Name: Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Öğrenin mavi yerli PAGE ve protein ilişkisi profil yöntemiyle afiniti saflama kullanarak protein komplekslerini çözümleme. Bu yöntem, protein etkileşim verilerine organizasyonel bilgi ekler ve basit, yüksek çözünürlüklü analiz sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Wellcome Trust (WT098051) tarafından finanse edilmiştir.

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada, protein kompleksleri çözmek için niceliksel kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde mavi ile doğal jel elektroforezi, ardından afinite saflaştırma kullanılmasını tarif eder. Bu yaklaşım, fonksiyonel protein takımlar halinde tek boyutlu protein etkileşim listeleri aydınlatmak için bir yöntem sunmaktadır. Bu epitop etiketli proteinlerin kullanımına dayalı bir yöntemi göstermektedir. etiketli proteini eksprese eden bir hücre çizgisi mevcut değildir, ancak alternatif, ilgi konusu proteine ​​karşı antikorlar kullanmak için, doğal rekabet elüsyon elde etmek için uygun bir peptit olması koşuluyla olabilir. Başlatıcı madde ve boncuk miktarı miktarı, hedef proteinin ekspresyon düzeyi ile ilgili olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Normal olarak, başlangıç malzemesi 2-5 8 x 10 hücreleri ile bu protokolü gerçekleştirmek ve bu daha düşük bir ifade seviyesine sahip proteinler için yeterlidir. liziz tamponu bileşimi elde etmek için ampirik olarak seçilmelidiryakın yem çözünürleşmesini tamamlayın. Bu bağlanma, özellikle kromatin veya zar proteinleri, proteinlerin bazı türleri için zor olabilir. Alternatif seçenekler çalışılan protein kompleksi, yüksek tuz veya kromatin bağlayıcı proteinler, 20, 29 için sonikasyon ve / veya nükleaz işlemi kullanılarak stabil olması koşuluyla, tuz miktarı artan içerir. Membran proteinleri durumunda, DD veya digitonin deterjan geçiş 30 tavsiye edilebilir. DNA bağlama proteinleri durumunda, saflaştırma aşaması 20 esnasında benzonaz gibi bir nükleaz dahil etmek yararlıdır. Nükleik asitlerin tamamen çıkarılması tespit etkileşimleri proteinler arasında oluştuğu ve DNA tarafından aracılık olup olmadığını kontrol eder. Bu yaklaşımı kullanarak araştırma altındaki kompleksin kararlılığı olduğunda kritik bir unsur dikkate. usul, çok uzun ve preservin kapsayabilirg protein kompleksi gece boyunca karıştırılmıştır. İki kromatin yeniden modelleme kompleksleri (D. Bode ve M. Pardo, veriler gösterilmemiştir) ile iyi bir başarı elde etmiş, fakat bu değerlendirilmelidir. Gerekirse burada afinite arıtma aşaması kısalabilir. Bu tür, boyut dışlama kromatografisi gibi doğal fraksiyonasyon izin alternatif teknikler, geniş bir protein kompleksleri karakterize etmek için 50 yıldan fazla bir süredir kullanılmaktadır. Bu, diğerleri mavi doğal PAGE çözünürlüğü boyut dışlama kromatografisi 20, 31, 32, 33 kullanılarak elde edilene göre daha üstün olduğunu göstermiştir. mavi doğal PAGE bir diğer avantajı da pahalıdır kromatografi sistemleri, gerektirmediğini, ancak yerine laboratuvarlarda yaygın protein elektroforetik ekipman kullanır. açısından uygulamalı zaman, bu yöntem geleneksel GELC-MS / MS a daha çok işim içermezpproach veya çevrimdışı kromatografik ayırma. En fraksiyonasyon teknikleri gibi Ancak, onların çözümüne bir sınırı vardır. çok homojen veya kütle ve şekil olarak yakın Kompleksleri mavi doğal PAGE tarafından sunulan çözünürlük ve paylaşılan alt birimleri ile ayrı kompleksleri çözümünde evrensel başarılı olmayabilir aşağıda bildirildiği gibi dolayısıyla protokol ötesinde olabilir. Umut verici bir şekilde, üç alt-birimleri (M Pardo hazırlama yazısı) paylaşan iki çok benzer tetramerik komplekslerin ayrılması başarılı olmuştur. kütle spektrometresi giderek duyarlı hale gelmiştir beri spesifik olmayan interactors ve kirletici maddelerin dahi dakika miktarları AP-MS örneklerinde tespit edilebilir. Burada sunulan bir yaklaşım daha yüksek moleküler ağırlıkta yem taşıma zirve noktaları ile çakışmaktadır göç pikleri ile protein almaya odaklanarak afinite saflaştırma arka plan kirlenme gerçek interactors ayrımı da yardımcı olabilirmonomerik protein. Birkaç grup, önceki izolasyon 10, 11, 12, 34 ihtiyaç olmaksızın hücresel ölçekte protein kompleksleri tanımlamak için, protein korelasyon profil ardından ayırma tekniği kullanılmıştır. Ancak, bu alt stokiyometrik etkileşimlerini tespit etmek için başarısızlıkla sonuçlanabilir. afinite saflaştırma ile bir zenginleştirme aşamasının dahil edilmesi, bu üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Burada tarif edilen bir yaklaşım, belirli bir protein, aynı hücre kapsamında yer alır birden fazla kompleks protein kompleksleri topoloji keşfetmek ve çözülmesi için genel olarak kullanışlı olmalıdır. strateji, protein kompleksleri gidermek için pahalı kromatografik parçalanma ekipmana sahip olmayabilir laboratuvarlara basit ve elverişlidir.

