RNA-Dizilimi
RNA dizilimi veya RNA-dizilimi, bir hücre popülasyonunda "transkriptom" olarak bilinen, eksprese edilen her RNA'nın dizisi ve miktarı hakkında bilgi sağlayabilen bir tekniktir. Bilinen RNA dizileri için sondalamayı içeren mikrodiziler gibi diğer ekspresyon profili oluşturma yöntemlerinden farklı olarak, RNA-seq, dizilenmemiş genomlara sahip organizmalardan gen ekspresyonunun profilini çıkarabilir. Ek olarak, RNA-seq, özellikle çok düşük veya çok yüksek seviyelerde, mikrodizilerden daha geniş bir transkript ekspresyon seviyeleri aralığını doğru bir şekilde ölçebilir.
Bu video, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve verileri analiz etmek için bir protokol olan RNA-seq ilkelerini ve bu tekniğin bazı uygulamalarını kapsayacaktır.
İlk olarak, RNA-seq'in arkasındaki bazı ilkeleri gözden geçirelim. Transkriptom dizilimi, seviyeleri ölçülecek bir transkript popülasyonunun izole edilmesini gerektirir. Hücrelerdeki çoğu RNA, hücrenin protein üretim mekanizmasının merkezi bileşeni olan ribozomal RNA veya rRNA'dır. Diğer transkript türlerinin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için, rRNA tipik olarak, numuneyi manyetik boncuklara bağlı tamamlayıcı oligonükleotidlere hibritleyerek ve rRNA'yı numunenin geri kalanından ayırmak için bir mıknatıs kullanarak dizilemeden önce çıkarılır.
Alternatif olarak, dizileme için belirli bir RNA popülasyonu seçilebilir. Örneğin, protein kodlayan haberci RNA'lar veya mRNA'lar, bu transkriptlerin sonunda poli-A kuyruğu olarak bilinen A bazlarının dizisine bağlanan kısa deoksi-T nükleotid uzantıları olan "oligo-dT" ile yakalanabilir. Kirletici rRNA daha sonra uzaklaştırılır. 22 nükleotid düzenleyici RNA'lar olan mikroRNA'lar, boyutlarına göre dizileme için seçici olarak izole edilebilir. RNA doğası gereği bozulmaya eğilimli olduğundan, önce çift sarmallı DNA'ya ters kopyalanır.
Adaptörler olarak bilinen oligonükleotid dizileri daha sonra DNA fragmanlarına bağlanır. Adaptörler, sonraki PCR amplifikasyonu için primer bağlama bölgeleri olarak hizmet eden sabit bölgeler içerir ve bunlar genellikle asimetriktir, böylece şablonun "bükülmüşlüğü" korunur. Adaptörler ayrıca, tek bir numuneden kaynaklanan tüm parçaları tanımlayan "barkodlar" olarak bilinen benzersiz diziler içerir. Kütüphane daha sonra PCR ile güçlendirilir.
Üzerinde adaptörlere tamamlayıcı oligonükleotidlerin bulunduğu bir dizileme çipi, DNA molekülleri düşük yoğunlukta çip üzerine tavlanacak şekilde seyreltilen kütüphane örneğini hareketsiz hale getirmek için kullanılır. DNA, "klonal kümeler" oluşturmak için "köprü amplifikasyonu" adı verilen bir işlemle çip üzerinde amplifiye edilir. Her biri 30-150 baz uzunluğunda olan kısa fragmanlar, daha sonra bu DNA şablonlarının bir veya her iki ucundan sentezlenir ve dizileme okumaları olarak bilinen yüz milyonlarca ürün üretilir.
Sıralama sonuçları daha sonra kalite açısından analiz edilir ve veriler işlenir. Dizilerin analizi, numuneler arasındaki RNA'ların ekspresyon seviyelerindeki farklılıklar ve daha önce bilinmeyen transkriptler veya transkript formları dahil olmak üzere çok çeşitli bilgileri ortaya çıkarabilir.
