Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Bu deneysel stratejinin genel amacı, mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi, afinitenin fraksiyonlanması, saflaştırılmış protein kompleksleri ve kütle spektrometresi korelasyon profili oluşturma yoluyla bir proteinin dahil olabileceği farklı fonksiyonel düzenekleri çözmektir. Bu yöntem, afinite saflaştırma, büyük spektrometre, deneyler tarafından oluşturulan protein listelerine organizasyonel bilgi eklenmesine yardımcı olabilir. Bu prosedürün ana avantajları, gerçekleştirilmesinin basit olması, iyi çözünürlüğe sahip olması ve geleneksel jel CMSMS'den biraz daha fazla iş gerektirmesidir.

Bu protokol, FLAG etiketli bir proteinin endojen seviyelerini ifade eden 200 ila 500 milyon hücreden protein komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. Hücre peletini çözdükten sonra, metin protokolünde açıklandığı gibi, hücre süspansiyonuna DTT ve proteaz inhibitörleri içeren beş mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve karıştırmak için döndürün. Süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Hücre süspansiyonunu soğuk bir homojenizatöre aktarın. Hücreleri 20 ila 30 vuruşla, gözle görülür bir viskozite kalmayana kadar sıkı havaneli kullanarak parçalayın, ardından homojenatı soğuk mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri santrifüjledikten sonra, temizlenmiş lizatı temiz bir soğuk tüpe aktarın ve geride yaklaşık 50 mikrolitre lizat bırakın.

Protein konsantrasyonunu ölçmek ve saflaştırmayı izlemek için 35 mikrolitrelik bir lizat alikotu kaydedin. Ardından, tamponu önceden hazırlanmış boncuklardan çıkarın. Boncukları bir mililitre lizat ile tekrar süspanse edin ve ardından lizatın geri kalanıyla karıştırın.

Karışımı dönen bir tekerlek üzerinde dört santigrat derecede bir ila iki saat inkübe edin. Tüpün yan tarafındaki boncukları bir mıknatıs ile toplayın. 30 mikrolitrelik bir süpernatan alikotu toplayın ve geri kalanını atın.

Boncukları 0,5 mililitre IPP150 tamponunda dört ila altı kez pipetleyerek yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir soğuk tüpe aktarın. Ardından, boncukları 0,5 mililitre FLAG elüsyon doğal tamponu ile üç kez yıkayın.

Son yıkama ile boncukları yeni bir soğuk tüpe aktarın. Tamponu iyice çıkarın. Boncukları, doğal elüsyon tamponunda mililitre 3X5 peptit başına 100 mikrolitre 200 mikrogram içinde yeniden süspanse edin.

Ardından, hafif bir rotasyonla 10 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Boncukları mıknatısla toplayın ve süpernatanı soğuk yeni bir tüpe aktarın. Tüm elüatları çekmeden önce bu adımı iki kez tekrarlayın.

Elüatı, dört santigrat derecede 10.000 kez G'de santrifüjleme ile santrifüj filtre ünitesinde 25 mikrolitreye kadar konsantre edin. 25 mikrolitrelik konsantre elüata 4X doğal numune yükleme tamponu ve %0,5 G-250 numune katkı maddesi ekleyerek numuneyi hazırlayın. Numuneyi ve doğal moleküler ağırlık işaretleyicilerini, aralarında boş bir kuyu bırakarak yükleyin.

Ardından, tüm boş kuyucuklara 10 ila 20 mikrolitre 1X yerel numune yükleme tamponu yükleyin. Numuneleri rahatsız etmemek için katot haznesini 200 mililitre 1X yerel PAGE koyu mavi katot tamponu ile dikkatlice doldurun. Anot haznesini 550 mililitre 1X yerel PAGE anot tamponu ile doldurun.

Jeli 30 dakika boyunca 150 voltta çalıştırın. Çalışmayı durdurduktan sonra, koyu mavi katot tamponunu serolojik bir pipetle çıkarın ve 1X açık mavi katot tamponu ile değiştirin. Çalışmaya 60 dakika devam ettikten sonra jel kasetini açın ve kaset plakalarından birini atın.

Jel diğer kaset plakasına bağlı kalır. Jeli, üzerini örtecek kadar sabitleyici solüsyon içeren bir tepsiye koyun ve hafifçe çalkalayarak 30 dakika inkübe edin. Ardından, sabitleyici solüsyonu çıkarın ve jeli taramadan önce suyla değiştirin.