hücrelerde, pek çok protein geçici protein-protein etkileşimleri yoluyla veya stabil protein düzeneklerinin oluşturulması suretiyle işlevleri yerine getirir. Protein etkileşimleri belirlemek tamamen anlaşılması hücresel süreçleri için çok önemlidir. kütle spektrometrisi (AP-MS) ile kombinasyon halinde afinite saflaştırma doğal protein etkileşimlerini tespit etmek için en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Son on yılda elde enstrüman yetenekleri önemli gelişmeler bu yaklaşımın son derece güçlü hale getirmiştir. AP-MS deneyler tarafından tespit etkileşimleri yem ve onlardan beslenen arasındaki doğrudan ve dolaylı dernekler bir karışımını içermektedir dikkat etmek önemlidir. Buna ek olarak, genellikle proteinler farklı biyolojik rollere sahip olabilir aynı hücresel kapsamında çeşitli kompleksler yer alır ve bu nedenle, AP-MS ile tespit edilir uygulayıcıların farklı protein montajlar veya işlevsel birimlerin bir karışımı temsil edebilir. Türetmek mümkün değildirörneğin topolojik bilgi, basit AP-MS deneyi ile oluşturulan proteinlerin mono- boyutlu listelerden önsel. Ancak, bu teknik, bu derlemeler gidermek için, bir ya da daha fazla yöntem ile birleştirerek protein kompleksleri mimarisini tanımlamak için daha fazla kullanılabilir. AP-MS yoluyla tespit protein etkileşimleri topoloji çözmek amacıyla, çeşitli stratejiler uygulanmıştır. Bir yaklaşım, yemler 1 ile deneyler önceki turunda tanımlanan avlar iteratif AP-MS deneyler sağlamaktır. çok bilgilendirici olsa da, bu hem deneysel hem de analitik oldukça emek yoğun bir iştir. Kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde protein çapraz bağlanma artan protein kompleksleri, 2, 3, 4, 5 topolojik bilgi elde etmek için kullanılıyor. Ancak, computatioçapraz bağlı peptitlerin nihai analiz yine zor bir görev kalır ve bu nedenle, iş akışında darboğazdır. MS-yarılabilir çapraz-bağlama maddeleri gelişi proteinleri 6, 7 etkileşimde yakın amino asit artıklarının eşleme kolaylaştırmalıdır. Başka bir alternatif önce ortogonal ayırma teknikleri 8, 9 ile afinite saflaştırmasını birleştirmektir. Jel filtrasyonu ya da iyon değişimi ya da sukroz gradyanlı fraksiyonasyonu ile kromatografik ayırma yakın zamanda by-pass karmaşık izolasyon aşaması 10, 11, 12, 13, bir sistem genelinde düzeyde multiprotein komplekslerini tarif kantitatif kütle spektrometrisi ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), yaygın olarak uygulanmıştırdoğal protein etkileşimleri, mitokondriyal membran protein kompleksleri 14 kapsayan, genel olarak bu araştırmak. Bu ayırma tekniği de son zamanlarda mitokondriyal kompleksleri 15 üzerinde sadece etiket serbest protein miktarının ve korelasyon profili ile kombinasyon halinde kullanılan 16, 17, aynı zamanda, 19, bütün hücreler 18 diğer protein kompleksleri çözülmesi için. Biz daha sonra doğal fraksiyonasyon yaklaşımları ve kantitatif MS ile afinite saflaştırma kombinasyonu belirli bir protein ihtiva eden birçok protein tertibatları çözmek için yararlı bir strateji sağlamalıdır varsayıldı. Burada kantitatif kütle sp ardından izole komplekslerinin mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi ile genel epitop bazlı afinite saflaştırmasını eden bir yöntem, tarifectrometry ve protein korelasyon profil, bir protein dahil olabilir birden çok derleme çözmek için. Bu, bir epitop ucuna birleştirilen bir ilgi, bir protein, fizyolojik bolluk yakın elde etmek ve etkili bir yerli sağlamak için endojen mahalden türetilmektedir ifade edilir, fare embriyonik kök hücreleri kullanır karmaşık izolasyonu. Bu yaklaşım, bir protein, geleneksel GELC-MS 20 den daha fazla çalışma gerektiren iken, aralarındaki korelasyon profillerine göre farklı takımlar halinde çözdürerek, yürütmektedir birden çok etkileşimi unravels.