Artık RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördüğümüze göre, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve dizi verilerini analiz etmek için bir protokol üzerinden geçelim. RNA ilk olarak ilgilenilen numuneden elde edilir ve kalitesi, örneğin biyoanalizör adı verilen bir mikroakışkan cihaz kullanılarak elektroforez ile kontrol edilir. Doğru dizileme sonuçları için RNA'nın yüksek kalitede olması gerekir. DNA kontaminasyonunun olmamasını sağlamak için, eksprese edilen bir gen için RT-PCR, ters transkriptaz ile veya ters transkriptaz olmadan gerçekleştirilir. Ters transkriptaz yokluğunda ürün olmamalıdır.
Poli-A RNA'yı seçmek için, numuneler manyetik boncuklara bağlı oligo-dT problarına bağlanır. Seçilen RNA, magnezyum iyonlarının varlığında yüksek sıcaklıkta 200 nükleotid parçasına parçalanır ve sonraki reaksiyonlarda ve analizlerde uzunluğa bağlı önyargıları azaltır. Parçalar daha sonra çift sarmallı DNA'ya dönüştürülür ve adaptörler bağlanır. Kütüphane PCR ile amplifiye edilir ve kalitesi bir biyoanalizörde ve qPCR gerçekleştirilerek kontrol edilir. Biyoanalizör sonuçları, adaptörlerin ortalama parça boyutuna ve uzunluğuna bağlı olarak beklenen boyutta bir ürün zirvesini ortaya çıkarmalıdır.
Farklı barkodlu adaptörler içeren farklı numunelerden alınan kütüphaneler, klonal küme oluşturma ve sıralama reaksiyonları gibi işlemin sonraki adımları için bir kalite kontrol olarak düşük konsantrasyonda eklenen bir referans DNA numunesi ile birlikte karıştırılabilir. Karışım bir sıralama çipine eklenir ve makineye yüklenir.
Dizileme reaksiyonu sırasında DNA kümelerinin yoğunluğu izlenir: çapraz kontaminasyona yol açabilecek çok yüksek veya yetersiz veriye yol açabilecek çok düşük olmamalıdır. Sıralamanın kalitesi, yanlış bir tabanın tanımlanma olasılığını gösteren Q skoru ile verilir. Çoğu baz için Q puanları 30'dan büyük olmalıdır, bu da yanlış bir okuma için 1000'de 1'den daha az bir şansa karşılık gelir. Referans DNA dizilerinin beklenen oranda geri kazanılması, tüm kütüphane dizilerinin eşit olarak temsil edildiğini gösterir.
Dizileme ile oluşturulan okumalar daha sonra dizilenen RNA'yı çıkarmak için birbiriyle örtüşür. Genom bilgisi mevcut olan organizmalar için, okumalar referans genomla uyumlu hale getirilebilir. Her bir RNA'nın bolluğunu ölçmek için transkript başına okuma sayısı sayılır.
RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördükten sonra, bazı kullanım şekillerine bakalım.
Transkriptom dizilimi, farklı koşullar altında farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlayabilir. Örneğin, bu deneyde, farklı büyüme koşulları altında üretilen sivrisinek larvalarının transkriptomları karşılaştırıldı. Bu özel hastalık taşıyan sivrisinek türünün dizilenmiş bir genomu olmamasına rağmen, araştırmacılar elde edilen transkriptom bilgilerini diğer dizilenmiş türlerle karşılaştırabildiler ve ekspresyon seviyeleri artmış veya azalmış genleri tanımlayabildiler.
