Name: Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Öğrenin, sıçan iskelet kası kesitlerinde miyozin ağır zincir immünohistokimyası ve ImageJ kullanarak kas lifi popülasyonlarını otomatik ve kullanıcıdan bağımsız olarak hızlıca nicelendirmeyi. Bu yöntem, yaşlanma, hastalık veya travmanın kas kompozisyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Christian Doppler Araştırma Vakfı tarafından desteklenmiştir. Proje boyunca destek için Viyana, Avusturya Tıp Üniversitesinde Çekirdek Tesisi Görüntüleme Sabine Rauscher teşekkür etmek istiyorum. İlköğretim antikorlar NIH NICHD yarattığı ve Iowa, Biyoloji Bölümü, Iowa City Üniversitesi&#39;nde muhafaza Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası elde, Schiaffino, S. tarafından geliştirilmiştir.

FELASA 26 tarafından tavsiye edildiği hayvan deneklerin dahil tüm işlemler laboratuvar hayvanları bakım prensiplerine uygun olarak yürütülmüştür. Onay Viyana Tıp Üniversitesi ve Araştırma ve Bilim Avusturya Bakanlığının kurumsal inceleme kurulu tarafından çalışmanın öncesinde elde edildi (BMWF: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b /: Bundesministerium Wissenschaft und Forschung, referans numarası für 2014). 1. Kas Hasat NOT: Meng ve arkadaşları tarafından bir önceki yayın. 27 ayrıntılı olarak kas örneklerinin doğru dondurma tarif mevcuttur. <ol><li> Hemen hayvanların ötenazi sonra tüm kesitlerini elde etmek tüm kasları veya yeterli doku elde etmek. <ol><li> anestezi veya ötenazi sıçan kadar tüm kas çıkarın. Tüm bağ dokusu ve forseps ve makas ile kas çevreleyen tendonları çıkarın. bir içinnesthesia veya ötenazi, FELASA 28 uluslararası kurallara uyun. </li></ol></li><li> kalibre edilmiş hassas ölçeğini kullanarak kas tartın. Bu hızlı adım özellikle girişimsel prosedürlerinden sonra, kas numuneleri arasındaki bir analiz sağlar. </li><li> Her taraftan yaklaşık olarak 1 mm bir arayla kas büyüklüğüne göre, OCT bileşiği ile tamamen dolu bir kap içine, kas koyun (örneğin alüminyum folyodan yapılmış). </li><li> Yaklaşık 2 dakika içinde dondurularak sıvı azot kullanılarak izopentan soğutulmuş. izopentan kabın dibinde beyaz kristaller göstermeye başlamalıdır. Not: Bu adım kasının doğru mimarisi muhafaza etmek için gereklidir ve böylece doğru boyanma sağlar ve fiber 27 analiz eder. </li><li> Mağaza numuneler -80 ° C&#39;de en az 24 saat süre ile, OCT içinde muhafaza. Örnekler, ancak, corre, bir kaç ay ya da hatta yıllar boyunca -80 ° C&#39;de saklanabilir<html> ctly soğutulmuştur. </li><li> Bir kriyotom kullanılarak -20 ° C &#39;de kas orta kısmı 10 um enine kesitler halinde kesilmiştir. 10 um kesilerek uygun değilse, 20 um maksimum 2 um adımlarla kalınlığı artar. Yeterince keskin kesme bıçakları bu adım için çok önemlidir. </li><li> kesitleri slaytları benzetmekle yapışkan slaytlara uygulama bölümlerinden. kesitleri otomatik yapışkan slaytlar sadık olacaktır. gece boyunca boyama önce -20 ° C &#39;de slaytlar saklayın. </li></ol> 2. Boyama NOT: miyozin ağır zincir proteinlere karşı antikorların büyük bir kısmı mevcuttur; Ancak, kaliteli antikorlar otomatik edinimi ve analizler için gereklidir. Seyreltici ve antikorlar referans için Tablo 1 &#39;e bakınız. Bir tablo dosyası doğru seyreltme hesaplamak ve gerekli çözüm miktarlarda sayısını görmek için, bkz1 File source.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx&quot;&gt;Supplemental. <ol><li> Çözülme ve boyama prosedürü, 10 dakika süreyle dondurulmuş kas bölümleri, hava-kurutun. </li><li> Yıkama fosfat tamponlu tuz (PBS) +% 0.05 Triton X 10 dakika süre ile ve daha sonra 5 dakika süre ile dikkatli bir şekilde kayar. Triton önemli boyama kalitesini artırmak için gösterilmiştir. Daha fazla detay için açıklamalara bakın. </li><li> 2 dakika boyunca bölümler hava kuru olsun ve (antikor gerekli miktarda en aza indirmek için) ve 15 dakika için ek kurutmaya olanak sağlayan, bir hidrofobik kalem kullanılarak her lamın tek tek kesitlere özetlemektedir. </li><li> PBS + Tüm slaytlar bloke% 0.05 Triton X (PBST), oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 10 keçi serumu ihtiva eden. </li><li> PBS +% 0.05 Triton X (PBST) içeren% 10 keçi serumu bir karışım içinde tüm birincil antikorlar (Tablo 1) seyreltin. Uygulama öncesinde yeterince karıştırın. Triton X bütün enine kesitlerinin eşit boyanması için esastır. Hesaplamakkesiti başına birincil antikor kokteylinin yaklaşık 30 uL. </li><li> adımlar 2,7-2,13 için ışıktan yeterli korunma sağlamaktadır. Sönük oda ışıkları ve kapalı boyama tepsileri yeterli koruma sağlar. Buna ek olarak, boyama sırasında nemli bir ortam sağlar ve kurumasını önlemek için alt kısımdaki sıvı ile boyama tepsi doldurun. </li><li> Oda sıcaklığında bir nemli boyama tepsisine 1 saat slaytlara