<table><tbody><tr><td>Protein G Dynabeads</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>BAYRAK antikoru M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, protein sınıfı, %10 çözelti</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil pimelimidat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0.2 M Trietanolamin tamponu, pH 8.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x BAYRAK peptit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE %3-12 Bis-Tris jel</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Çalışan Tampon</td> Yaşam <td>Teknolojileri</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Katot Katkılı</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x NativePAGE numune yükleme tamponu</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE %5 G-250 numune katkı maddesi&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc konik tabanlı 96 oyuklu plaka, polipropilen</td><td>Termo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Çok Ekranlı HTS 96 kuyulu filtrasyon sistemi</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96 kuyulu kapaklı doğal</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitril, HPLC sınıfı</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, sıralama derecesi</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (yazılım)</td><td>NA</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (yazılım)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

mavi yerli page ve protein İlişkisi profil yöntemi ile affinity saf protein kompleksler çözümleniyor

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Çoğu protein diğerleriyle birlikte hareket eder; bu nedenle, biyolojik süreçleri tam olarak anlamak için bu fonksiyonel birimleri karakterize etmek çok önemlidir. Kütle spektrometresine (AP-MS) bağlı afinite saflaştırması, protein-protein etkileşimlerini tanımlamak için tercih edilen yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, geleneksel AP-MS çalışmaları protein etkileşimleri hakkında bilgi sağlar, ancak organizasyonel bilgi kaybolur. Bu sorunu ele almak için, kütle spektrometresi ile karakterizasyonlarından önce afinite ile saflaştırılmış protein komplekslerini çözerek, bir proteinin dahil olabileceği farklı fonksiyonel düzenekleri çözmek için bir strateji geliştirdik. Bir epitop etiketi ve rekabetçi elüsyon kullanılarak bir yem proteininin afinite saflaştırılması yoluyla izole edilen protein kompleksleri, mavi doğal elektroforez yoluyla ayrılır. Kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak korelasyon profili oluşturma yoluyla protein göç profillerinin karşılaştırılması, etkileşen proteinlerin farklı moleküler varlıklara atanmasına izin verir. Bu yöntem, jel filtrasyonu gibi geleneksel kromatografik tekniklerle çözülemeyebilecek yakın moleküler ağırlıklara sahip protein komplekslerini çözebilir. Konvansiyonel AP-GELC-MS/MS'den biraz daha fazla çalışma ile, bu stratejinin birçok durumda protein etkileşimlerini tanımlamak için eş zamanlı olarak protein kompleksi topolojik bilgisi elde etmek için yeterli olabileceğini gösteriyoruz.