RNA-seq, gen düzenleyici mekanizmaları incelemek için "büyük ölçüde paralel raportör tahlillerinde" de kullanılabilir. Bu, memeli hücrelerinin, her biri benzersiz etiketlere bağlı bir raportör dizisinin transkripsiyonunu "yönlendiren" bir gen düzenleyici bölgenin mutasyona uğramış bir varyantını içeren binlerce plazmitten oluşan bir kütüphane ile transfekte edilmesiyle yapılır. RNA izolasyonu ve yüksek verimli dizilemeyi takiben, her bir etiketin seviyeleri, her bir yapıdan raportör ifadesini değerlendirmek için değerlendirilir, bu da her bir düzenleyici site varyantında mutasyona uğramış nükleotidlerin işlevsel önemi hakkında fikir verir.
Son olarak, RNA dizilimi, RNA-protein etkileşimlerini incelemek, özellikle de ilgilenilen bir proteinin bağlandığı transkriptleri tanımlamak için uyarlanabilir. Protein, antikorlarla immünopresipite edilir ve bağlı RNA'lar dizileme ile tanımlanır. RNA-protein kompleksleri başlangıçta çapraz bağlanırsa, dizileme analizi çapraz bağın bölgesini haritalayabilir ve RNA üzerindeki protein bağlanma bölgesini nükleotid seviyesine kadar tanımlayabilir.
Az önce JoVE'nin RNA-seq ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, RNA örneklerinin nasıl kütüphanelere dönüştürüldüğünü, dizilendiğini ve elde edilen verilerin analiz edildiğini ve ayrıca dizileme analizinin sağlayabileceği bilgi türlerini gördük. Hassasiyeti, herhangi bir organizmada kullanılma potansiyeli ve düşük dizileme maliyeti sayesinde, RNA-seq, genetik araştırmaların birçok alanında giderek daha fazla kullanılmaktadır ve hücre işlevi ve gelişimi ile ilgili birçok soruya ışık tutacaktır. İzlediğiniz için teşekkürler!
Gen ekspresyonunu değerlendirmek için farklı yöntemler arasında, RNA'nın yüksek verimli dizilimi veya RNA-dizilimi. önceden mevcut genomik bilgilere d…
RNA dizilimi veya RNA-dizilimi, bir hücre popülasyonunda "transkriptom" olarak bilinen, eksprese edilen her RNA'nın dizisi ve miktarı hakkında bilgi sağlayabilen bir tekniktir. Bilinen RNA dizileri için sondalamayı içeren mikrodiziler gibi diğer ekspresyon profili oluşturma yöntemlerinden farklı olarak, RNA-seq, dizilenmemiş genomlara sahip organizmalardan gen ekspresyonunun profilini çıkarabilir. Ek olarak, RNA-seq, özellikle çok düşük veya çok yüksek seviyelerde, mikrodizilerden daha geniş bir transkript ekspresyon seviyeleri aralığını doğru bir şekilde ölçebilir.
Bu video, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve verileri analiz etmek için bir protokol olan RNA-seq ilkelerini ve bu tekniğin bazı uygulamalarını kapsayacaktır.
İlk olarak, RNA-seq'in arkasındaki bazı ilkeleri gözden geçirelim. Transkriptom dizilimi, seviyeleri ölçülecek bir transkript popülasyonunun izole edilmesini gerektirir. Hücrelerdeki çoğu RNA, hücrenin protein üretim mekanizmasının merkezi bileşeni olan ribozomal RNA veya rRNA'dır. Diğer transkript türlerinin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için, rRNA tipik olarak, numuneyi manyetik boncuklara bağlı tamamlayıcı oligonükleotidlere hibritleyerek ve rRNA'yı numunenin geri kalanından ayırmak için bir mıknatıs kullanarak dizilemeden önce çıkarılır.
Alternatif olarak, dizileme için belirli bir RNA popülasyonu seçilebilir. Örneğin, protein kodlayan haberci RNA'lar veya mRNA'lar, bu transkriptlerin sonunda poli-A kuyruğu olarak bilinen A bazlarının dizisine bağlanan kısa deoksi-T nükleotid uzantıları olan "oligo-dT" ile yakalanabilir. Kirletici rRNA daha sonra uzaklaştırılır. 22 nükleotid düzenleyici RNA'lar olan mikroRNA'lar, boyutlarına göre dizileme için seçici olarak izole edilebilir. RNA doğası gereği bozulmaya eğilimli olduğundan, önce çift sarmallı DNA'ya ters kopyalanır.
