Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Bu prosedürün genel amacı, karaciğer gibi diyete bağlı iltihaplanmadan yaygın olarak etkilenen dokulardan makrofajları etkili bir şekilde izole etmek ve karakterize etmektir. Bu yöntem, dokuda yerleşik makrofaj fenotipinin kronik enflamatuar hastalıkların ilerlemesini nasıl belirleyebileceğine dair immünoloji ve inflamasyon alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bunun ana avantajı, prosedürün, obezite aracılı düşük dereceli kronik inflamasyondan etkilenen dokulardan türetilen tek hücreli süspansiyonları elde etmek için gereken izolasyon adımlarını optimize etmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Joselyn Allen olacak. Karaciğeri izole etmek için, önce etanole batırılmış bir fareyi sırtüstü pozisyonda bir polistiren köpük diseksiyon tahtası üzerine yerleştirin ve ön ve arka pençeleri sabitleyin. Daha sonra, üretra açıklığının yakınındaki karın derisini kavramak için orta nokta uçlu bir forseps kullanın ve yükseltilmiş deride küçük bir kesi oluşturmak için keskin diseksiyon makası kullanın.

Makasın alt bıçağını cilt ile karın zarı arasındaki kesiye sokun ve kasıktan çeneye kadar yanal bir kesi yapın. Sağlam periton boşluğunu ve göğüs duvarını ortaya çıkarmak için cildi nazikçe geri çekin ve periton boyunca yanal bir kesi yapın. Sternumu kaldırın ve diyaframı dikkatlice kesin.

Daha sonra gastrointestinal organları yana doğru hareket ettirin ve subhepatik inferior vena kava veya IVC'yi bulun. Hemostatik forseps kullanarak, lokalize bir perfüzyonu korumak için suprahepatik IVC'yi klempleyin ve önceden ısıtılmış perfüzyon tamponu ile doldurulmuş bir şırıngayı 23 gauge kan alma ve infüzyon setine takın. Boru ve iğne perfüzyon tamponu ile dolana kadar pistonu hafifçe bastırın ve iğneyi subhepatik IVC'ye paralel olarak yerleştirin.

IVC'nin uygun kanülasyonu, ayrışma tamponunun karaciğer ve periferik dokular boyunca lokal olarak dağılmasını sağlar ve doku sindirimini optimize eder. İğneyi yerine sabitlemek için dört santimetrelik bir hemostatik kelepçe kullanın ve perfüzyonu başlatmak için pistona hafifçe bastırın. İğne uygun şekilde konumlandırılırsa, renk karaciğerden hızla akacak ve loblar genişleyecektir.

Perfüzyon tamponunun karaciğerden serbestçe akmasına izin vermek için portal veni derhal kesin, bazen kanın alınmasını kolaylaştırmak için başparmak ve işaret parmağı arasındaki loblara hafifçe masaj yapın. Sadece beş mililitre perfüzyon tamponu kaldığında, perfüzyon tamponu şırıngasını önceden ısıtılmış ayrışma tamponu ile doldurulmuş bir şırınga ile değiştirin, loblara hafifçe masaj yapmaya ve tamamen solana kadar karaciğeri perfüze etmeye devam edin. Bir çift forsepsin künt kenarını sol lateral lobun içine hafifçe bastırarak başarılı bir sindirimi onaylayın.

Forseps çıkarıldıktan sonra yavaşça dolan yüzeyde bir girinti görünmelidir. Daha sonra iğneyi çıkarın ve tüm karaciğeri ve safra kesesini çıkarmak için bağlantı bağlarını dikkatlice kesmek için bir çift diseksiyon makasından kısa bir düz bıçak kullanın. Karaciğeri 10 mililitre buz gibi soğuk DMEM içeren 10 santimetrelik bir tabağa aktarın ve kopmuş suprahepatik IVC'yi kavramak için dişli forseps kullanın.

Orta nokta forseps kullanarak, hücreleri Glisson Kapsülünden serbest bırakmak için her loba hızlı bir vuruş hareketi uygulayın ve doymuş DMEM'i buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpte 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Yüksek canlı hücre verimleri ancak karaciğer hücrelerinin Glisson Kapsülü'nden uygun şekilde ayrılmasıyla elde edilebilir. Tüm hücreler toplandığında, hücre süspansiyonunu nazikçe karıştırmak için tüpü ters çevirin ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin.

Üç tane daha düşük dönüşlü santrifüjleme için süpernatanı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Son santrifüjlemeden sonra, süpernatanı 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri daha yüksek bir hızda bir kez daha santrifüjleyin. Daha sonra, parankimal olmayan hücre peletini sayım için FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve karaciğer hücrelerini, etiketli beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren tüplerdeki aşağı akış uygulamalarına göre uygun konsantrasyona seyreltin.

Yüksek yağlı bir diyet veya yüksek yağlı yüksek kolesterol diyeti ile beslenen fareler, aort gibi etkilenen dokularda klasik olarak aktive edilmiş M1 makrofajlarının infiltrasyonunda artış gösterir. Yüksek yağlı yüksek kolesterol ile beslenen farelerde antiinflamatuar fenotip gösteren RON reseptörü CD45 pozitif F4/80 pozitif makrofajlar azalırken, bu hayvanlardan izole edilen aortlarda proinflamatuar CD45 pozitif F4/80 pozitif CD11c pozitif makrofajlar artan sayıda bulunur. Ayrıca, sindirilmiş aortlardan türetilen makrofajları eksprese eden sıralanmış RON reseptörü, iyi bilinen bir M2 makrofaj belirteci olan Arginaz 1 geninin artmış bir ekspresyonunu gösterir.

Gerçekten de, karaciğerde yerleşik makrofajların karakterizasyonu, anti-inflamatuar M2 fenotipi ile güçlü bir şekilde ilişkili genlerin azalmış ekspresyonunu gösteren CD11c pozitif proinflamatuar makrofaj popülasyonları ile alt popülasyonları eksprese eden RON reseptörünün hakim fenotipini ortaya koymaktadır. Sindirilmiş beyaz yağ dokusundan izole edilen makrofaj popülasyonlarında, RON reseptörünün azalmış yüzey ekspresyonunu sergileyen proinflamatuar fenotip makrofaj popülasyonlarında da benzer eğilimler gözlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa hayvan başına 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, izole karaciğer kaynaklı dokuda yerleşik makrofajların fenotipini daha fazla karakterize etmek için akış sitometrisi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması ve/veya kantitatif PCR gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, dokuda yerleşik makrofajları hastalıklı karaciğerlerden nasıl düzgün bir şekilde izole edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.