Kütle Spektrometresi Afinite arıtma Mavi doğal protein Korelasyon profil iş akışı (ABC-MS), bir strateji, Şekil 7&#39;de tasvir edilmiştir. ilgi konusu bir proteinin yaklaşık yerel protein kompleksleri (bu durumda FLAG) bir epitop etiketine karşı antikorlar kullanılarak afinite saflaştırma ve rekabetçi elüsyon ile izole edilir. kompleksleri BN-PAGE ile çözülür ve bütün jel şeridi 48 bölüme eksize edilir, ve av tüfeği LC-MS / MS için hazırlanmıştır. Kantitatif MS bilgileri mavi doğal ayırma boyunca tespit edilen her bir protein için bir geçiş profili oluşturmak için kullanılır. etkileşen proteinler, üst üste zirveleri ile bir tat karmaşık görüntüleme içindeki göç profillerini oluşturulur. ilgi konusu bir proteinin birden fazla montaj yer alır, birden fazla tepe noktası, kendi göç profilinde görülmektedir alt kompleksleri mavi doğal jel çözme gücü dahilindedir verilmiştir. mig sistematik karşılaştırılmasırasyon profilleri hiyerarşik kümeleme kullanarak profilleme protein korelasyon elde edilebilir. Dendrogramını ve fraksiyonlar için tepe yoğunlukları farklı protein kompleksleri ait proteinler (Şekil 8) etkileşimde tanımlanmasını kolaylaştıran bir ısıyla harita içinde görülür. Biz Mta2, kompleks 20 yeniden modelleme nurd kromatin bir çekirdek alt biriminin etkileşim ortakları analiz etmek için bu stratejiyi kullandı. Şekil 9&#39;da gösterildiği gibi, Mta2 göç profili yüksek bolluk gösteren aşağıdaki kütle tepe, 700 kDa ve 1.2 MDA arasındaki belirgin yoğunluklarının iki tepe sergiledi. MTA1 / 3, HDAC1 / 2 ve Mbd3 dahil olmak üzere diğer nurd çekirdek alt birimleri, alt birimler, yani Chd4 bazı piklerin olsa aynı ayırma paternini b Gatad2a ve / Rbbp4 / 7, (Şekil 9A ters bolluk dağılım B). Buna karşılık, Cdk profili2ap1 Wnt gen promoteri 23 nurd kompleks düzelir bir düzenleyici faktör, sadece yüksek kütle zirve (Şekil 9C) görüntülenir ve böylece Sall4 da nurd 20, 24, 25 bağlandığı gösterilmiş olan bir transkripsiyon represör yaptı. Bu nedenle, mavi doğal PAGE ile afinite saflaştırılmış Mta2 ilişkili proteinlerin parçalanması nurd kompleksinin iki farklı şeklini çözmek mümkün oldu. ABC-MS de özel protein kişiler bunları atanmaktadır yeni interactors tanımlanmasına izin verir. Bir ısı harita temsil proteinler kümeleri ve fraksiyon yoğunluklarının incelenmesi sayesinde iki nurd p ile çakışan iki göç zirveleri gösteren nurd alt birimleri ve Wdr5 ile Wdr5, MLL metiltransferaz kompleksi 26 bir düzenleyici alt birimi, arasında güçlü bir ilişki tespitWdr5 ve nurd arasında yeni bir etkileşim olduğunu eaks (Şekil 8). Bu, boyut dışlama kromatografisi 20 eş-immünopresipitasyon ve ikili göç ile bu etkileşimi doğruladı. Hiyerarşik kümeleme mesafe metrik hesaplaması seçimi kümeleri ve dolayısıyla korelasyon şeklini etkileyecektir. Biz proteinin veya kompleksin mevcut etkileşim bilgisi ile en iyi uyum elde etmek için farklı ölçümlerin denemeler yapmanızı öneririz. Genellikle Manhattan (L1) mesafe metriği 20 ile en iyi sonuçlar elde edilmiştir. Pearson korelasyon veya bir Öklid mesafe ölçümlerini alternatif ayırma teknikleri 10, 11, 12 göre kompleksler belirlenmesi için rapor edilmiştir. quanMavi doğal fraksiyonlardan elde edilen titative MS verileri, aynı zamanda protein kompleksleri stokiyometri belirlemek için kullanılabilir. IBAQ (yoğunluk göre mutlak miktar) değeri olarak belirlenen proteinler 27, 28 nispi bolluk bir ölçüsünü sağlar. bir geçiş profili tepe içindeki tüm fraksiyonlarda protein kompleksi üyeleri için iBAQ değerleri göreceli miktarlarını elde etmek için yem proteinin normalize edilir. Belirli bir protein kompleksi üyesi için bir profil zirve boyunca normalize iBAQs yatay bir seyir takip etmeli ve trend değerleri yem proteine ​​göre etkileşim proteinlerin stokiyometrisini yansıtmaktadır. Stokiyometri hesaplamalar daha ayrıntılı bir gösterimi için, 20 bkz. <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Şekil 7: Şematik akışı özetleyen ABC-MS strategy. Bu rakam 20 ile modifiye edilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Mta2 interactors BN-PAGE migrasyon profilleri Şekil 8. Hiyerarşik kümeleme. Mta2 ilişkili proteinler göç profilleri benzerliğine göre kümelenmiş. Sadece nurd kompleksi içeren ısı-haritasının bir alt (mavi bir kutu içine) gösterilmektedir. Sarı kutu nurd kompleksi ile Wdr5 güçlü bir korelasyon vurgulamaktadır. açıklamalı moleküler ağırlıklar aynı jel içinde Protein standartlarının geçiş mesafeleri tahmin edilmiştir. Bu araştırma, başlangıçta Biyokimya ve Mo için 20 Amerikan Derneği Moleküler ve Hücresel Proteomics yayımlandı<html> lecular Biyoloji. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Nurd alt birimleri ve ilişkili proteinlerin Şekil 9. BN-PAGE göç profili. A) benzer yoğunlukta bir model mevcut Mta2 ve nurd alt birimi. B) ters yoğunluk desenli Mta2 ve nurd alt birimi. Sadece yüksek molekül ağırlıklı nurd bir oluşum halinde, C) Mta2 ve Cdk2ap1. açıklamalı moleküler ağırlıklar Protein standartlarının göç profili tahmin edildi. Bu araştırma, başlangıçta Moleküler ve Hücresel Proteomics 20 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society yayımlandı.&quot;_blank&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın. <img alt="Ek Dosya" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Ek veriler: Örnek veri kümesi. bir ABC-MS deneyinde protein tanımlamalar miktar değerleri içeren proteingroups.txt dosyasını MaxQuant türevi. Bu araştırma, başlangıçta Moleküler ve Hücresel Proteomics 20 Biyokimya ve Moleküler Biyoloji American Society yayımlandı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.</a>