Adaptörler olarak bilinen oligonükleotid dizileri daha sonra DNA fragmanlarına bağlanır. Adaptörler, sonraki PCR amplifikasyonu için primer bağlama bölgeleri olarak hizmet eden sabit bölgeler içerir ve bunlar genellikle asimetriktir, böylece şablonun "bükülmüşlüğü" korunur. Adaptörler ayrıca, tek bir numuneden kaynaklanan tüm parçaları tanımlayan "barkodlar" olarak bilinen benzersiz diziler içerir. Kütüphane daha sonra PCR ile güçlendirilir.
Üzerinde adaptörlere tamamlayıcı oligonükleotidlerin bulunduğu bir dizileme çipi, DNA molekülleri düşük yoğunlukta çip üzerine tavlanacak şekilde seyreltilen kütüphane örneğini hareketsiz hale getirmek için kullanılır. DNA, "klonal kümeler" oluşturmak için "köprü amplifikasyonu" adı verilen bir işlemle çip üzerinde amplifiye edilir. Her biri 30-150 baz uzunluğunda olan kısa fragmanlar, daha sonra bu DNA şablonlarının bir veya her iki ucundan sentezlenir ve dizileme okumaları olarak bilinen yüz milyonlarca ürün üretilir.
Sıralama sonuçları daha sonra kalite açısından analiz edilir ve veriler işlenir. Dizilerin analizi, numuneler arasındaki RNA'ların ekspresyon seviyelerindeki farklılıklar ve daha önce bilinmeyen transkriptler veya transkript formları dahil olmak üzere çok çeşitli bilgileri ortaya çıkarabilir.
Artık RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördüğümüze göre, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve dizi verilerini analiz etmek için bir protokol üzerinden geçelim. RNA ilk olarak ilgilenilen numuneden elde edilir ve kalitesi, örneğin biyoanalizör adı verilen bir mikroakışkan cihaz kullanılarak elektroforez ile kontrol edilir. Doğru dizileme sonuçları için RNA'nın yüksek kalitede olması gerekir. DNA kontaminasyonunun olmamasını sağlamak için, eksprese edilen bir gen için RT-PCR, ters transkriptaz ile veya ters transkriptaz olmadan gerçekleştirilir. Ters transkriptaz yokluğunda ürün olmamalıdır.
Poli-A RNA'yı seçmek için, numuneler manyetik boncuklara bağlı oligo-dT problarına bağlanır. Seçilen RNA, magnezyum iyonlarının varlığında yüksek sıcaklıkta 200 nükleotid parçasına parçalanır ve sonraki reaksiyonlarda ve analizlerde uzunluğa bağlı önyargıları azaltır. Parçalar daha sonra çift sarmallı DNA'ya dönüştürülür ve adaptörler bağlanır. Kütüphane PCR ile amplifiye edilir ve kalitesi bir biyoanalizörde ve qPCR gerçekleştirilerek kontrol edilir. Biyoanalizör sonuçları, adaptörlerin ortalama parça boyutuna ve uzunluğuna bağlı olarak beklenen boyutta bir ürün zirvesini ortaya çıkarmalıdır.
Farklı barkodlu adaptörler içeren farklı numunelerden alınan kütüphaneler, klonal küme oluşturma ve sıralama reaksiyonları gibi işlemin sonraki adımları için bir kalite kontrol olarak düşük konsantrasyonda eklenen bir referans DNA numunesi ile birlikte karıştırılabilir. Karışım bir sıralama çipine eklenir ve makineye yüklenir.
