Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi İn Vitro İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Bu transmigrasyon testinin genel amacı, in vitro olarak merkezi sinir sistemine lenfosit ekstravazasyonunu araştırmaktır. Bu yöntem, merkezi sinir sisteminin enflamatuar hastalıklarını daha iyi anlamamıza ve yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin bazı avantajları, kolay erişilebilir olması ve nadir lenfosit popülasyonlarının tek hücre düzeyinde analizine izin vermesidir.

Bu yöntem, kan-beyin bariyeri boyunca lenfosit transgöçü hakkında bilgi sağlayabilir ve kan-beyin omurilik sıvısı bariyeri yoluyla transmigrasyon çalışmasına uygulanabilir. Ek olarak, kan-beyin bariyeri modelinin bütünlüğünü değerlendirmek için Evans mavisi geçirgenlik analizi yapılabilir. Bir T-25 hücre kültürü şişesinin altını, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatöründe en az üç saatlik bir inkübasyon için iki mililitre taze hazırlanmış fibronektin çözeltisi ile kaplayarak başlayın.

İnkübasyonun sonunda, fibronektin çözeltisini altı mililitre tam ECM-b ortamında 7.2 kez 10 ila dördüncü insan beyni mikrovasküler endotel hücreleri veya HBMEC ile değiştirin ve şişeyi inkübatöre geri koyun. HBMEC% 80'lik bir birleşmeye ulaştığında, süpernatanı 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve yapışan hücreleri beş mililitre PBS ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, hücrelere 37 santigrat derecede iki dakika boyunca iki mililitre önceden ısıtılmış Accutase çözeltisi ekleyin.

Ardından, hücre ayrılmasını ışık mikroskobu ile onaylayarak şişeye birkaç kez sıkıca vurun. Hücreler şişenin dibinden kalkmaya başladığında, HBMEC'nin çoğu yeniden süspanse edilene kadar şişeyi tekrar tekrar durulamak için hasat edilen süpernatantı kullanın. Daha sonra hücre süspansiyonunu santrifüjleme için 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve peleti sayım için bir mililitre taze ECM-b ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre kültürü eklerini bir transmigrasyon testi için hazırlamak için, önce her bir eke 100 mikrolitre fibronektin çözeltisi ve 96 oyuklu düz tabanlı bir plakanın bir oyuğuna ekleyin. 37 santigrat derecede üç saat sonra, fibronektin çözeltisini 100 mikrolitre HBMEC ile değiştirin ve hücre kültürü eklerinin alt bölmelerine 600 mikrolitre taze ECM-b ortamı ekleyin. Daha sonra plakaları üç ila dört gün boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Bariyer bütünlüğüne ulaşılıp ulaşılmadığını test etmek için, ortamı bir hücre kültürü ekinin alt ve üst bölmelerinden aspire edin ve eke 100 mikrolitre taze hazırlanmış Evans mavisi çözeltisi ekleyin. Alt bölmeye B27 ile takviye edilmiş 600 mikrolitre PBS ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Bir saat sonra, eki dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın ve 100 mikrolitre PBS B27'yi alt bölmeden siyah, polistirol, 96 oyuklu düz bir alt plakanın iki ayrı kuyucuğuna aktarın.

Ardından plakayı çok modlu bir mikroplaka okuyucuya yükleyin ve en uygun z konumunu belirleyin. HBMEC bariyer fonksiyonunu belirlemek için, uygun ayarları kullanarak Evans mavi boya çözeltisinin uyarımını ölçün ve elde edilen verileri, tohumlamadan sonra farklı zaman noktalarında HBMEC boyunca Evans mavisi geçirgenliğini gösteren standart bir eğri ile karşılaştırın. Hücre tek tabakasının oluşumunu doğruladıktan sonra, periferik kan mononükleer hücresini veya PBMC'yi yeniden süspanse edin, B27 ile takviye edilmiş RPMI ortamında mililitre konsantrasyonunda beş kez 10 ila altıncı hücreye kadar numune alın.