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Bu deneysel stratejinin genel amacı, afinite ile saflaştırılmış protein komplekslerinin mavi doğal poliakrilamid jel elektroforez fraksiyonlaması ve kütle spektrometrisi korelasyon profillemesi aracılığıyla, bir proteinin dahil olabileceği farklı fonksiyonel düzenekleri belirlemektir. Bu yöntem, afinite saflaştırma kütle spektrometrisi deneyleri tarafından oluşturulan protein listelerine organizasyonel bilgiler eklemeye yardımcı olabilir. Bu prosedürün temel avantajları; uygulanmasının basit olması, çözünürlüğünün iyi olması ve geleneksel jel CMSMS'den biraz daha fazla çalışma gerektirmesidir.Bu protokol, endojen düzeylerde FLAG etiketli bir protein eksprese eden 200 ila 500 milyon hücreden protein komplekslerinin saflaştırılması için optimize edilmiştir. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre peleti çözüldükten sonra, hücre süspansiyonuna DTT ve proteaz inhibitörleri içeren beş mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ekleyin ve karıştırmak için dairesel hareketlerle sallayın. Süspansiyonu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.Hücre süspansiyonunu soğuk bir homogenizatöre aktarın. Belirgin bir viskozite kalmayana kadar dar havan eli kullanarak 20 ila 30 darbe ile hücreleri lize edin, ardından homogenatı soğuk mikro santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri santrifüj ettikten sonra, yaklaşık 50 microliters lizatı geride bırakarak berraklaşmış lizatı temiz soğuk bir tüpe aktarın.Protein konsantrasyonunu ölçmek ve saflaştırmayı izlemek için 35 µL'lik bir lizat alikotu ayırın. Ardından, önceden hazırlanmış boncuklardaki tamponu uzaklaştırın. Boncukları bir mL lizat ile yeniden süspanse edin ve ardından lizatın geri kalanıyla karıştırın.Karışımı, dönen bir tekerlek üzerinde 4 °C'de bir ila iki saat inkübe edin. Boncukları bir mıknatıs yardımıyla tüpün kenarında toplayın. Süpernatanttan 30 µL'lik bir alikot alın ve geri kalanını atın.Boncukları, dört ila altı kez pipetleyerek 0.5 milliliters IPP150 tamponu içerisinde yeniden süspande edin. Ardından, süspansiyonu 1.5 milliliters soğuk bir tüpe aktarın. Sonrasında, boncukları 0.5 milliliters FLAG elüsyon doğal tamponu ile üç kez yıkayın.Son yıkama ile birlikte boncukları yeni bir soğuk tüpe aktarın. Tampon çözeltiyi tamamen uzaklaştırın. Boncukları, doğal elüsyon tamponu içindeki 100 µL 200 µg/mL 3X5 peptit içerisinde yeniden süspande edin.Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca hafif rotasyonla inkübe edin. Boncukları mıknatıs yardımıyla toplayın ve süpernatantı soğuk, yeni bir tüpe aktarın. Tüm elüatları almadan önce bu adımı iki kez tekrarlayın.Elüatı, 4 °C'de 10,000 ×g santrifüjle bir santrifüj filtre ünitesinde 25 µL'ye kadar konsantre edin. 25 µL konsantre elüata 4X natif örnek yükleme tamponu ve %0,5 G-250 örnek katkısı ekleyerek örneği hazırlayın. Örneği ve natif moleküler ağırlık markerlarını, aralarında bir boş kuyucuk bırakarak yükleyin.Ardından, tüm boş kuyucuklara 10 ila 20 µL 1X native örnek yükleme tamponu yükleyin. Katot odasını, örnekleri rahatsız etmemeye dikkat ederek 200 mL 1X native PAGE koyu mavi katot tamponu ile doldurun. Anot odasını 550 mL 1X native PAGE anot tamponu ile doldurun.Jeli 150 volt değerinde 30 dakika boyunca çalıştırın. Çalışmayı durdurduktan sonra, koyu mavi katot tamponunu serolojik bir pipetle çekip alın ve yerine 1X açık mavi katot tamponu ekleyin. Çalışmayı 60 dakika daha sürdürdükten sonra jel kasetini açın ve kaset plakalarından birini atın.Jel, diğer kaset plakasına yapışık kalır. Jeli, üzerini örtecek kadar fiksasyon çözeltisi içeren bir tepsiye yerleştirin ve hafifçe çalkalayarak 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, fiksasyon çözeltisini uzaklaştırın ve jeli taramadan önce yerine su ekleyin.Kütle spektrometrisi hazırlığı için, öncelikle atıkları toplamak amacıyla konik tabanlı bir 96 kuyucuklu plakayı başka bir 96 kuyucuklu plakanın üzerine