Dizileme reaksiyonu sırasında DNA kümelerinin yoğunluğu izlenir: çapraz kontaminasyona yol açabilecek çok yüksek veya yetersiz veriye yol açabilecek çok düşük olmamalıdır. Sıralamanın kalitesi, yanlış bir tabanın tanımlanma olasılığını gösteren Q skoru ile verilir. Çoğu baz için Q puanları 30'dan büyük olmalıdır, bu da yanlış bir okuma için 1000'de 1'den daha az bir şansa karşılık gelir. Referans DNA dizilerinin beklenen oranda geri kazanılması, tüm kütüphane dizilerinin eşit olarak temsil edildiğini gösterir.
Dizileme ile oluşturulan okumalar daha sonra dizilenen RNA'yı çıkarmak için birbiriyle örtüşür. Genom bilgisi mevcut olan organizmalar için, okumalar referans genomla uyumlu hale getirilebilir. Her bir RNA'nın bolluğunu ölçmek için transkript başına okuma sayısı sayılır.
RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördükten sonra, bazı kullanım şekillerine bakalım.
Transkriptom dizilimi, farklı koşullar altında farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlayabilir. Örneğin, bu deneyde, farklı büyüme koşulları altında üretilen sivrisinek larvalarının transkriptomları karşılaştırıldı. Bu özel hastalık taşıyan sivrisinek türünün dizilenmiş bir genomu olmamasına rağmen, araştırmacılar elde edilen transkriptom bilgilerini diğer dizilenmiş türlerle karşılaştırabildiler ve ekspresyon seviyeleri artmış veya azalmış genleri tanımlayabildiler.
RNA-seq, gen düzenleyici mekanizmaları incelemek için "büyük ölçüde paralel raportör tahlillerinde" de kullanılabilir. Bu, memeli hücrelerinin, her biri benzersiz etiketlere bağlı bir raportör dizisinin transkripsiyonunu "yönlendiren" bir gen düzenleyici bölgenin mutasyona uğramış bir varyantını içeren binlerce plazmitten oluşan bir kütüphane ile transfekte edilmesiyle yapılır. RNA izolasyonu ve yüksek verimli dizilemeyi takiben, her bir etiketin seviyeleri, her bir yapıdan raportör ifadesini değerlendirmek için değerlendirilir, bu da her bir düzenleyici site varyantında mutasyona uğramış nükleotidlerin işlevsel önemi hakkında fikir verir.
Son olarak, RNA dizilimi, RNA-protein etkileşimlerini incelemek, özellikle de ilgilenilen bir proteinin bağlandığı transkriptleri tanımlamak için uyarlanabilir. Protein, antikorlarla immünopresipite edilir ve bağlı RNA'lar dizileme ile tanımlanır. RNA-protein kompleksleri başlangıçta çapraz bağlanırsa, dizileme analizi çapraz bağın bölgesini haritalayabilir ve RNA üzerindeki protein bağlanma bölgesini nükleotid seviyesine kadar tanımlayabilir.
Az önce JoVE'nin RNA-seq ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, RNA örneklerinin nasıl kütüphanelere dönüştürüldüğünü, dizilendiğini ve elde edilen verilerin analiz edildiğini ve ayrıca dizileme analizinin sağlayabileceği bilgi türlerini gördük. Hassasiyeti, herhangi bir organizmada kullanılma potansiyeli ve düşük dizileme maliyeti sayesinde, RNA-seq, genetik araştırmaların birçok alanında giderek daha fazla kullanılmaktadır ve hücre işlevi ve gelişimi ile ilgili birçok soruya ışık tutacaktır. İzlediğiniz için teşekkürler!
RNA dizilimi veya RNA-dizilimi, bir hücre popülasyonunda "transkriptom" olarak bilinen, eksprese edilen her RNA'nın dizisi ve miktarı hakkında bilgi sağlayabilen bir tekniktir. Bilinen RNA dizileri için sondalamayı içeren mikrodiziler gibi diğer ekspresyon profili oluşturma yöntemlerinden farklı olarak, RNA-seq, dizilenmemiş genomlara sahip organizmalardan gen ekspresyonunun profilini çıkarabilir. Ek olarak, RNA-seq, özellikle çok düşük veya çok yüksek seviyelerde, mikrodizilerden daha geniş bir transkript ekspresyon seviyeleri aralığını doğru bir şekilde ölçebilir.