Kütle spektrometresine hazırlanmak için, önce atıkları toplamak için başka bir 96 kuyulu plakanın üzerine konik tabanlı bir 96 kuyulu plaka yerleştirin. Konik tabanlı 96 kuyulu plakanın kuyularının dibini 21 gauge iğne ile delin. Daha sonra, delinmiş plakanın kuyucuklarına 200 mikrolitre% 50 asetonitril,% 0.25 formik asit ekleyin.

Plaka yığınını bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, plakayı bir dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin, böylece sıvı deliklerden atık toplama plakasına akar. Yıkama adımlarını iki kez tekrarladıktan sonra, delinmiş 96 oyuklu plakanın kuyularını 150 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat ile doldurun.

Sonra, jeli temiz bir yüzeye yerleştirin. Numuneyi içeren şeridi 48 aynı dilime dilimleyin. Jelenin üst kısmındaki son beş dilim hariç, her dilimi iki veya üç küçük parçaya kesin.

Her dilimi sırayla delinmiş ucun bir kuyucuğuna, yıkanmış 96 oyuklu plakaya yerleştirin. Her oyuğa 50 mikrolitre asetonitril ekleyin ve plakayı 30 ila 60 dakika çalkalayarak inkübe edin. Sıvıyı santrifüjleme ile çıkardıktan sonra, her oyuğa 200 mikrolitre iki milimetre TSEB ve 50 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin.

Sıvıyı daha önce olduğu gibi santrifüjleme ile çıkarmadan önce plakayı oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayarak inkübe edin. 200 mikrolitre saf asetonitril ekleyerek jel parçalarını kurutun ve jel parçaları beyaz ve opak olana kadar oda sıcaklığında 20 dakika çalkalayarak inkübe edin. Asetonitril'i çıkardıktan sonra, her bir oyuğa soğuk amonyum bikarbonat içinde 150 mikrolitre tripsin ekleyin.

Plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Ardından, jel içeren plakanın altına temiz bir konik alt plaka yerleştirin ve plakaların doğru yönlendirilmesini sağlayın. Daha sonra, peptitleri içeren sıvıyı bir dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme ile toplayın.

Peptit içeren plakayı santrifüjlü bir buharlaştırıcıya yerleştirin ve bir sonraki adımı gerçekleştirirken sıvıyı buharlaştırın. Jel parçalarına 150 mikrolitre %50 asetonitril, %0.25 formik asit ekleyin. 37 derecede 30 dakika çalkalayarak inkübe edin.

Sıvıyı, bir dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleme ile kısmen kurutulmuş plakaya toplayın. Bir sonraki adımı gerçekleştirirken plaket içeren peptitleri buharlaştırmaya devam edin. Peptit çözeltilerini yıkanmış santrifüj filtrasyon plakasına aktarın.

Peptitleri toplamak için altına temiz bir konik alt plaka yerleştirin ve plaka yığınını daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Kuyular tamamen kuruyana kadar konik alt plakadaki sıvıyı buharlaştırın. Kuruduktan sonra, plaka silikon bir kapakla kapatılabilir ve metin protokolünde açıklandığı gibi kütle spektrometresi ve veri analizi yapılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Mta2'nin mavi yerel PAGE migrasyon profillerinin hiyerarşik kümelenmesinden ve birlikte saflaştırıcı proteinlerden elde edilen temsili sonuçlar, burada bir dendrogram ve protein yoğunluklarını temsil eden bir ısı haritası olarak gösterilmektedir. Mta2'nin göç profili, iki farklı kompleksin göstergesi olan iki tepe noktası göstermektedir. Bazı NuRD alt birimleri, daha düşük moleküler ağırlıklı düzenekte en yüksek bolluğa sahip benzer bir model gösterir.

Buna karşılık, diğer NuRD alt birimleri, daha yüksek moleküler ağırlıklı NuRD düzeneğinde daha bol miktarda bulunur. Öte yandan, Mta2 etkileşimcisi, Cdk2ap1, yalnızca daha yüksek moleküler ağırlıklı NuRD düzeneğinde bulunur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik iki buçuk gün içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, protein komplekslerinin ayrışmasını önlemek için tüm numuneleri ve reaktifleri buz üzerinde tutmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedür, doğal koşullarda rekabetçi elüsyon ile afinite ortamından bakılabilmesi şartıyla, ilgilenilen herhangi bir proteine uygulanabilir. Bu prosedürü takiben, tanımlanan alt kompleksleri doğrulamak için ters veya sıralı ko-immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.