Mikrodizilerle İfade Profili Oluşturma
Mikrodiziler, gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için önemli araçlardır ve cam çiplere bağlı problar ile numunelerden türetilen nükleik asitler ara…
DNA mikrodizileri, birçok farklı genin ekspresyonunu aynı anda ölçmek için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Her biri farklı bir geni temsil eden, "çipler" veya slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş binlerce probdan oluşurlar ve farklı biyolojik koşullarda gen ekspresyonunu değerlendirmek için tamamlayıcı hibridizasyona güvenirler.
Bu video, mikroarray teknolojisinin temel ilkelerini, mikrodizileri kullanarak gen ekspresyon profili oluşturma protokolünü ve bazı güncel uygulamaları kapsayacaktır.
Gen ekspresyon profili oluşturma ve mikroarray teknolojisinin ilkelerini tartışarak başlayalım.
Biyolojik örneklerde gen ekspresyonunu değerlendirmek için geliştirilen en eski yöntemlerden biri, zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş spesifik RNA molekülleri için "sondalamayı" içeren Northern blotlamadır. "Serbest yüzen" problar, numunedeki tamamlayıcı RNA dizilerini tanır ve tipik olarak görselleştirilebilmeleri için radyoaktif veya floresan moleküllerle etiketlenir.
Mikrofabrikasyon, genom dizileme ve diğer teknolojilerdeki ilerlemeler, mikrodizi biyoçipinin geliştirilmesine yol açmıştır. Northern lekeleri gibi, mikrodiziler de prob ve numune nükleik asit dizileri arasında tamamlayıcı bağlanma ilkesine dayanır. Bununla birlikte, Kuzeylilerden farklı olarak, mikrodizilerde, bir cam slayt veya çip üzerinde hareketsiz hale getirilen oligonükleotid problarıdır. "Serbest yüzen" numuneler, ilgili hücrelerden veya organizmalardan izole edilen RNA'dan üretilir ve bu, tamamlayıcı veya "c"-DNA'ya ters kopyalanır. Bu ya doğrudan floresan molekülleri ile etiketlenebilir ya da miktarları, cRNA'ya vitro transkripsiyonu ile daha da amplifiye edilebilir. Numune daha sonra çipe hibritlenir. Farklı uygulamalar için tasarlanmış mikrodiziler üzerindeki problar, dizilerinin bir organizmanın ifade edilen RNA'sı ile aynı yönde olduğu anlamına gelen "duyu" veya "antisens" olabileceğinden, araştırmacılar, numunenin iplik yönlülüğünün problarınkini tamamlayıcı olduğundan emin olmalıdır.
Çip üzerindeki her bir gene özgü nokta için "ham" floresan yoğunluğu verileri daha sonra ölçülebilir ve işlenebilir. Veriler, ilgilenilen bir gen için floresan sinyallerinin ve dolayısıyla ekspresyon seviyelerinin iki hücre tipi veya deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için Student'ın t testi gibi daha ileri istatistiksel testlere tabi tutulabilir.
Araştırmacılar bu verileri, benzer ifade kalıplarına dayalı olarak genleri "kümelemek" veya gruplandırmak için de kullanabilirler. Örneğin, iki hücre popülasyonu arasındaki ekspresyon paternlerini karşılaştırırken, bazı genlerin aynı yönde kabaca eşdeğer miktarlarda ekspresyon değişiklikleri gösterdiği bulunabilir ve bu nedenle birlikte gruplandırılabilir. Araştırmacılar bu ilişkileri, "dalların" yüksekliklerinin ve düzenlemelerinin gen ekspresyon modellerinin ne kadar benzer veya farklı olduğunu gösterdiği bir tür ağaç diyagramı veya "dendrogram" da gösterebilirler. Bu tür bir analiz, "kümelenmiş" genler aynı biyolojik yollara katılabileceğinden, gen ağları hakkında bilgi sağlayabilir.
Mikrodizi metodolojisinin ilkelerini tartıştığımıza göre, şimdi tipik bir mikrodizi deneyine bir göz atalım.
İzole edilen RNA'nın kalitesini sağlamak için, çalışma alanları ve ekipman, RNazları etkisiz hale getiren kimyasallarla (aksi takdirde RNA'yı yok edecek enzimler) tedavi edilmelidir. RNA daha sonra ilgilenilen örneklerden izole edilir ve saflaştırılır ve konsantrasyonu ve bütünlüğü spektrofotometri yoluyla belirlenir.
Bu örnek RNA, cDNA'ya ve ardından cRNA'ya dönüştürülür. Daha sonra, numune floresan molekülleri ile etiketlenir ve parçalanır ve kalitesi ve miktarı tekrar kontrol edilebilir, bu sırada floresan etiketlemenin kapsamı da değerlendirilebilir.
Etiketli cRNA daha sonra bir mikrodiziye yüklenmeden önce "hibridizasyon çözeltisi" ile karıştırılır. Başarılı bir hibridizasyonun üstesinden gelmek için, "hibridizasyon odaları" oluşturmak üzere çip üzerine bir "karıştırıcı" yerleştirilir. Hibridizasyon karışımı daha sonra yavaşça diziye eklenir. Hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterilmelidir, çünkü bunlar numunenin mikrodizi üzerindeki belirli bölgelere bağlanmasını engelleyebilir ve yanlış bir negatif sinyale neden olabilir. Numune eklendikten sonra, cipsler uygun sıcaklıkta 24 saate kadar inkübe edilir.
Hibridizasyondan sonra, karıştırıcı çipten çıkarılır, bağlanmamış numune yıkanır ve dizi, özel, kayar tutma santrifüjünde santrifüjleme ile iyice kurutulur. Kurutulmuş çip bir mikrodizi tarayıcıya yerleştirilir ve makine, bir çip üzerinde gözlemlenen en parlak sinyaller aşırı doygun olmayacak şekilde ayarlanır. Mikrodizi daha sonra taranır ve tüm çipin bir görüntüsü üretilir.
Çip tarandıktan sonra, görüntü dosyası veri çıkarma yazılımına yüklenir ve herhangi bir sinyal düzensizliği açısından değerlendirilir. Mikrodizi görüntüsünden çıkarılan veriler, log2 dönüşümü de dahil olmak üzere bir dizi istatistiksel manipülasyona tabi tutulur, bu da araştırmacıların verileri gen ekspresyonundaki kat artışları veya azalmaları açısından sayısal olarak tasvir etmesine olanak tanır; mikrodizi yongaları arasındaki sinyal farklılıklarını açıklayan normalleştirmenin yanı sıra. Bu işlenen veriler daha sonra daha fazla analiz edilebilir.
Mikrodizilerle ifade profili oluşturmanın nasıl yapıldığını gösterdiğimize göre, mikrodizilerin belirli deneylerde nasıl kullanılabileceğine bakalım.
Araştırmacılar, hücresel farklılaşma gibi biyolojik bir süreç boyunca gen ekspresyonunun nasıl değiştiğini değerlendirmek için genellikle mikrodiziler kullanırlar. Burada bilim adamları, retina gelişiminin farklı aşamalarını temsil eden üç insan hücre tipinde, gen ekspresyonunun ince ayarında yer alan 22 nükleotidli küçük RNA'lar olan mikroRNA'ların seviyelerini değerlendirdiler. Araştırmacılar, bu hücreler arasındaki mikroRNA ekspresyonunu karşılaştırarak, retina dokusu farklılaşması ve gelişiminde potansiyel olarak rol oynayan genleri tanımlayabildiler.
Mikrodiziler, farklı hücreler veya doku türleri arasındaki ifade farklılıklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deneyde, sıçanları elektrik şoklarına maruz bırakarak travma sonrası stres bozukluğu veya TSSB'nin bir kemirgen modeli kuruldu. Beynin farklı bölgelerinden nöronlar toplandı ve RNA izole edildi. Mikrodiziler daha sonra bu nöronlardaki mitokondri ile ilişkili genlerin diferansiyel ekspresyonunu tanımlamak için kullanıldı ve TSSB'nin arkasındaki karmaşık moleküler mekanizmalar hakkında fikir verdi.