Bu video, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve verileri analiz etmek için bir protokol olan RNA-seq ilkelerini ve bu tekniğin bazı uygulamalarını kapsayacaktır.
İlk olarak, RNA-seq'in arkasındaki bazı ilkeleri gözden geçirelim. Transkriptom dizilimi, seviyeleri ölçülecek bir transkript popülasyonunun izole edilmesini gerektirir. Hücrelerdeki çoğu RNA, hücrenin protein üretim mekanizmasının merkezi bileşeni olan ribozomal RNA veya rRNA'dır. Diğer transkript türlerinin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için, rRNA tipik olarak, numuneyi manyetik boncuklara bağlı tamamlayıcı oligonükleotidlere hibritleyerek ve rRNA'yı numunenin geri kalanından ayırmak için bir mıknatıs kullanarak dizilemeden önce çıkarılır.
Alternatif olarak, dizileme için belirli bir RNA popülasyonu seçilebilir. Örneğin, protein kodlayan haberci RNA'lar veya mRNA'lar, bu transkriptlerin sonunda poli-A kuyruğu olarak bilinen A bazlarının dizisine bağlanan kısa deoksi-T nükleotid uzantıları olan "oligo-dT" ile yakalanabilir. Kirletici rRNA daha sonra uzaklaştırılır. 22 nükleotid düzenleyici RNA'lar olan mikroRNA'lar, boyutlarına göre dizileme için seçici olarak izole edilebilir. RNA doğası gereği bozulmaya eğilimli olduğundan, önce çift sarmallı DNA'ya ters kopyalanır.
Adaptörler olarak bilinen oligonükleotid dizileri daha sonra DNA fragmanlarına bağlanır. Adaptörler, sonraki PCR amplifikasyonu için primer bağlama bölgeleri olarak hizmet eden sabit bölgeler içerir ve bunlar genellikle asimetriktir, böylece şablonun "bükülmüşlüğü" korunur. Adaptörler ayrıca, tek bir numuneden kaynaklanan tüm parçaları tanımlayan "barkodlar" olarak bilinen benzersiz diziler içerir. Kütüphane daha sonra PCR ile güçlendirilir.
Üzerinde adaptörlere tamamlayıcı oligonükleotidlerin bulunduğu bir dizileme çipi, DNA molekülleri düşük yoğunlukta çip üzerine tavlanacak şekilde seyreltilen kütüphane örneğini hareketsiz hale getirmek için kullanılır. DNA, "klonal kümeler" oluşturmak için "köprü amplifikasyonu" adı verilen bir işlemle çip üzerinde amplifiye edilir. Her biri 30-150 baz uzunluğunda olan kısa fragmanlar, daha sonra bu DNA şablonlarının bir veya her iki ucundan sentezlenir ve dizileme okumaları olarak bilinen yüz milyonlarca ürün üretilir.
Sıralama sonuçları daha sonra kalite açısından analiz edilir ve veriler işlenir. Dizilerin analizi, numuneler arasındaki RNA'ların ekspresyon seviyelerindeki farklılıklar ve daha önce bilinmeyen transkriptler veya transkript formları dahil olmak üzere çok çeşitli bilgileri ortaya çıkarabilir.
Artık RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördüğümüze göre, bir RNA-seq kütüphanesi hazırlamak ve dizi verilerini analiz etmek için bir protokol üzerinden geçelim. RNA ilk olarak ilgilenilen numuneden elde edilir ve kalitesi, örneğin biyoanalizör adı verilen bir mikroakışkan cihaz kullanılarak elektroforez ile kontrol edilir. Doğru dizileme sonuçları için RNA'nın yüksek kalitede olması gerekir. DNA kontaminasyonunun olmamasını sağlamak için, eksprese edilen bir gen için RT-PCR, ters transkriptaz ile veya ters transkriptaz olmadan gerçekleştirilir. Ters transkriptaz yokluğunda ürün olmamalıdır.