Daha sonra, birleşik HBMEC tek katmanlarını içeren uygun sayıda hücre kültürü ekinin alt ve üst bölmelerinden ortamı aspire edin ve hücre kültürü eklerine donör başına 100 mikrolitre PBMC ekleyin ve in vitro kontrol başına 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekleyin. Hücre kültürü eklerinin alt bölmelerine 600 mikrolitre RPMI artı B27 ve in vitro kontrol kuyucuklarına 500 mikrolitre ekleyin ve plakaları altı saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. İnkübasyonun sonunda, hücre kültürü eklerini çıkarmak için forseps kullanın, alt kısımları zarlara dokunmadan 400 mikrolitre PBS ile dikkatlice durulayın.

Daha sonra 20 mikrolitre Akış Sayımlı Florosferleri deneysel ve in vitro kontrol kuyularındaki hücrelerle iyice karıştırın ve elde edilen PBMC süspansiyonlarının bir mililitresini uygun karşılık gelen akış sitometri tüplerine aktarın. Hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve ilgilenilen florokrom konjuge antikorları her numuneye 100 mikrolitre akış sitometrisi tamponuna ekleyin. Dört santigrat derecede 30 dakika sonra, hücreleri 250 mikrolitre taze akış sitometri tamponu ile yıkayın ve peletleri analiz için uygun hacimde akış sitometri tamponunda yeniden süspanse edin.

Tüm veriler elde edildiğinde, uygun akış sitometrisi analiz yazılımını açın. NK hücre alt kümesi transgöçünü analiz etmek için, önce lenfositleri yandan ve ileri saçılma kanalı grafiğinde seçin ve hücreleri bir CD3'e karşı CD56 nokta grafiğinde görüntüleyin. Ardından CD56 pozitif, CD3 negatif NK hücrelerini seçin.

Göç eden NK hücre alt kümelerini ayırt etmek için, hücreleri CD56'ya karşı CD16 grafiğinde ve CD56bright, CD16dim veya negatif ve CD56dim, CD16-pozitif hücreler için geçitte görüntüleyin. Ardından, ileri ve yan saçılma grafiğinden Akış Sayımı Florosferlerini seçin. Boncuk sayısını belirlemek için, seçilen verileri zamana karşı 525 ila 700 nanometre arasında bir emisyon dalga boyunu kapsayan bir kanal çiziminde görüntüleyin.

Son olarak, taşınan NK hücrelerinin yüzdesini, taşınan hücrelerin toplam sayısı ile in vitro kontroldeki toplam hücre sayısı arasındaki oran olarak belirleyin. Üç ila dört günlük kültürün ardından, HBMEC sıkı bağlantı molekülü Zonula occludens-1'i eksprese etti ve transendotelyal elektrik direnci sergileyen ve Evans mavi boya geçirgenliğini azaltan tek tabakalarda büyüdü. Endotel hücre tek tabakasının tam bir PBMC transmigrasyon testinden 24 saat önce interferon gama ve TNF alfa ile uyarılması, analiz edilen tüm lenfosit popülasyonlarının migrasyonunun artmasına neden olur.

İlginç bir şekilde, CD56bright, CD16dim veya negatif NK hücreleri, hem uyarılmamış hem de sitokin ile aktive olan HBMEC'de CD56dim, CD16 pozitif NK'dan daha yüksek bir göç kapasitesi sergiler. İltihaplı bir hücre tek tabakası boyunca transmigrasyonun nispi artışı genel olarak CD56dim hücreleri için daha yüksek olmasına rağmen, CD56bright, CD16dim-negatif NK hücrelerinin intratekal bölmede zenginleştirildiği in vivo gözlemleri taklit eder. Bir ustalaşma ile bu teknik 10 saat içinde tamamlanabilir.

İn vitro transmigrasyon kurulumunun interferon gama ve TNF alfa ile ön tedavisi, enflamatuar koşullar altında lenfosit göçünün incelenmesini sağlar. Protokolümüz, lenfositlerin merkezi sinir sistemine göçü için rafine bir model sağlamak üzere, kesme kuvvetleri uygulanarak veya astrositler gibi kan-beyin bariyerinin diğer hücreleriyle birlikte yetiştirilerek değiştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, insan kan-beyin bariyerinin in vitro bir modelini kullanarak lenfosit transmigrasyonunun nasıl araştırılacağını iyi anlamış olmalısınız.