birincil antikor (Tablo 1) kokteyller uygulanır. </li><li> 5 dakika için yeni PBST ile daha sonra da 10 dakika süre ile PBS +% 0.05 Triton X slaytlar yıkayın. </li><li> PBS +% 0.05 Triton X (PBST) +% 10 keçi serumu bir kokteyli ikincil antikorlar seyreltilir. kesiti başına birincil antikor kokteylinin 30 uL hesaplayın. </li><li> 1 saat boyunca slaytlara ikincil antikor kokteyli uygulanır. </li><li> PBS ile slaytlar yıkayın +% 0.05 Triton X 10 dakika ve 5 dakika daha yeni PBST (PBST). </li><li> DAPI nükleer boyama kiti (tercihen okuma kullanımlı çözeltiler) fo uygular, 15 dakika ya da hücre çekirdekleri leke üreticinin talimatlarına göre aktifleştirilir. </li><li> Yıkama kısaca PBS + slaytlar% 0.05 Triton X 1 dakika için (PBST). Daha sonra, slaytlar hava kuru kısaca bildirin. </li><li> Floresan montaj orta ve lamelleri uygulayın. 4 ° C&#39;de ışıktan korunmuş ve 24-48 saat içinde en iyi şekilde görüntüleme gerçekleştirmek. </li></ol> 3. Mikroskopi <ol><li> Yük slayt tarayıcıya kayar. 12 slaytlar maksimum slayt tarayıcı bağlı mümkündür. </li><li> Yeni bir proje başlatın. Önizleme için DAPI kanalı ve 2.5X lensi ayarlayın. Ayrıntılı analiz için DAPI, GFP, FITC ve Cy5 kanalları ve 20X objektif kullanın. Otomatik odaklama DAPI kanalında proje boyunca elde edilir. </li><li> DAPI -blue FITC: yeşil, Teksas Kırmızı: Kırmızı, Cy5: Sarı her kanal için aşağıdaki renkler kullanın. </li><li> DAPI kanalı kullanılarak her lamın önizleme oluşturun. Bu amaçla, ilk numune üzerinde manuel odaklamayı uygulamak ve önizleme boyunca kullanmayıAnaliz her numunenin önizleme resimlerini elde etmek. </li><li> Ayrıntılı edinim süreci için eklenmesi gereken her kesiti Anahat. bütün ilgilendiren alanın başlığını sağlamak için, numunenin kenarlarına yakın özetliyor çekmeyin. </li><li> Her bir kanal için maruz kalma sürelerini ayarlar. Çoğu durumda, farklı kanalların pozlama parametreler tüm kesitler için aynıdır. </li><li> Otomatik görüntü elde etme çalıştırın. Erken otomatik süreçte yanlış edinimi önlemek için, görüş ilk alan için doğru edinimi edin. </li><li> Gerekirse, masaüstü yansıtma yazılımını kullanarak uzaktan kontrol kurmak. Bu, herhangi bir ağ veya internet bağlantısı üzerinden farklı bir bilgisayara slayt tarayıcının bilgisayar ekranı yansıtma görüntü elde etme sürecinin uzaktan izlenmesine olanak sağlar. Hiçbir değişiklik kullanılan slaytlar ilişkin fiziksel kurulumu yapılabilir rağmen, görüntü elde etme yazılımı sanal ortam izleme verir<html> Görüntülerin doğru odak veya pozlama süreleri. Buna ek olarak, tamamlanması için tahmini süre düzenli olarak kontrol edilebilir. </li><li> Görüntü edinimi işleminin tamamlanmasından sonra, elyaf mimarisi, tek tek liflerin ve çeşitli lif türleri ayırt edilebilir el ile kontrol edilerek tüm görüntülerin doğru otomatik odak kontrol eder. </li><li> Yeniden edinilen yanlış görünümü veya ilgi tüm alanların tek alanlar için görüntü alanlarını duruldu. Tek alanların yeniden kazanımı için, tüm proje boyunca alanları veya görüntüleri işaretlemek ve manuel odaklama sahip alanları reacquire. Çoğu durumda, farklı bir odak seviyesinde ilave bir görüntü ayrıntısı yanlış odaklı görüntülere yol açar </li><li> Nihai analizlere dahil edilmesi gereken her kesit için, jpeg dosyaları olarak ayrı ayrı (DAPI hariç) her kanalı ihracat. Ad ve Texas Kırmızı, FITC ve Cy5 adlı klasörlerde maruz kanallara göre dosyaları sıralamak. </li></ol> 4. Otomatik Elyaf Analizi çadır &quot;&gt; Not: Makro aşağıdaki web sayfasından elde edilebilir: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/ <ol><li> Önizleme analizler yapılmadan önce, geleneksel bir Görüntü düzenleme yazılımı ve lekeli elyaf ve arka arasında yeterli kontrast kontrol her resim. Gerekirse, parlaklık ve kontrast ayarı komutları kullanarak, farkı artırmak için kontrast ve parlaklık ayarı. </li><li> Açık ImageJ veya Fiji. komutunu kullanarak makro aç &quot;- Makrolar - Eklentiler. Edit&quot; Bu makro kaynak kodunu gösterir ve parametrelerin hızlı adaptasyon sağlar. Gerekirse, makro kaynak kodunda her kanal için klasör dizinini değiştirin. NOT: kas lifi analizler için Değerler sıçan biceps ve lumbrikal kasların, diğer türler veya farklı değerler gerektirebilir kaslarda dayanmaktadır. </li><li> makro başlatmak için &quot;run&quot; komutunu kullanın. klasörün tüm resimler artık makro yüklenen ve bir ardışık sırayla ölçülür. Sonuçlar sho vardırYeni bir pencerede wn. Bu adım, veriler analiz edilen miktarına bağlı olarak, birkaç saat saniye sürebilir. </li><li> Bir elektronik tablo dosyası olarak sonuçları penceresini aktarın. (Yavaş) pozitif sayılmıştır Cy5 için (ara ürün) FITC ve Texas Kırmızı (hızlı) lifleri değerleri belirlemek ve toplam lif sayısı için Özetle. </li></ol>