Poli-A RNA'yı seçmek için, numuneler manyetik boncuklara bağlı oligo-dT problarına bağlanır. Seçilen RNA, magnezyum iyonlarının varlığında yüksek sıcaklıkta 200 nükleotid parçasına parçalanır ve sonraki reaksiyonlarda ve analizlerde uzunluğa bağlı önyargıları azaltır. Parçalar daha sonra çift sarmallı DNA'ya dönüştürülür ve adaptörler bağlanır. Kütüphane PCR ile amplifiye edilir ve kalitesi bir biyoanalizörde ve qPCR gerçekleştirilerek kontrol edilir. Biyoanalizör sonuçları, adaptörlerin ortalama parça boyutuna ve uzunluğuna bağlı olarak beklenen boyutta bir ürün zirvesini ortaya çıkarmalıdır.
Farklı barkodlu adaptörler içeren farklı numunelerden alınan kütüphaneler, klonal küme oluşturma ve sıralama reaksiyonları gibi işlemin sonraki adımları için bir kalite kontrol olarak düşük konsantrasyonda eklenen bir referans DNA numunesi ile birlikte karıştırılabilir. Karışım bir sıralama çipine eklenir ve makineye yüklenir.
Dizileme reaksiyonu sırasında DNA kümelerinin yoğunluğu izlenir: çapraz kontaminasyona yol açabilecek çok yüksek veya yetersiz veriye yol açabilecek çok düşük olmamalıdır. Sıralamanın kalitesi, yanlış bir tabanın tanımlanma olasılığını gösteren Q skoru ile verilir. Çoğu baz için Q puanları 30'dan büyük olmalıdır, bu da yanlış bir okuma için 1000'de 1'den daha az bir şansa karşılık gelir. Referans DNA dizilerinin beklenen oranda geri kazanılması, tüm kütüphane dizilerinin eşit olarak temsil edildiğini gösterir.
Dizileme ile oluşturulan okumalar daha sonra dizilenen RNA'yı çıkarmak için birbiriyle örtüşür. Genom bilgisi mevcut olan organizmalar için, okumalar referans genomla uyumlu hale getirilebilir. Her bir RNA'nın bolluğunu ölçmek için transkript başına okuma sayısı sayılır.
RNA-seq'in nasıl çalıştığını gördükten sonra, bazı kullanım şekillerine bakalım.
Transkriptom dizilimi, farklı koşullar altında farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlayabilir. Örneğin, bu deneyde, farklı büyüme koşulları altında üretilen sivrisinek larvalarının transkriptomları karşılaştırıldı. Bu özel hastalık taşıyan sivrisinek türünün dizilenmiş bir genomu olmamasına rağmen, araştırmacılar elde edilen transkriptom bilgilerini diğer dizilenmiş türlerle karşılaştırabildiler ve ekspresyon seviyeleri artmış veya azalmış genleri tanımlayabildiler.
RNA-seq, gen düzenleyici mekanizmaları incelemek için "büyük ölçüde paralel raportör tahlillerinde" de kullanılabilir. Bu, memeli hücrelerinin, her biri benzersiz etiketlere bağlı bir raportör dizisinin transkripsiyonunu "yönlendiren" bir gen düzenleyici bölgenin mutasyona uğramış bir varyantını içeren binlerce plazmitten oluşan bir kütüphane ile transfekte edilmesiyle yapılır. RNA izolasyonu ve yüksek verimli dizilemeyi takiben, her bir etiketin seviyeleri, her bir yapıdan raportör ifadesini değerlendirmek için değerlendirilir, bu da her bir düzenleyici site varyantında mutasyona uğramış nükleotidlerin işlevsel önemi hakkında fikir verir.
