir ve lenfositleri içeren periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) monotabakaya eklenir. Hücreler daha sonra lenfosit transgöçüne izin vermek için inkübe edilir ve göç eden hücreler akış sitometrisi kullanılarak ölçülür.

Mikrovasküler Endotel Hücre Tek Tabakası Boyunca Lenfosit Transgrasyonunun İncelenmesi

Kan-beyin bariyeri (KBB) insan modellerinin oluşturulması BBB yetmezliği ile ilişkili beyin koşulları araştırma yararlanabilir. Burada gözenekli zarın karşı tarafında insan astrosit ve beyin endotel hücreleri coculturing izin veren bir temas BBB modelinin hazırlanması için geliştirilmiş bir tekniği açıklar.

Yöntem kan-beyin bariyerini bir insan hücre tabanlı bir İletişim Modelinin Hazırlanması için Geliştirilmiş

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Burada, lökosit çıkış üzerinden saf, iltihaplı, vivo miktar ve malign fare cilt için yöntemleri gösterir. Biz iki model kafa kafaya bir karşılaştırma gerçekleştirir: transdermal FITC uygulama ve in situ photoconversion. Ayrıca, lökosit çıkış kutanöz tümörler izlemek için photoconversion yardımcı programı göstermektedir.

Fare deri ve tümör lenf damarları ile lökosit çıkış miktarının

Biz Lucifer Sarı (LY) hCMEC / D3 hücre monolayers, insan kan-beyin bariyerinin bir in vitro modeli görünür parasellüler geçirgenlik belirlemek için sağlam bir belirteç olduğunu göstermek için bir floresan tahlili salıyoruz. Bu analizi, kültürlü hCMEC/D3 hücrelerinde etkili bir monolayer oluşumunun kinetiklerini belirlemek için kullandık.

Lucifer Sarı - İnsan Kan-beyin Bariyerbir Hücre Modeli sağlam bir Parasellüler Geçirgenlik Marker

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Bu protokolde lenfositler, alt odadan gözenekli bir zarla ayrılan bir transmigration sisteminin üst odasına yerleştirilir. Keokin alt hazneye eklenir, bu da bir kemokin gradyan boyunca aktif göçe neden olur. 48 saat sonra, lenfositler transmigration quantitate için her iki odada sayılır.

Ex Vivo Transmigration Sisteminde Lenfosit Göçünün Değerlendirilmesi

Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Burada, pluripotent kök hücrelerin beyin mikrovasküler endotel hücresi (BMEC) benzeri hücrelere farklılaşmasını sağlayan genişletilmiş endotel hücre kültürü yöntemi (EECM) olan bir protokolü açıklıyoruz. Bu hücreler endotel hücre adezyon molekülü ekspresyonunu gösterir ve bu nedenle in vitro immün hücre etkileşimlerini incelemek için uygun bir insan kan-beyin bariyer modelidir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Olgun Bir İmmün Fenotipli Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Benzeri Hücrelere Farklılaşması

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Farelere farklı zaman noktalarında iki floresan boya uygulanarak kan-beyin bariyeri (BBB) bozulmasına bağlı boya ekstravazasyonunu görselleştirmek için bir yöntem geliştirilmiştir. Gliserolün kriyoprotektan olarak kullanılması, aynı numune üzerinde immünohistokimyayı kolaylaştırdı.

Hafif Travmatik Beyin Hasarı Olan Bir Fare Modelinde Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasının Değerlendirilmesi

Öğrenin lenfosit ekstravazasyonunu in vitro insan kan-beyin bariyeri modeli kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem, merkezi sinir sistemi iltihabi hastalıklarını ve tedavi stratejilerini anlamaya yardımcı olur.

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi

Daha fazla video keşfet