Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü
28 Mart 2017
Burada, geliştirilmiş boyama kalitesini ve böylece otomatik satın alma ve serbestçe yazılım ImageJ kullanılarak fiber popülasyonları ölçümü sağlar hızlı kas lifi analiz için bir protokol mevcut.
Bu yöntemin genel amacı, açık kaynaklı bir platform kullanarak tüm sıçan kaslarındaki kas lifi miktarının belirlenmesini otomatik ve kullanıcıdan bağımsız bir şekilde, hızlı ve güvenilir olarak gerçekleştirmektir. Bu yöntem, iskelet kaslarındaki yaşlanma, hastalık veya travma kaynaklı kusurlarla ilgili nöromüsküler alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kas lifi popülasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz etmek ve kas enine kesitlerinin yüksek kaliteli görüntülerini oluşturmak için kullanılabilmesidir.
Yeterince çözündükten sonra, numuneleri Triton X takviyeli PBS veya PBST ile bir kez 10 dakika ve bir kez beş dakika boyunca dikkatlice yıkayın. İkinci yıkamanın ardından, kesitleri iki dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Daha sonra, her bir enine kesitin etrafını çevrelemek için hidrofobik bir kalem kullanın.
15 dakikalık başka bir havada kurutma işleminin ardından, oda sıcaklığında bir saat boyunca keçi serumu ile desteklenmiş PBST kullanarak spesifik olmayan bağlanmaları bloke edin. Ardından, lamları yıkayın ve ışıktan korunmuş oda sıcaklığında bir saatlik boyama için her örneğe uygun birincil antikor kokteylini ekleyin. İnkübasyonun sonunda, lamları bir kez 10 dakika ve bir kez beş dakika PBST ile yıkayarak durulayın.
Ardından, kas kesitlerini uygun ikincil antikor kokteyli ile ışıktan koruyarak bir saat boyunca işaretleyin. Lamları gösterildiği gibi iki kez PBST ile yıkadıktan sonra, lamları kurulayın ve ardından çekirdekleri üretici talimatlarına uygun olarak bir DAPI çekirdek boyama kiti ile boyayın. Fazla DAPI'yi bir dakikalık PBST yıkama ile uzaklaştırın ve ardından lamları kısa süre havada kurutun.
Ardından, örnekleri floresan montaj medyumu ve lamel ile kapatın ve lamları dört °C'de, ışıktan korunacak şekilde saklayın. Boyamadan sonraki 24 ila 48 saat içinde lamları bir lam tarayıcıya yerleştirin ve program yazılımında yeni bir proje açın. Lam önizlemesi için DAPI kanalını ve 2.5x lensini seçin ve ilk örneğe manuel olarak odaklanın.
Detaylı görüntüleme işlemi için dahil edilmesi gereken her bir kesiti belirleyin ve her kanal için pozlama sürelerini ayarlayın. Otomatik sürecin başında hatalı bir görüntüleme yapılmasını önlemek amacıyla, ilk görüş alanının doğru şekilde alındığını kontrol ederek otomatik görüntüleme işlemini başlatın. Görüntüleme tamamlandığında, kesitlerin otomatik odağının doğru olduğunu ve münferit fiberlerin net bir şekilde ayırt edilebildiğini manuel olarak kontrol edin.
Her görüntü için otofokusun kontrol edilmesi ve gerektiğinde manuel olarak düzeltilmesi kritik öneme sahiptir. Otomatik kas lifi kantifikasyon süreci, optimal sonuçlar elde etmek için yüksek kaliteli görüntüler gerektirir. Ardından, final analizlerine dahil edilecek her bir kesit için, DAPI hariç her kanalı ayrı ayrı JPEG dosyaları olarak dışa aktarın ve dosyaları pozlanan kanallara göre uygun şekilde adlandırılmış klasörlere isimlendirip sıralayın.
Kas lifi sayım işlemine başlamadan önce, boyanmış lifler ile arka plan arasında yeterli kontrast olduğundan emin olmak için her görüntüyü uygun bir görüntü düzenleme yazılımında önizleyin. Ardından, ImageJ'de makro kaynak kodunu görüntülemek için Plugins>Macros>Edit komutunu kullanın ve makronun kaynak kodundaki her kanal için klasör dizinini değiştirin. Şimdi, makroyu başlatmak için Run komutunu kullanın.