<ol><li>Kung, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Unit+Changes+Seen+With+Skeletal+Muscle+Sarcopenia+in+Oldest+Old+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).</li>
<li>Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+muscle+fiber+clustering+in+the+diaphragm+muscle+of+sarcopenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice.</a> Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).</li>
<li>Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+Between+Muscle+Fiber+Type+and+Reactive+Balance%3A+A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mot+Behav%22%5BJournal%5D)">Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study.</a> J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).</li>
<li>Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+Muscle+Overuse+Causes+Bilateral+Changes+in+Muscle+Fiber+Composition+and+Vascular+Supply%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply.</a> PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).</li>
<li>Hopker, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+training+status%2C+age%2C+and+muscle+fiber+type+on+cycling+efficiency+and+endurance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Suga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-predominant+promoter+activity+in+lentiviral-mediated+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse.</a> PLoS One. 6 (3), 16908(2011).</li>
<li>Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+muscle+fiber+type+measurements+with+clinical+and+molecular+genetic+data+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).</li>
<li>Rader, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cleft+palate+repair+on+the+susceptibility+to+contraction-induced+injury+of+single+permeabilized+muscle+fibers+from+congenitally-clefted+goat+palates%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates.</a> Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).</li>
<li>Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+type+II+muscle+fiber+damage+from+plyometric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Athl+Train%22%5BJournal%5D)">Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise.</a> J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).</li>
<li>Lieber, R. L., Fridén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+skeletal+muscle+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of skeletal muscle architecture.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+types+in+skeletal+muscle%3A+a+personal+account%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Fibre types in skeletal muscle: a personal account.</a> Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).</li>
<li>Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+velocity+and+myosin+heavy+chain+and+alkali+light+chain+isoform+composition+in+rat+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres.</a> J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).</li>
<li>Larsson, L., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+velocity+of+shortening+in+relation+to+myosin+isoform+composition+in+single+fibres+from+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles.</a> J Physiol. 472, 595-614 (1993).</li>
<li>Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+methods+for+the+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+size+and+metabolic+type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).</li>
<li>Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieber%2C+RL+%22Skeletal+muscle+structure%2C+function%2C+and+plasticity%22">Skeletal muscle structure, function, and plasticity</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).</li>
<li>Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+muscle+fiber+typing+by+quantitative+enzyme+assays+and+by+myosin+ATPase+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining.</a> J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).</li>
<li>Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+typing+in+routinely+processed+skeletal+muscle+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies.</a> Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).</li>
<li>Likar, B., Pernuš, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+serial+transverse+sections+of+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Registration of serial transverse sections of muscle fibers.</a> Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber-type-specific+cross-sectional+area+assessment+and+myonuclei+counting+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), 35273(2012).</li>
<li>Bergmeister, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+guidelines+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), e51586(2014).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Ribarič, S., ČebaŠek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Myosin+Heavy+Chain+Isoforms+in+Single+Muscle+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections.</a> Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Burada, çalışma ve otomatik olarak bir zaman etkili bir şekilde immünohistokimya ile sıçan kesitlerinin kas lifi popülasyonları ölçmek için yaygın olarak erişilebilir bir yöntem göstermektedir. tekrarlanabilirlik için, adım açıklama ve bu çalışmada açıklanmayan diğer türlerde uygulamalar için potansiyel modifikasyonlarla detaylı adım sunuyoruz. Ayrıca, en iyi işlev ve sınırlamaları için prosedürün avantajları, ön koşulları tartışır. Şu anda, boyama yöntemlerinin bir takım kas lifi popü...