yerleştirin. Konik tabanlı 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarının tabanını 21 gauge bir iğne ile delin. Ardından, delinmiş plakanın kuyucuklarına 200 µL %50 asetonitril, %0,25 formik asit ekleyin.Plaka yığınını bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin. Ardından, sıvının deliklerden geçerek atık toplama plakasına akması için plakayı 500 ×g'de bir dakika santrifüjleyin. Yıkama adımlarını iki kez tekrarladıktan sonra, delikli 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarını 150 µL 50 mM amonyum bikarbonat ile doldurun.Ardından, jeli temiz bir yüzeye yerleştirin. Örneği içeren şeridi 48 özdeş dilime ayırın. Jelin üst kısmındaki son beş dilim hariç, her bir dilimi iki veya üç daha küçük parçaya bölün.Her bir dilimi, delikli uçları yıkanmış 96 kuyucuklu plakanın kuyucuklarına sırayla yerleştirin. Her bir kuyucuğa 50 µL acetonitrile ekleyin ve plakayı çalkalayarak 30 ila 60 dakika inkübe edin. Santrifüj ile sıvıyı uzaklaştırdıktan sonra, her bir kuyucuğa 200 µL 2 mM TSEB ve 50 mM amonyum bikarbonat ekleyin.Plakayı, daha önce olduğu gibi santrifüj ile sıvıyı uzaklaştırmadan önce, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakın. Jel parçalarına 200 microliters saf asetonitril ekleyerek onlarıye dehidre edin ve jel parçaları beyaz ve opak hale gelene kadar oda sıcaklığında 20 minutes çalkalamalı inkübe edin. Asetonitril uzaklaştırıldıktan sonra, her kuyucuğa soğuk amonyum bikarbonat içerisinde 150 microliters tripsin ekleyin.Plakayı 37 °C'de iki saat boyunca çalkalamalı inkübasyona tabi tutun. Ardından, plakaların doğru yönlendirmesini sağlayarak, jel içeren plağın altına temiz, konik tabanlı bir plak yerleştirin. Daha sonra, peptidleri içeren sıvıyı 200 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj ederek toplayın.Peptit içeren plakayı bir santrifüj evaporatöre yerleştirin ve bir sonraki adımı gerçekleştirirken sıvıyı evaporate edin. Jel parçalarına 150 µL %50 asetonitril, %0,25 formik asit ekleyin. 37 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayarak inkübe edin.Sıvıyı, 200 ×g'de bir dakika boyunca santrifüj ederek kısmen kurutulmuş plakada toplayın. Bir sonraki adımı gerçekleştirirken peptid içeren plağın buharlaştırılmasına devam edin. Peptit çözeltilerini yıkanmış santrifüj filtrasyon plağına aktarın.Peptitleri toplamak için altına temiz, konik tabanlı bir plaka yerleştirin ve plaka düzeneğini daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Konik tabanlı plaktaki sıvıyı, kuyucuklar tamamen kuruyana kadar buharlaştırın. Kuruduktan sonra plaka, silikon bir kapakla kapatılabilir ve metin protokolünde açıklandığı şekilde kütle spektrometrisi ve veri analizi yapılana kadar -20 °C'de saklanabilir.Mta2 ve beraber saflaşan proteinlerin mavi doğal PAGE migrasyon profillerinin hiyerarşik kümeleme analizinden elde edilen temsili sonuçlar, burada bir dendrogram ve protein yoğunluklarını temsil eden bir ısı haritası olarak gösterilmiştir. Mta2'nin migrasyon profili, iki farklı komplekse işaret eden iki pik göstermektedir. Bazı NuRD alt birimleri, en yüksek bolluğun daha düşük moleküler ağırlıklı kompleks yapıda olduğu benzer bir örüntü sergilemektedir.Buna karşılık, diğer NuRD alt birimleri yüksek moleküler ağırlıklı NuRD kompleksinde daha bol miktarda bulunur. Öte yandan, Mta2 etkileşimcisi olan Cdk2ap1, yalnızca yüksek moleküler ağırlıklı NuRD kompleksinde mevcuttur. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, iki buçuk günde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, protein komplekslerinin ayrışmasını önlemek için tüm numunelerin ve reaktiflerin buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedür, natif koşullarda kompetitif elüsyon ile afinite ortamından incelenebildiği sürece, ilgilenilen herhangi bir proteine uygulanabilir. Bu prosedürün ardından, tanımlanan alt kompleksleri doğrulamak için ters veya ardışık ko-immünopresipitasyon gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