Klasördeki tüm görüntüler makroya yüklenecek ve ardışık bir sırayla nicelleştirilecektir. Nicelleştirme işleminin sonunda, sonuçları uygun bir hesap tablosu yazılımına aktarın ve pozitif sayılan yavaş, orta ve hızlı liflerin değerlerini belirleyin. Ardından toplam lif sayısı hesaplanabilir.
Kas liflerinin immunofloresan boyaması, düşük çapraz reaktivite ile hızlı bir şekilde gerçekleştirilir ve elde edilen görüntüler, boyanmış lifler ile çevre doku arasında yüksek bir kontrastın yanı sıra farklı lif tipleri arasında güçlü bir ayrım sergiler. Otomatik analiz, manuel analizle karşılaştırıldığında göreli kas lifi popülasyonlarının artı veya eksi %4'lük bir doğrulukla tespit edilmesine olanak tanır ve genel mutlak sayımlar manuel analize göre daha yüksektir. Bununla birlikte, göreli sayımlar artı veya eksi %4'lük bir aralıkta benzer kalmaktadır.
Bu videoyu izledikten sonra, kas lifi kantifikasyonunu otomatikleştirmek için bu yöntemin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. DAPI ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, boyama işlemini gerçekleştirirken uygun koruyucu ekipman kullanın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, tüm sırt kası kesitlerindeki kas lifi popülasyonlarının otomatik olarak nicelendirilmesi için hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Miyozin ağır zincir izoformları için immünohistokimyasal boyama ve ImageJ ile otomatik görüntü analizi kullanan bu yöntem; yavaş, ara ve hızlı kas liflerinin yüksek kapasiteli ve kullanıcıdan bağımsız şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak analiz süresini ve kullanıcılar arası değişkenliği önemli ölçüde azaltmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kas biyolojisi
- Histoloji
- İmmünohistokimya
- Görüntü analizi
Arka Plan
- Kas lif kompozisyonu hastalıklar, travmalar ve yaşlanmadan etkilenir.
- Lif tiplendirme için kullanılan geleneksel yöntemler zaman alıcıdır ve yoğun emek gerektirir.
- Miyozin ağır zincir izoformları için yapılan immünohistokimyasal boyama, tek bir kesitte birden fazla lif tipinin tanımlanmasına olanak tanır.
- Otomatik görüntü analizi, kas lif popülasyonlarının miktar tayininde tekrarlanabilirliği ve verimliliği artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Kas lifi sayımı için hızlı ve güvenilir bir protokol geliştirmek ve göstermek.
- Tüm kas kesitlerinin otomatik ve kullanıcıdan bağımsız analizini sağlamak.
- Açık kaynaklı araçlar kullanarak analiz süresini ve kullanıcılar arası değişkenliği azaltmak.
Kullanılan Yöntemler
- Gömülü iskelet kası örneklerinin hazırlanması ve kesilmesi.
- Miyozin ağır zincire özgü primer antikorlar, floresan sekonder antikorlar ve nükleer boyama için DAPI kullanılarak immünofloresan boyama yapılması.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için tüm kesitlerin bir lam tarayıcı ile otomatik olarak taranması.
- ImageJ'de özel bir makro kullanılarak lif popülasyonlarının otomatik kantifikasyonu, ardından verilerin dışa aktarılması ve analizi.
Ana Sonuçlar
- Protokol, fiber türleri arasında net bir ayrım sağlayan yüksek kontrastlı ve yüksek kaliteli görüntüler üretir.
- Otomatik analiz, manuel analize kıyasla ±4% doğrulukla göreceli kas fiber popülasyonlarını tespit eder.
- Mutlak fiber sayıları otomatik analizle daha yüksektir, ancak göreceli oranlar tutarlı kalmaktadır.
- Bu yöntem, analiz süresini ve kullanıcılar arası değişkenliği önemli ölçüde azaltır.
Sonuçlar
- Bu protokol, tüm kas kesitlerindeki kas lifi tiplerinin hızlı, tekrarlanabilir ve doğru bir şekilde nicelendirilmesini sağlar.
- ImageJ kullanılarak yapılan otomatik analiz, büyük ölçekli çalışmalar için etkilidir ve kullanıcı yanlılığını minimize eder.
- Yöntem; hastalık, travma veya yaşlanmaya bağlı kas bileşimi değişikliklerini araştırmak için uygundur.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Miyozin ağır zincir immünohistokimyası kullanılarak kas lifi popülasyonlarının otomatik nicelleştirilmesi, preklinik araştırmalarda tekrarlanabilir, yüksek kapasiteli doku fenotipleme ihtiyacını karşılamaktadır. Bu protokol, kullanıcılar arası değişkenliği azaltarak veri üretimini hızlandırır; nöromüsküler ve muskuloskeletal ilaç keşif süreçlerinde sağlam hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Bu yaklaşım; hastalığa, travmaya veya terapötik müdahaleye yanıt olarak gelişen doku yeniden şekillenmesinin ölçeklenebilir, kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak temel keşif kırılma noktalarındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalık mekanizmalarını ve terapötik hipotezleri açıklığa kavuşturmak için kas lif kompozisyonunun kantitatif sorgulanmasını sağlar.
- Tüm doku kesitlerindeki yavaş, orta ve hızlı lif popülasyonlarını ayırt ederek fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Standartlaştırılmış, otomatik analiz iş akışları aracılığıyla mekanistik belirsizliği azaltır.
- Tekrarlanabilir, kantitatif doku fenotipleme verileri sağlayarak portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Aday bileşiklerin veya müdahalelerin alt etkileşim taramaları için doğrulanmış doku kesitlerini hazırlar.
- Açık kaynaklı ImageJ makroları kullanarak, kullanıcıdan bağımsız otomatik kantifikasyon ile analiz çıktılarını standartlaştırır.
- Güvenilir bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir, yüksek kontrastlı görüntüleme ve fiber tipi ayrımı sağlar.
- Birden fazla çalışma ve araştırma ekibi genelinde ölenebilirliği ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel biyobelirteç geliştirme için doku düzeyindeki fenotiplemeyi hastalıkla ilgili son noktalarla ilişkilendirir.
- Tutarlı ve kantitatif okumalar sağlayarak erken keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar sürekliliği sağlar.
- Kas yeniden şekillenmesi üzerine çalışmalar arası karşılaştırılabilir ve güvenilir veriler sunarak ilerleme kararlarındaki riskleri azaltır.
- Hastalık, travma veya yaşlanma modellerinde terapötik etkinliğin öngörü değerini artırır.
İşleme Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu protokol, erken dönem mekanistik çalışmalardan aday ilaç tanımlamaya ve preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine entegre edilerek, doku fenotipleme için yeniden kullanılabilir bir platform sunmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Deneysel değişkenlere yanıt olarak gelişen fiber tipi değişimlerini nicelleştirerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Bileşik veya müdahale değerlendirmesi için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir analiz çıktıları sunar.
- Analitik: Fiber popülasyonları hakkında nicel, hesap tablosuna uygun veriler sağlayarak koşullar arasında istatistiksel karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Doku kompozisyonundaki değişiklikleri hastalık veya terapötik yanıtla ilişkilendirerek biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Araştırma programları ve model sistemler genelinde uyarlanabilir, ölçeklenebilir ve açık kaynaklı bir iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Doku düzeyindeki çalışmalarda öngörü güvenini artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Nicelendirmeyi standartlaştırır ve otomatikleştirir, kullanıcı yanlılığını ve manuel iş yükünü minimize eder.
- Stratejik Değer: Daha bilinçli devam/durdur kararlarına ve sermaye açısından verimli portföy yönetimine olanak tanır.
- Portföy Etkisi: Nöromüsküler ve kas-iskelet programlarının risk ayarlı önceliklendirmesini ve ilerletilmesini destekler.
Uygulama Hususları
- İmmünohistokimya ve dijital görüntü analizi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Slayt tarama cihazlarına ve açık kaynaklı ImageJ yazılımına erişim gereklidir.
- Boyama, görüntüleme ve analiz protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Çeşitli kas modellerine uyarlanabilir ancak antikor özgüllüğüne ve görüntüleme kalitesine bağlıdır.
- Optimal otomatik analiz için görüntü alımının manuel kalite kontrolü kritik önemini korumaktadır.