İskelet kası bileşim, yaşlanma, 1, 2, egzersiz, 3, 4, 5, 6, 7 ya da böyle bir hastalık 8, 9, 10 ya da travma 11 olarak patofizyolojik işlemler gibi fizyolojik süreçlerde önemli değişikliklere uğrar. Dolayısıyla, bu süreçlerin yapısal etkileri konusunda araştırma konsantresi birkaç alanları işlevsel değişiklikleri anlamak için. kas fonksiyonunu belirleyen önemli yönlerinden biri kas liflerinin bileşimdir. Kas lifleri, farklı miyozin ağır zincir (MHC) proteinleri ifade eden ve bu şekilde, 13 yavaş, orta ya da hızlı lifler 7, 12 sınıflandırılır </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Fizyolojik olarak, kaslar vücutta işlev bağlı olarak farklı kas lifi bileşimleri vardır. Kas lifi yazmaya kullanılarak, lif popülasyonları, 17, fizyolojik veya patofizyolojik süreçler 7 uyarlanmasına belirlemek için ölçülebilir. Tarihsel olarak, zaman alıcı bir dizi yöntem kas lifi tipleri arasında ayırt etmek için uygulanmıştır. Bu amaç için, kas lifleri çeşitli pH seviyelerinde veya kas enzim aktivitesinin de myosin ATPase reaktifliğinden olarak sınıflandırıldı. Farklı lif kalitesi tek bir bölümü tespit edilemedi, birden çok enine kesitleri, tüm kas lifleri tespit ve miktar 14, 16, 17 kılavuzu izin vermek için gerekli olduğunu,= &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. Buna karşılık, yeni yayınlar hızla tek kesitlerinde çok liflerini boyamak için miyozin ağır zincir proteine ​​karşı immünohistokimya (IHC) kullanılabilir. Bu prosedürün avantajları dayanarak, şimdi kas lifi nüfus analizi 19, 23, 24 altın standart olarak kabul edilir. geliştirilmiş IHC boyama protokolleri kullanarak, tüm kas kesitleri ve daha sonra otomatik bir kas lifi miktar tam otomatik satın açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak uygulanabilir olduğunu göstermek için yakın zamanda mümkün. Kılavuzu ölçümü ile karşılaştırıldığında, prosedür 4 ±% olurken slayt başına gereken süre (kılavuzun yaklaşık% 10 analizleri) önemli bir azalma sağlanmaktadır 25 </s&gt; Yukarı. Bu yöntemin genel amacı, bir açık kaynak platformu kullanılarak bütün sıçan kaslarda otomatik kas lifi ölçümü için hızlı, güvenilir ve kullanıcıdan bağımsız kılavuzunun tanımlamaktır. Buna ek olarak, özellikle fareler veya insan kas gibi diğer numuneler için kullanılmalarını sağlayan potansiyel değişiklikleri tarif eder.

<table><tbody><tr><td>OCT bileşiği</td><td>Tissue-Tek, Sakura, Hollanda Kas</td><td></td><td>dokusunun gömülmesi için</td></tr><tr><td>Kas dokusunun yeterli dondurulması için</td><td>İzopentan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus slaytlar</td><td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>1014356190</td><td>yapışkan slaytlar</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>85112</td><td>Deterjan Çözündürme</td></tr><tr><td>Keçi serumu</td><td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>50197Z</td><td>Keçi Serumu</td></tr><tr><td>DAKO Floresan Montaj Ortamı</td><td>Dako Danimarka</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dako kalem</td><td>Dako Danimarka</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Viyana, Avusturya</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Birincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB, Iowa, ABD)</td><td></td><td>Süpernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB, Iowa, ABD)</td><td></td><td>Süpernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB, Iowa, ABD)</td><td></td><td>Süpernatant</td></tr><tr><td><güçlü>İkincil antikorlar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; Flor&nbsp; 633&nbsp; Keçi Anti-Fare IgG2b&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Keçi Anti-Fare IgG1&nbsp;( &gama; 1)</td> <td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Keçi Anti-Fare IgM (& mikro; zincir)</td> <td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Sabit Hücreli ReadyProbes Reaktif</td><td>Thermo Scientific, Almanya</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

miyosin ağır zincir İmünohistokimya kullanma sıçan kas Çapraz bölüm kas elyaf nüfus analizi İçin hızlı otomatik protokolü

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

kas lifi popülasyonlarının miktarının belirlenmesi hastalık, travma ve iskelet kas bileşimine çeşitli diğer etkilerden daha derin bir fikir verir. Çeşitli zaman alıcı yöntemler geleneksel olarak araştırmanın pek çok alanında fiber popülasyonları incelemek için kullanılmıştır. Ancak, son zamanlarda tek bir bölümünde birden çok elyaf tiplerini belirlemek için pratik bir alternatif temin miyozin ağır zincir protein ifadesine dayalı immünohistokimyasal yöntemleri geliştirilmiştir. Burada, bütün kesit ve ImageJ fiber popülasyonlarının otomatik ölçümü otomatik olarak alınmasının sağlayan, geliştirilmiş boyama kalitesi için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol mevcut. Bu amaç için, gömülü iskelet kasları hücrelerinin çekirdekleri boyama ikincil floresan antikor ve DAPI ile miyozin ağır zincir antikorlar kullanılarak boyanmış, kesitler kesilir. Tüm çapraz Kesitler daha sonra yüksek çözünürlüklü bir kompozit elde etmek için bir kayar tarayıcı kullanarak otomatik olarak taranırtüm örneğin resimler. Lif nüfus analizleri sonradan ImageJ için otomatik bir makro kullanarak, yavaş, orta ve hızlı lifleri ölçmek için yapılır. Daha önce bu yöntem ±% 4 bir dereceye kadar güvenli bir elyaf popülasyonlarının belirlenmesi göstermiştir. Buna ek olarak, bu yöntem arası kullanıcı değişkenliği ve önemli ölçüde açık kaynak platformu ImageJ kullanılarak analiz başına süresini azaltır.

Tüm fare kas kesitleri, MHC I, IIA ve IIB&#39;nin kas lifleri tespit etmek immünohistokimya kullanılarak hızlı bir şekilde boyanmıştır. Bir floresan mikroskop lamı tarayıcı kullanarak, tüm kesitler daha sonra otomatik olarak otomatik kas lifi amacıyla elde edilen ImageJ ile analiz eder. usul kavramı kas liflerinin miktarının belirlenmesi için basit, güvenilir ve zaman tasarrufu sağlayan bir iş akışı sağlayan dayanır. Daha önce...

Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Bu yöntemin genel amacı, açık kaynaklı bir platform kullanarak tüm sıçan kaslarındaki kas lifi miktarının belirlenmesini otomatik ve kullanıcıdan bağımsız bir şekilde, hızlı ve güvenilir olarak gerçekleştirmektir. Bu yöntem, iskelet kaslarındaki yaşlanma, hastalık veya travma kaynaklı kusurlarla ilgili nöromüsküler alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kas lifi popülasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz etmek ve kas enine kesitlerinin yüksek kaliteli görüntülerini oluşturmak için kullanılabilmesidir.Yeterince çözündükten sonra, numuneleri Triton X takviyeli PBS veya PBST ile bir kez 10 dakika ve bir kez beş dakika boyunca dikkatlice yıkayın. İkinci yıkamanın ardından, kesitleri iki dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Daha sonra, her bir enine kesitin etrafını çevrelemek için hidrofobik bir kalem kullanın.15 dakikalık başka bir havada kurutma işleminin ardından, oda sıcaklığında bir saat boyunca keçi serumu ile desteklenmiş PBST kullanarak spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin. Ardından, lamları yıkayın ve ışıktan korunmuş oda sıcaklığında bir saatlik boyama için her örneğe uygun birincil antikor kokteylini ekleyin. İnkübasyonun sonunda, lamları bir kez 10 dakika ve bir kez beş dakika PBST ile yıkayarak durulayın.Ardından, kas kesitlerini uygun ikincil antikor kokteyli ile ışıktan koruyarak bir saat boyunca işaretleyin. Lamları gösterildiği gibi iki kez PBST ile yıkadıktan sonra, lamları kurulayın ve ardından çekirdekleri üretici talimatlarına uygun olarak bir DAPI çekirdek boyama kiti ile boyayın. Fazla DAPI'yi bir dakikalık PBST yıkama ile uzaklaştırın ve ardından lamları kısa süre havada kurutun.Ardından, örnekleri floresan montaj medyumu ve lamel ile kapatın ve lamları dört °C'de, ışıktan korunacak şekilde saklayın. Boyamadan sonraki 24 ila 48 saat içinde lamları bir lam tarayıcıya yerleştirin ve program yazılımında yeni bir proje açın. Lam önizlemesi için DAPI kanalını ve 2.5x lensini seçin ve ilk örneğe manuel olarak odaklanın.Detaylı görüntüleme işlemi için dahil edilmesi gereken her bir kesiti belirleyin ve her kanal için pozlama sürelerini ayarlayın. Otomatik sürecin başında hatalı bir görüntüleme yapılmasını önlemek amacıyla, ilk görüş alanının doğru şekilde alındığını kontrol ederek otomatik görüntüleme işlemini başlatın. Görüntüleme tamamlandığında, kesitlerin otomatik odağının doğru olduğunu ve münferit fiberlerin net bir şekilde ayırt edilebildiğini manuel olarak kontrol edin.Her görüntü için otofokusun kontrol edilmesi ve gerektiğinde manuel olarak düzeltilmesi kritik öneme sahiptir. Otomatik kas lifi kantifikasyon süreci, optimal sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli görüntüler gerektirir. Ardından, final analizlerine dahil edilecek her bir kesit için, DAPI hariç her kanalı ayrı ayrı JPEG dosyaları olarak dışa aktarın ve dosyaları pozlanan kanallara göre uygun şekilde adlandırılmış klasörlere isimlendirip sıralayın.Kas lifi sayım işlemine başlamadan önce, boyanmış lifler ile arka plan arasında yeterli kontrast olduğundan emin olmak için her görüntüyü uygun bir görüntü düzenleme yazılımında önizleyin. Ardından, ImageJ'de makro kaynak kodunu görüntülemek için Plugins>Macros>Edit komutunu kullanın ve makronun kaynak kodundaki her kanal için klasör dizinini değiştirin. Şimdi, makroyu başlatmak için Run komutunu kullanın.Klasördeki tüm görüntüler makroya yüklenecek ve ardışık bir sırayla nicelleştirilecektir. Nicelleştirme işleminin sonunda, sonuçları uygun bir hesap tablosu yazılımına aktarın ve pozitif sayılan yavaş, orta ve hızlı liflerin değerlerini belirleyin. Ardından toplam lif sayısı hesaplanabilir.Kas liflerinin immunofloresan boyaması, düşük çapraz reaktivite ile hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve elde edilen görüntüler, boyanmış lifler ile çevre doku arasında yüksek bir kontrastın yanı sıra farklı lif tipleri arasında güçlü bir ayrım sergiler. Otomatik analiz, manuel analizle karşılaştırıldığında göreli kas lifi popülasyonlarının artı veya eksi %4'lük bir doğrulukla tespit edilmesine olanak tanır ve genel mutlak sayımlar manuel analize göre daha yüksektir. Bununla birlikte, göreli sayımlar artı veya eksi %4'lük bir aralıkta benzer kalmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, kas lifi kantifikasyonunu otomatikleştirmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. DAPI ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, boyama işlemini gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipman kullanın.

a-rapid-automated-protocol-for-muscle-fiber-population-analysis-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.

Minimal invaziv kas (MIME) katıştırma - donör-Hücre-aracılı Myogenesis kolaylaştırmak için yeni bir deneysel teknik

İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of--art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.

Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi

Bu protokol, Fibro-adipojenik progenitörleri (FAP'ler) ve miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) sıçan iskelet kasından izole etmek için bir yöntemi özetlemektedir. Sıçanın kas yaralanması modellerinde kullanılması, analiz için atrofik kastan doku mevcudiyetinin artmasını ve serbest hareket eden hayvanlarda kas gücünü ve yürüyüşlerini değerlendirmek için doğrulanmış yöntemlerden oluşan daha büyük bir repertuar sağlar.

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Nöromüsküler kavşak bileşenlerini doğru bir şekilde tespit edebilme yeteneği, patolojik veya gelişimsel süreçler nedeniyle mimarisindeki değişikliklerin değerlendirilmesinde çok önemlidir. Burada, nicel ölçümler yapmak için kullanılabilecek tam montajlı nöromüsküler kavşakların yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek için basit bir yöntemin tam bir açıklamasını sunuyoruz.

Tüm Mount Nöromüsküler Kavşakların İmmünofluoresan ve Morfometrik Analizleri için Tek İskelet Kas Liflerinin Diseksiyonu

Bu protokol, SMA ve ColQ ile ilişkili CMS'nin fare modellerindeki patolojik değişiklikleri ölçmek için kullanılan kombine konfokal ve STED mikroskopisi ile nöromüsküler kavşakların morfometrik analizi için bir yöntemi açıklamaktadır.

Farelerde Nöromüsküler Kavşakların Kombine Konfokal ve Süper Redüksiyonlu Mikroskopi ile Karakterizasyonu

Artan kanıtlar, iskelet kası içindeki lipitlerin aşırı infiltrasyonunun lipotoksisite ve diyabet ile sonuçlandığını göstermektedir. Burada, lipit damlacıklarının boyutunu, yoğunluğunu ve hücre altı dağılımını lif tipine özgü bir şekilde ölçmek için doku işleme, Bodipy ile boyama, görüntü elde etme ve analiz dahil olmak üzere eksiksiz bir protokol sunuyoruz.

İskelet Kasında Lipid Damlacık İçeriğinin Lif Tipi ve Subhücresel-Spesifik Analizi

Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

Burada, mitokondriyal ağ taraması için konfokal mikroskopi kullanarak canlı iskelet kası görüntüleme ile mitokondriyal yoğunluk ve uzunlamasına dağılımdaki değişiklikleri analiz etmek için bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Canlı İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Yoğunluk ve Boyuna Dağılımın Konfokal Mikroskopi ile Analizi

Yetişkin farelerin altı kasından farklı uzunluk ve tiplerde enzimatik olarak ayrışmış lifler elde etmek için bir protokol tarif ediyoruz: bunlardan üçü daha önce tarif edildi (fleksör digitorum brevis, ekstansör digitorum longus, soleus) ve üçü ilk kez başarılı bir şekilde ayrıştı (ekstansör hallusis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Farelerin Altı Arka Bacak Kasının Enzimatik Ayrışmasıyla Elde Edilen Sağlam Kısa, Orta ve Uzun İskelet Kası Lifleri: Fleksör Digitorum Brevis'in Ötesinde

Burada, insan veya fare kasından taze geçirgen iskelet kası liflerinde mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ölçmek için kapsamlı bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, mevcut mitokondriyal ağları ve membran bütünlüğünü korurken mitokondriyal solunumun gerçek zamanlı olarak ölçülmesine ve yakıt tercihinin ve metabolik esnekliğin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan ve Fare İskelet Kası Liflerinde Mitokondriyal Solunumun Yüksek Çözünürlüklü Respirometri ile Ölçülmesi

Bu protokol, oksidatif soleus'tan sağlam tek kas liflerinin izole edilmesini ve bu liflerden türetilen yüksek saf miyoblast kültürlerinin oluşturulmasını açıklar. Optimize edilmiş prosedür, fare başına yaklaşık 300–500 sağlam miyofiber elde ederek sonraki moleküler ve hücresel analizleri mümkün kılar.

Oksidatif Miyofiber Davranışının Değerlendirilmesi İçin Tek Lifli İzolasyon Testi

Öğrenin, sıçan iskelet kası kesitlerinde miyozin ağır zincir immünohistokimyası ve ImageJ kullanarak kas lifi popülasyonlarını otomatik ve kullanıcıdan bağımsız olarak hızlıca nicelendirmeyi. Bu yöntem, yaşlanma, hastalık veya travmanın kas kompozisyonu üzerindeki etkilerini araştırmak için uygundur.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Daha fazla video keşfet