resolving-affinity-purified-protein-complexes-blue-native-page

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

Kütle spektrometrisi (antipersonel mayınları) ile kombinasyon halinde etiketli proteinlerin saflaştırılması Affinity protein etkileşimi ağların sistematik eşleme için ve biyolojik süreçlerin mekanistik temeli araştırmak için güçlü bir yöntem. Burada, bakteri için geliştirilmiş optimize edilmiş sıralı peptid afinite (SPA) antipersonel mayınları prosedürü...

Protein Kompleksi belirlenmesi<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Tandem Kütle Spektrometresi ile Kombine Sıralı Peptid Affinity Arıtma kullanarak

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Burada, bir kriyojenik sıcaklıkta katı hal öğütme ile memeli hücrelerin bozulması Elde edilen hücre tozu, bir hücre, ekstrenin üretilmesi ve antikor-bağlı mikron çaplı paramanyetik taneler üzerine afinite yakalama ile ilgili protein kompleksleri izole etmek için protokoller tarif eder.

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Bu makale, bir 6X-histidin etiketi ile etiketlenmiş bir insan rekombinant proteini olan flep endonükleaz 1'in (FEN1) afinite saflaştırılması için bir prosedür sağlar. Protokol, etiketli proteinin saflaştırılması için iki farklı hareketsizleştirilmiş metal iyon kolonunun kullanılmasını içerir.

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması 

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin mavi yerli PAGE ve protein ilişkisi profil yöntemiyle afiniti saflama kullanarak protein komplekslerini çözümleme. Bu yöntem, protein etkileşim verilerine organizasyonel bilgi ekler ve basit, yüksek çözünürlüklü analiz sağlar.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Daha fazla video keşfet