Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

Bu görüntüleme analizinin genel amacı, nöronlardaki vezikül motilitesini gözlemlemek ve bunu kolayca ölçmektir. Bu yaklaşım, nöronlardaki zar trafiğini basit ve zaman açısından etkin bir şekilde analiz etmeyi sağlar. Bu işleme başlamak için uterusu% 70 etanol içeren yeni bir Petri kabına aktarın.

Daha sonra, uterusu HBSS ile başka bir Petri kabına aktarın. Daha sonra sterilize edilmiş diseksiyon forseps ve cerrahi makas kullanarak fetüsleri uterustan çıkarın. Bundan sonra onları HBSS ile yeni bir Petri kabına yerleştirin.

Stereo mikroskop altında cildi ve kafataslarını çıkarın ve sterilize edilmiş diseksiyon forsepslerini kullanarak beyinleri çıkarın. Ardından, bunları HBSS ile başka bir Petri kabına aktarın. Sterilize diseksiyon forsepsleri kullanarak meninksleri çıkarın.

Ardından ekstra bölgeleri kesin. Ardından, korteksleri HBSS ile yeni bir Petri kabına aktarın. Tek kullanımlık bir damlalık veya 25 mililitrelik bir pipet kullanarak tüm korteksleri toplayın ve 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin.

Bunu takiben, pipetleme ile HBSS'yi çıkarın. Daha sonra, korteksleri içeren tüpe üç mililitre serebral kortikal enzim çözeltisi ekleyin. Tüpü bir su banyosuna yerleştirin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bundan sonra, korteksleri içeren tüpe üç mililitre daha serebral kortikal enzim çözeltisi ekleyin ve bunları bir su banyosunda 37 santigrat derecede beş dakika daha inkübe edin. Beş dakika sonra serebral kortikal enzim çözeltisini çıkarın ve% 10 fetal sığır serumu içeren beş mililitre DMEM ekleyin. Steril bir P1000 uçlu beş mililitrelik bir pipet kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek korteksleri ayırın.

Ardından, P200 uçlu beş mililitrelik bir pipet kullanarak korteksleri tekrar pipetleyin. 50 mililitrelik bir tüpe 40 mikrometrelik bir naylon hücre süzgeci koyun ve kalıntıları gidermek için süspansiyonu süzün. Daha sonra, süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 420 kez g'de santrifüjleyin ve ardından DMEM ortamını çıkarın.

Daha sonra, beş mililitre serebral kortikal kültür ortamı ekleyin ve hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Daha sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve serebral kortikal kültür ortamını kullanarak hücre konsantrasyonunu ayarlayın. Daha sonra, her kodlanmış 35 mililitrelik cam alt tabak için iki mililitre hücre süspansiyonunda altı kortikal nörona 10 kez üç kez plakalayın.

Bu prosedürde, dört mikrogram plazmidi 200 mikrolitre serumsuz ortamla karıştırın. Ayrı bir tüpte, transfeksiyon reaktifinin sekiz mikrolitresini 200 mikrolitre serumsuz ortamda seyreltin. Ardından, çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Beş dakika sonra, plazmit çözeltisini ve transfeksiyon reaktif çözeltisini karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bunu takiben, karışımı şifreli cam alt tabaklara ekleyin. Nöronları 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, ortamı iki mililitre serebral kortikal kültür ortamı ile değiştirin ve nöronları bir ila iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Görüntüleme için, 40X objektif lensli bir CCD kamera ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. Bir inkübasyon sistemi kullanarak sıcaklığı 37 santigrat derecede tutun.

Görüntü elde etme yazılımı tarafından kontrol edilen 100 saniyelik bir süre boyunca her beş saniyede bir karede nöron görüntüleri elde edin. Görüntüleri analiz etmek için, tüm sıralı görüntüleri Manuel İzleme ile ImageJ yazılımında açın. Sıralı görüntüleri birleştirmek için Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı, ardından Yığınlanacak Görüntüler'i seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Bundan sonra, Eklentiler'i ve ardından Manuel İzleme'yi seçin.

Bir İzleme penceresi açılacaktır. Parametreleri Göster onay kutusuna tıklayın ve Parametreler bölümünde izleme parametrelerini tanımlayın. Ardından, yeni bir parça başlatmak için Parça ekle'ye tıklayın.

İlgilenilen vezikülleri belirledikten sonra, xy koordinatlarını kaydetmek için sıralı görüntülerdeki sinyallerin merkezine tıklayın. Tüm sıralı görüntülerden veziküllerin xy koordinatlarını toplamak için bu prosedürü tekrarlayın, referans noktası seçildikten sonra her görüntü otomatik olarak ardışık görüntüye ilerler. Bu görüntü, dört DIV'de başlayan iki günlük transfeksiyondan sonra fare kortikal nöronlarının dendritlerinde LAMP-EGFP içeren veziküllerin motilitesini göstermektedir.

İç kısım, LAMP-EGFP pozitif veziküllerin hızlandırılmış görüntüsünü gösterir. Kırmızı ok ucu hareketli bir vezikülü ve mavi ok ucu dinlenen bir vezikülü gösterir. Turuncu ok uçları daha yüksek floresan sinyallerini gösterir.

İşte LAMP-EGFP pozitif veziküllerin zamana bağlı X ekseni konumu. B etiketli kırmızı daire içindeki vezikül hareket ediyor ve a etiketli mavi daire içindeki vezikül dinleniyor. Bu çubuk grafik, LAMP-EGFP hareketinin toplam mesafesini gösterir.

Ve bu çubuk grafik, veziküller içeren bir LAMP-EGFP'nin ortalama motilite mesafesini gösterir.