Son olarak, araştırmacılar, yeni hastalık biyobelirteçlerinin tanımlanabileceği umuduyla kanser çalışmalarına mikrodiziler de uyguluyorlar. Evrimimiz boyunca virüslerin neden olduğu enfeksiyonların bir sonucu olarak, insan genomları, bazıları hala aktif olarak ifade edilen "endojen retrovirüsler" veya ERV'ler olarak adlandırılan viral genetik diziler içerir. Burada, kanserli ve normal prostat dokularındaki ERV'lerin ekspresyonu mikrodiziler kullanılarak karşılaştırıldı. Bu yöntem, araştırmacıların prostat kanserinde yukarı regüle edilen birkaç ERV'yi belirlemelerine izin verdi ve bu da onları hastalığı teşhis etmek için kullanılabilecek potansiyel biyobelirteçler haline getirdi.
Az önce JoVE'nin mikrodiziler kullanarak gen ekspresyonu profili oluşturma hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, mikroarray teknolojisinin temel ilkelerini, ifade profili oluşturma için bir protokolü ve bu tekniğin uygulamalarını kapsıyordu. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
DNA mikrodizileri, birçok farklı genin ekspresyonunu aynı anda ölçmek için yaygın olarak kullanılan araçlardır. Her biri farklı bir geni temsil eden, "çipler" veya slaytlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş binlerce probdan oluşurlar ve farklı biyolojik koşullarda gen ekspresyonunu değerlendirmek için tamamlayıcı hibridizasyona güvenirler.
Bu video, mikroarray teknolojisinin temel ilkelerini, mikrodizileri kullanarak gen ekspresyon profili oluşturma protokolünü ve bazı güncel uygulamaları kapsayacaktır.
Gen ekspresyon profili oluşturma ve mikroarray teknolojisinin ilkelerini tartışarak başlayalım.
Biyolojik örneklerde gen ekspresyonunu değerlendirmek için geliştirilen en eski yöntemlerden biri, zarlar üzerinde hareketsiz hale getirilmiş spesifik RNA molekülleri için "sondalamayı" içeren Northern blotlamadır. "Serbest yüzen" problar, numunedeki tamamlayıcı RNA dizilerini tanır ve tipik olarak görselleştirilebilmeleri için radyoaktif veya floresan moleküllerle etiketlenir.
Mikrofabrikasyon, genom dizileme ve diğer teknolojilerdeki ilerlemeler, mikrodizi biyoçipinin geliştirilmesine yol açmıştır. Northern lekeleri gibi, mikrodiziler de prob ve numune nükleik asit dizileri arasında tamamlayıcı bağlanma ilkesine dayanır. Bununla birlikte, Kuzeylilerden farklı olarak, mikrodizilerde, bir cam slayt veya çip üzerinde hareketsiz hale getirilen oligonükleotid problarıdır. "Serbest yüzen" numuneler, ilgili hücrelerden veya organizmalardan izole edilen RNA'dan üretilir ve bu, tamamlayıcı veya "c"-DNA'ya ters kopyalanır. Bu ya doğrudan floresan molekülleri ile etiketlenebilir ya da miktarları, cRNA'ya vitro transkripsiyonu ile daha da amplifiye edilebilir. Numune daha sonra çipe hibritlenir. Farklı uygulamalar için tasarlanmış mikrodiziler üzerindeki problar, dizilerinin bir organizmanın ifade edilen RNA'sı ile aynı yönde olduğu anlamına gelen "duyu" veya "antisens" olabileceğinden, araştırmacılar, numunenin iplik yönlülüğünün problarınkini tamamlayıcı olduğundan emin olmalıdır.
Çip üzerindeki her bir gene özgü nokta için "ham" floresan yoğunluğu verileri daha sonra ölçülebilir ve işlenebilir. Veriler, ilgilenilen bir gen için floresan sinyallerinin ve dolayısıyla ekspresyon seviyelerinin iki hücre tipi veya deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklı olup olmadığını belirlemek için Student'ın t testi gibi daha ileri istatistiksel testlere tabi tutulabilir.
Araştırmacılar bu verileri, benzer ifade kalıplarına dayalı olarak genleri "kümelemek" veya gruplandırmak için de kullanabilirler. Örneğin, iki hücre popülasyonu arasındaki ekspresyon paternlerini karşılaştırırken, bazı genlerin aynı yönde kabaca eşdeğer miktarlarda ekspresyon değişiklikleri gösterdiği bulunabilir ve bu nedenle birlikte gruplandırılabilir. Araştırmacılar bu ilişkileri, "dalların" yüksekliklerinin ve düzenlemelerinin gen ekspresyon modellerinin ne kadar benzer veya farklı olduğunu gösterdiği bir tür ağaç diyagramı veya "dendrogram" da gösterebilirler. Bu tür bir analiz, "kümelenmiş" genler aynı biyolojik yollara katılabileceğinden, gen ağları hakkında bilgi sağlayabilir.
Mikrodizi metodolojisinin ilkelerini tartıştığımıza göre, şimdi tipik bir mikrodizi deneyine bir göz atalım.
İzole edilen RNA'nın kalitesini sağlamak için, çalışma alanları ve ekipman, RNazları etkisiz hale getiren kimyasallarla (aksi takdirde RNA'yı yok edecek enzimler) tedavi edilmelidir. RNA daha sonra ilgilenilen örneklerden izole edilir ve saflaştırılır ve konsantrasyonu ve bütünlüğü spektrofotometri yoluyla belirlenir.
Bu örnek RNA, cDNA'ya ve ardından cRNA'ya dönüştürülür. Daha sonra, numune floresan molekülleri ile etiketlenir ve parçalanır ve kalitesi ve miktarı tekrar kontrol edilebilir, bu sırada floresan etiketlemenin kapsamı da değerlendirilebilir.
Etiketli cRNA daha sonra bir mikrodiziye yüklenmeden önce "hibridizasyon çözeltisi" ile karıştırılır. Başarılı bir hibridizasyonun üstesinden gelmek için, "hibridizasyon odaları" oluşturmak üzere çip üzerine bir "karıştırıcı" yerleştirilir. Hibridizasyon karışımı daha sonra yavaşça diziye eklenir. Hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterilmelidir, çünkü bunlar numunenin mikrodizi üzerindeki belirli bölgelere bağlanmasını engelleyebilir ve yanlış bir negatif sinyale neden olabilir. Numune eklendikten sonra, cipsler uygun sıcaklıkta 24 saate kadar inkübe edilir.
Hibridizasyondan sonra, karıştırıcı çipten çıkarılır, bağlanmamış numune yıkanır ve dizi, özel, kayar tutma santrifüjünde santrifüjleme ile iyice kurutulur. Kurutulmuş çip bir mikrodizi tarayıcıya yerleştirilir ve makine, bir çip üzerinde gözlemlenen en parlak sinyaller aşırı doygun olmayacak şekilde ayarlanır. Mikrodizi daha sonra taranır ve tüm çipin bir görüntüsü üretilir.
Çip tarandıktan sonra, görüntü dosyası veri çıkarma yazılımına yüklenir ve herhangi bir sinyal düzensizliği açısından değerlendirilir. Mikrodizi görüntüsünden çıkarılan veriler, log2 dönüşümü de dahil olmak üzere bir dizi istatistiksel manipülasyona tabi tutulur, bu da araştırmacıların verileri gen ekspresyonundaki kat artışları veya azalmaları açısından sayısal olarak tasvir etmesine olanak tanır; mikrodizi yongaları arasındaki sinyal farklılıklarını açıklayan normalleştirmenin yanı sıra. Bu işlenen veriler daha sonra daha fazla analiz edilebilir.
Mikrodizilerle ifade profili oluşturmanın nasıl yapıldığını gösterdiğimize göre, mikrodizilerin belirli deneylerde nasıl kullanılabileceğine bakalım.
Araştırmacılar, hücresel farklılaşma gibi biyolojik bir süreç boyunca gen ekspresyonunun nasıl değiştiğini değerlendirmek için genellikle mikrodiziler kullanırlar. Burada bilim adamları, retina gelişiminin farklı aşamalarını temsil eden üç insan hücre tipinde, gen ekspresyonunun ince ayarında yer alan 22 nükleotidli küçük RNA'lar olan mikroRNA'ların seviyelerini değerlendirdiler. Araştırmacılar, bu hücreler arasındaki mikroRNA ekspresyonunu karşılaştırarak, retina dokusu farklılaşması ve gelişiminde potansiyel olarak rol oynayan genleri tanımlayabildiler.
Mikrodiziler, farklı hücreler veya doku türleri arasındaki ifade farklılıklarını değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu deneyde, sıçanları elektrik şoklarına maruz bırakarak travma sonrası stres bozukluğu veya TSSB'nin bir kemirgen modeli kuruldu. Beynin farklı bölgelerinden nöronlar toplandı ve RNA izole edildi. Mikrodiziler daha sonra bu nöronlardaki mitokondri ile ilişkili genlerin diferansiyel ekspresyonunu tanımlamak için kullanıldı ve TSSB'nin arkasındaki karmaşık moleküler mekanizmalar hakkında fikir verdi.
Son olarak, araştırmacılar, yeni hastalık biyobelirteçlerinin tanımlanabileceği umuduyla kanser çalışmalarına mikrodiziler de uyguluyorlar. Evrimimiz boyunca virüslerin neden olduğu enfeksiyonların bir sonucu olarak, insan genomları, bazıları hala aktif olarak ifade edilen "endojen retrovirüsler" veya ERV'ler olarak adlandırılan viral genetik diziler içerir. Burada, kanserli ve normal prostat dokularındaki ERV'lerin ekspresyonu mikrodiziler kullanılarak karşılaştırıldı. Bu yöntem, araştırmacıların prostat kanserinde yukarı regüle edilen birkaç ERV'yi belirlemelerine izin verdi ve bu da onları hastalığı teşhis etmek için kullanılabilecek potansiyel biyobelirteçler haline getirdi.
Az önce JoVE'nin mikrodiziler kullanarak gen ekspresyonu profili oluşturma hakkındaki videosunu izlediniz. Bu video, mikroarray teknolojisinin temel ilkelerini, ifade profili oluşturma için bir protokolü ve bu tekniğin uygulamalarını kapsıyordu. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How do microarrays measure gene expression?
Microarrays measure gene expression through complementary hybridization between immobilized probes on glass chips and labeled sample nucleic acids. RNA from cells is reverse transcribed to cDNA, then converted to cRNA and labeled with fluorescent molecules. When the labeled sample hybridizes to matching probes on the chip, fluorescence intensity at each spot indicates expression levels for thousands of genes simultaneously.
Q2: What is the difference between microarrays and Northern blotting?
Northern blotting uses free-floating probes to detect RNA immobilized on membranes, while microarrays reverse this arrangement. In microarrays, oligonucleotide probes are immobilized on glass slides, and free-floating labeled cDNA or cRNA samples hybridize to them. This allows microarrays to simultaneously evaluate thousands of genes, whereas Northern blots typically assess one or a few genes at a time.
Q3: Why is RNA quality important before microarray analysis?
RNA quality is critical because RNases—enzymes that degrade RNA—can destroy samples during isolation and preparation. Workspaces and equipment are treated with RNase-inactivating chemicals to protect RNA integrity. Researchers verify RNA quality and concentration through spectrophotometry before converting it to cDNA, ensuring reliable downstream hybridization and accurate gene expression measurements.
Q4: How does microarray data analysis reveal gene relationships?
Microarray data undergoes statistical processing including log2 transformation and normalization to account for signal differences between chips. Researchers then cluster genes based on similar expression patterns across conditions. Dendrograms depict these relationships, showing how closely gene expression patterns match. Clustered genes often participate in the same biological pathways, providing insight into gene networks and functional associations.
Q5: What role do hybridization chambers play in microarray experiments?
Hybridization chambers are formed by placing a mixer onto the microarray chip to create isolated compartments for the hybridization mix. These chambers facilitate controlled binding between labeled sample and immobilized probes. Care must be taken to avoid air bubbles during sample loading, as they interfere with binding and produce false negative signals. Chips are then incubated at appropriate temperatures for up to 24 hours.
Q6: How are microarrays applied to cancer research?
Researchers use microarrays to compare gene expression between cancerous and normal tissues to identify disease biomarkers. For example, scientists compared endogenous retroviruses (ERVs)—viral sequences in human genomes—between prostate cancer and normal tissues. This identified ERVs upregulated in cancer, which can serve as diagnostic biomarkers. Microarrays enable simultaneous evaluation of thousands of genes to pinpoint expression differences associated with disease.
Q7: What does microarray scanning and image processing reveal?
After hybridization, the dried microarray is scanned to produce a digital image showing fluorescence intensity at each probe location. The scanner is adjusted to prevent signal over-saturation. Data-extraction software then analyzes the image for signal irregularities and processes the data through log2 transformation and normalization. This processed data quantifies fold changes in gene expression between experimental conditions.