İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bu prosedürün genel amacı, ex vivo analizler ve hayvanın devam eden hastalık durumunun değerlendirilmesi için bronkoalveoler lavaj yoluyla akciğer lümeninin hücresel ve aselüler içeriğinin toplanmasıdır. Bu yöntem, akciğerdeki doğuştan gelen hücresel ve humoral yanıtların nicelleştirilmesi yoluyla enfeksiyon ve inflamasyonun neden olduğu bağışıklık mekanizmaları hakkında solunum immünolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, basit, verimli ve yüksek oranda tekrarlanabilir olması ve özel ekipman veya aletlere ihtiyaç duyulmamasıdır.

Prosedüre başlamadan önce, 0,5 santimetrelik şeffaf plastik polietilen 21 gauge boruya 23 gauge iğne sokarak bir kateter oluşturun ve hayvanı sırtüstü pozisyona getirin. Farenin uzuvlarını sabitleyin ve boynu% 70 etanol ile dezenfekte edin. Daha sonra trakea yakınında bir cilt kesisi yapmak için bir neşter kullanın.

Tükürük bezlerini ortaya çıkarmak için cildi açın ve bezleri ayırmak ve sternal hyoid kasını ortaya çıkarmak için forseps kullanın. Trakea çevresindeki kasları kesmek için forseps kullanın. Görünür olduğunda, trakeal dokunun altına pamuklu bir dikiş geçirmek için forseps kullanın.

Daha sonra, trakeanın ortasını iki kıkırdak halkası arasında dikkatlice delmek için 26 gauge bir iğne kullanın ve önceden hazırlanmış kateteri trakeal lümene yaklaşık 0,5 santimetre yerleştirin. Kateteri sütürle stabilize edin. Daha sonra, 100 mikromolar EDTA ile desteklenmiş bir mililitre steril dengeli tuz çözeltisi ile bir mililitrelik bir şırınga yükleyin.

Yüklü şırıngayı katetere bağlayın ve dengeli tuzu ve EDTA çözeltisini akciğere nazikçe enjekte edin. Salinin tamamı enjekte edildiğinde, göğüs kafesine masaj yaparken solüsyonu nazikçe aspire edin. BAL sıvısı alımını en üst düzeye çıkarmak ve kıvrılma kuvvetlerini en aza indirmek için katı sıvıyı enjekte ederken ve yeniden alırken nazik olmak çok önemlidir.

İçindeki katı sıvı burundan geçerse, sütürü kateter boyunca yeniden sabitleyin. Aspiratın tamamı toplandığında, sıvıyı buz üzerinde 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve lavajı iki kez daha tekrarlayın. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yedi dakika içinde tamamlanabilir.

Üçüncü bronkoalveoler lavaj toplama işleminden sonra, havuzlanmış aspiratı santrifüjleyin ve süpernatanı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peletleri 200 mikrolitre ACK lizis tamponunda tekrar süspanse edin. Oda sıcaklığında en fazla iki dakika sonra, lizis tamponunu bir mililitre soğuk PBS ile seyreltin ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.

Pelet, analiz edilecek numune sayısı için uygun PBS hacminde yeniden askıya alın ve hücreleri, analiz için 96 oyuklu bir plakanın uygun sayıda oyuğuna ayırın. Hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın ve peletleri 50 mikrolitre FC Blok ve PBS'de yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre uygun antikor kokteyli ekleyin ve hücreleri ışıktan korunarak 4 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, plakayı santrifüjleyin ve süpernatanı atın, peletleri akış sitometrik analizi için kuyu başına 200 mikrolitre FAX tamponunun nihai hacmine yeniden süspanse edin. Çeşitli bronkoalveoler lavaj hücresi popülasyonlarının yüzeylerindeki antijenlerin diferansiyel ekspresyonuna dayanan bir geçit stratejisi kullanarak, çeşitli bağışıklık hücresi tiplerini tanımlamak mümkündür. Hücreler ve tekiller, öne ve yana dağılma özelliklerine göre kapılıdır.

Canlı/ölü boya negatif hücreler kapılanır, ardından Cd11c Yüksek ve Cd11c Düşük hücrelerin tanımlanması takip edilir. Cd11c High popülasyonunda, makrofajlar ve dendritik hücreler sırasıyla MHC-II ve SinglecF ekspresyonlarına dayanarak tanımlanabilir. Cd11c Düşük popülasyonunda, T hücreleri ve B hücreleri, ilgili CD3 / CD19 ve MHC-II ekspresyonlarına göre tanımlanabilir.

Kalan hücrelerde, eozinofiller ve nötrofiller sırasıyla Cd11b veya Ly-6G marker ekspresyonu ile tanımlanabilir. Farklı hücre popülasyonlarının mutlak hücre sayılarını belirlemek için, örneğin naif ve LPS ile uyarılmış hayvanlarda, boncukların hücre olaylarına oranını karşılaştırarak boncuk sayma da eklenebilir. BAL sıvısının toplanmasından sonra, BAL sıvısının aselüler içeriği hakkında ek soruları yanıtlamak için ELISA immunoblot sitokin boncuk dizisi gibi diğer teknikler uygulanabilir.

Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların farelerin akciğer lümeninin hücresel ve hücresel olmayan içeriğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, BAL'ın nasıl verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.