Son olarak, RNA dizilimi, RNA-protein etkileşimlerini incelemek, özellikle de ilgilenilen bir proteinin bağlandığı transkriptleri tanımlamak için uyarlanabilir. Protein, antikorlarla immünopresipite edilir ve bağlı RNA'lar dizileme ile tanımlanır. RNA-protein kompleksleri başlangıçta çapraz bağlanırsa, dizileme analizi çapraz bağın bölgesini haritalayabilir ve RNA üzerindeki protein bağlanma bölgesini nükleotid seviyesine kadar tanımlayabilir.
Az önce JoVE'nin RNA-seq ile ilgili videosunu izlediniz. Bu videoda, RNA örneklerinin nasıl kütüphanelere dönüştürüldüğünü, dizilendiğini ve elde edilen verilerin analiz edildiğini ve ayrıca dizileme analizinin sağlayabileceği bilgi türlerini gördük. Hassasiyeti, herhangi bir organizmada kullanılma potansiyeli ve düşük dizileme maliyeti sayesinde, RNA-seq, genetik araştırmaların birçok alanında giderek daha fazla kullanılmaktadır ve hücre işlevi ve gelişimi ile ilgili birçok soruya ışık tutacaktır. İzlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is RNA-seq and how does it differ from microarrays?
RNA-seq is a high-throughput sequencing technique that measures the sequence and quantity of all RNA expressed in a cell population, called the transcriptome. Unlike microarrays, which probe for known RNA sequences, RNA-seq can profile gene expression from organisms with unsequenced genomes and accurately measure a larger range of transcript expression levels, especially at very low or very high levels.
Q2: Why is rRNA removed before RNA-seq library preparation?
Most RNA in cells is ribosomal RNA (rRNA), which is the central component of the cell's protein-production machinery. Removing rRNA facilitates recovery of other transcript types for accurate measurement. rRNA is typically removed by hybridizing the sample to complementary oligonucleotides attached to magnetic beads, then using a magnet to separate rRNA from the rest of the sample.
Q3: How are RNA samples converted to DNA for sequencing?
Because RNA is inherently prone to degradation, it is first reverse transcribed to double-stranded DNA. Oligonucleotide sequences called adaptors are then ligated onto the DNA fragments. These adaptors contain constant regions that serve as primer-binding sites for PCR amplification and unique sequences called barcodes that identify fragments from each sample.
Q4: What role do barcodes play in RNA-seq library preparation?
Barcodes are unique oligonucleotide sequences contained within adaptors that identify all DNA fragments originating from a single sample. This allows libraries from different samples to be mixed together and sequenced simultaneously. After sequencing, the barcodes enable researchers to sort and analyze reads by their source sample.
Q5: How is RNA-seq data quality assessed during sequencing?
The quality of sequencing is indicated by the Q score, which reflects the likelihood of an incorrect base being identified. Q scores greater than 30 correspond to less than a 1 in 1,000 chance of an incorrect read. Additionally, reference DNA sequences added at low concentration serve as quality control, and their recovery at the expected rate indicates that all library sequences are evenly represented.
Q6: What can RNA-seq reveal about gene expression differences between samples?
RNA-seq can identify genes that are differentially expressed under different conditions by comparing transcriptomes between samples. Researchers can count the number of reads per transcript to measure RNA abundance. Even for organisms without sequenced genomes, transcriptome information can be compared to other sequenced species to identify genes with increased or decreased expression levels.
Q7: How is RNA-seq used to study RNA-protein interactions?
RNA-seq can be adapted to identify transcripts that a protein of interest binds to by immunoprecipitating the protein with antibodies and defining the bound RNAs through sequencing. When RNA-protein complexes are crosslinked at the beginning, sequencing analysis can map the crosslink site and identify the protein-binding site on the RNA down to the nucleotide level.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:59
Principles of RNA Sequencing
4:07
RNA-Seq Library Preparation and Analysis
7:04
Applications
9:06
Summary
Videos from this collection: