Name: Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Öğrenin, farelerde biyolüminesans görüntüleme ile akciğer inflamasyonunu gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, aynı hayvanların tekrarlanan değerlendirmelerine olanak tanır ve solunum hastalıklarındaki konak-patojen etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İtalyan Kistik Fibroz Vakfı Projesi FFC # 18/2013, FFC # 29/2015 tarafından ve İtalyan Kistik Fibroz Ligi tarafından Veneto Şube Müdürü Veneta Lotta Contro la Fibrosi Cistica Onlus tarafından desteklendi.

Tarif edilen hayvan deneyleri, Verona Üniversitesinde Deneysel Araştırmalar Servisi Dairelerarası Merkezi tarafından hayvan deneyleri için yerel hayvan refahı komitesi tarafından onaylandı ve Avrupa Yönergesi 2010/63 UE, İtalyan D.Lgs 26/2014 ve revize edilmiş &quot;Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Rehber&quot;, Washington, DC: National Academy Press, 1996. Bu protokol ve deney Ulusal Sağlık Enstitülerince onaylandı (n 273/15). Hayvanlar, standart kemirgen tavuğuna ve yumuşatılmış musluk suyuna serbestçe girdiler ve lokal vivaryum koşullarına (oda sıcaklığı: 20 - 24 ° C, bağıl nem:% 40 - 70, açık-karanlık döngü: 12 saat) en az 5 gün boyunca uyum sağladılar. ) Herhangi bir tedaviden önce. 1. In Vivo Gen Dağıtımı <ol><li> İn vivo dağıtım reaktifi / nükleik asit komplekslerini hazırlamak için bir laminer akış başlığı kullanın. </li><li> Deney protokolünü a veNd parametreler üreticinin in vivo talimatlarını izleyerek. <ol><li> Fare başına toplam 200 μL kompleks enjeksiyon hacmi kullanın. </li><li> Endotoksin içermeyen suya asılı 40 μg DNA ile başlayın; Optimizasyon aralığı 60 μg&#39;a ulaşabilir. NOT: Enjeksiyon hacmindeki nükleik asidin nihai konsantrasyonu üreticinin talimatlarına göre 0.5 μg / μL&#39;yi geçmemelidir. </li><li> 6 - 8 N / P oranı kullanın (nükleik asit μg başına 0,12 - 0,16 μL iletim reaktifı). İlgili reaktif miktarını hesaplayın. NOT: Etkili hücre girişi için kompleksler katyonik olmalıdır. N / P oranı, nükleik asit fosfat (P) başına in vivo doğum reaktifi üzerindeki nitrojen artıkları sayısı (N) olarak tanımlanır ve kompleksler içindeki iyonik denge ölçüsünü temsil eder. </li></ol></li><li> % 5 glukoz (nihai konsantre) içindeki nükleik asidin hesaplanan miktarını (adım 1.2.1&#39;e bakınız) sulandırınızRasyon)% 10 glukoz stok solüsyonu (sağlandı) ve steril su kullanılarak yapıldı. Seyreltme hacminin, son enjeksiyon hacminin yarısı olduğundan emin olun. Yavaşça girinti yapın veya aşağı yukarı pipet ile karıştırın. </li><li> Hesaplanan miktarı (bkz. Adım 1.2.3)% 10 glukoz stok solüsyonu (sağlanan) ve steril su kullanarak% 5 glikozun enjeksiyon hacminin yarısına (son konsantrasyon) seyreltin. 15 saniye boyunca 13.000 xg hızla girdaplayın ve döndürün. </li><li> Seyreltilmiş nükleik aside yukarıdaki seyreltilmiş dağıtım reaktiflerini bir kerede ekleyin. Onları hafifçe vorteksleyerek karıştırın ve 15 saniye süreyle 13.000 xg hızla bastırın. </li><li> Karışımı, adım 1.5&#39;deki oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. NOT: Bu noktadan itibaren, kompleksler oda sıcaklığında 4 saat ve 4 ° C&#39;de saklandığında 7 gün boyunca stabildir. </li><li> Oda sıcaklığında dengelenmiş kompleksleri kullanarak kuyruk-damar enjeksiyonları uygulayın. Damar genişlemesine izin vermek için fare kuyruğu sıcak suya (50 - 53 ° C) 30 saniye boyunca yerleştirilir. <ol><li> Fare tutucu cihazın içine yerleştirin. Kuyruk damarına 20-30 ° açı ile 27-30 gauge iğne yerleştirin ve yavaşça 200 mcL enjekte edin. Tamamlandıktan sonra, iğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesine baskı uygulayın. NOT: Enjeksiyon esnasında kuyrukta hafif bir çıkıntı, hatalı konumlamayı belirtir. Bu gerçekleşirse, iğneyi çıkarın ve prosesi bir önceki bölgeye yakın bir yerde tekrarlayın. </li></ol></li><li> İntravenöz enjeksiyondan 24 ve 48 saat sonra in vivo BLI (adım 2&#39;ye bakınız) uygulayarak gen ekspresyonunu görselleştirin. </li></ol> 2. In Vivo BLI NOT: Önceden, DPBS&#39;de 15 mg / mL D-luciferin içeren taze bir stok solüsyonu hazırlayın, 0.22 μm filtreleme birimi kullanarak filtre sterilize edin ve -20 ° C&#39;de saklayın. <ol><li> Fareleri açık pleksiglas anestezi odasına yerleştirin. İzofloran bölmesinin dolu olduğundan emin olun. Hayvanları anestezi etmeye hazır olduğunuzda, pompanın (lEft) ve oda (sağ) anahtarları açıktır. İndüksiyon için izofluran kadranını% 2.5&#39;e ve bakım için% 2&#39;ye çevirin. IVIS odasındaki hayvanlar, görüntü alımı sırasında% 2.5 izofluoran anestezisi altında tutulmaktadır. </li><li> Fareler tamamen anestezi edildikten sonra, görüntülemeden 15 dakika önce intraperitoneal bir yolla D-luciferase solüsyonundan 10 mL / kg vücut ağırlığı enjekte edin. NOT: D-luciferase uygulanmasından sonra sinyal tepe noktasının zamanını belirlemek için D-luciferase üzerinde kinetik bir çalışma yapılmalıdır. </li><li> In vivo görüntüleme sistemini açın ve bir siyah kart stoğu ile astarlayarak görüntüleme haznesini hazırlayın (tamamlandıktan sonra atın). Doğru anestezi için burun konilerini yerleştirin (fare başına bir koni kullanın). NOT: Anestezi cihazına besleyen tüp bölünür ve böylece aynı konsantrasyonda anestezi görüntüleme sistemi içerisindeki anestezi manifoldlarına bağlanır. </li><li> Farelerden (5&#39;e kadar) b&#39;denÖküzün görüntü sistemindeki manifolda bağlanan burun kozlarına sokun ve kapıyı kapatın. Görüntü alımı 5 dakika sürer. </li><li> Üreticinin yazılımını kullanarak aşağıdaki gibi bir BLI edinin. <ol><li> Yazılımı başlat. In vivo görüntüleme sistemi edinme kontrol panelinde Lüminescent&#39;ın yanında bir onay işareti koyun. Uyarıcı Filtresi ayarının Blok olduğunu ve Emisyon Filtresi ayarının Açık olduğunu doğrulayın. </li><li> Okları tıklatın: Lüminesans Görüntüleme Modu için, 5 dk. Pozlama süresi, Binning 8 ve F / Stop 1; Fotoğraf Görüntüleme Modu için Binning 4 ve F / stop 8&#39;i seçin. </li><li> Alan Görünümü açılır listesinden, D, 19 cm ve 1.5 cm&#39;lik bir Konu Yüksekliği seçin. Görüntüyü elde etmeye hazır olduğunda Kazanın&#39;ı tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü alımı tamamlandığında, fareleri tekrar kafeslerine yerleştirin. </li><li> Üreticinin yazılımını kullanarak belirli bölgelerden gelen fotonları nicelleştirin. <ol><li> Click <stRong&gt; ROI Araçları&#39;nı seçin. ROI Tools&#39;da , Type açılır listesinden Measurement ROI&#39;yi seçin. </li><li> Kare simgesini tıklayın ve bir hayvanın göğüs ağzını kapatacak uygun boyutlara sahip bir Kare ROI çizin. Aynı boyutlara sahip ROI&#39;ler edinmek için her bir hayvanın ROI&#39;sını kopyalayıp yapıştırın. ROI Tools panelinde, ROI&#39;lerdeki toplam yoğunluğun ölçümlerini elde etmek için ROI Ölçümünü tıklayın. </li><li> Bir oturum sırasında görüntüler veya dizilerde yaratılan tüm ROI&#39;ler için ROI Ölçümleri verilerine (bir satır başına bir ROI) dikkat edin. Dışa Aktar&#39;ı tıklayın ve dosyanın kaydedileceği klasörü seçin. </li></ol></li></ol> 3. Pro-Inflamatuar Stimuliler ile Fare Mücadelesi NOT: Pro-inflamatuar uyaranlarla fare meydan okumadan önce, i n vivo BLI ile bazal aktivasyonu kontrol edin (bkz. Adım 2). İn vivo gen aktarımı ve mous arasında en az 7 gün geçmesi gerekirHafif ve geçici inflamasyonun ortadan kalkmasına izin vermek için meydan okumak. <ol><li> Ekipmanı intrakrakeal instilasyon için hazırlayın ( Şekil 1 ve Şekil 2&#39;ye bakın ). <ol><li> 5 ml tek kullanımlık şırıngayı yay (C, E), 100 mcL&#39;lik bir şırınga (B) ve tek kullanımlık bir gösterge (D) ile 3 yönlü durdurma musluğuna (A) bağlayın. Sistemi desteği (H) üzerine yerleştirin. Sistemi desteği (H) üzerine yerleştirin. </li><li> PE190 mikro tıbbi tüpünü (F) tek kullanımlık gösterge (D) ve kalem yüzyılı (G) arasına bağlayın. </li><li> 5 mL&#39;lik şırıngayı 800 mcL hava ile doldurun ve 3 yönlü durdurma kancasını çevirin. NOT: 100 ul&#39;lik şırıngada 50 ul aspirasyon yapılarak tüp Pseudomonas aeruginosa kültür süpernatanı ile doldurulmalıdır . </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig1.jpg" /> Şekil 1: Şematik Temsilİntratrakeal Cihazın Tek Bir Bileşeninin Belirlenmesi. ( B) 100-μL Hamilton şırınga, (C) tek kullanımlık 5-mL şırınga, (D) tek kullanımlık gösterge, (E) yay ile tek kullanımlık 5-mL şırınga, (F) PE190 mikro tıbbi tüp , (G) kalem yüzyıl ve (H) destek. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55499/55499fig2.jpg" /> Şekil 2: Birleştirilen İntrakrakel Cihazın Temsili. Tanımlar Şekil 1&#39;deki ile aynıdır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55499/55499fig2large.jpg" target="_blank">lütfen tıklayın</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayın. <ol start="2"><li> Farelerde oksijen ile karıştırılmış% 2.5 izofluran ayarlanmış bir izofluran gazı bölmesini kullanarak anestezi uygulayın. </li><li> Anesteziklerin etkilerini 3-5 dakika sonra değerlendirmek için hayvanı izleyin. NOT: Farenin tamamen uyuşturulduğunu doğrulamak için aşağıdaki işaretleri dikkatli bir şekilde izleyin: yavaşlayan solunum hızı yavaşlar, boyun tarafından kaldırıldığında kol gerilmesi eksikliği ve arka bacaklar uyarıldığında tepki vermez. Birkaç dakika daha bekleyin ve bu ölçütler karşılanmazsa bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar kontrol edin. </li><li> Anestezi uygulanmış fareyi pleksiglas entübasyon platformuna yerleştirin, telin üzerine yerleştirilmiş dişleri ile asın. </li><li> Laringoskopu sol eliyle açın (sağdan araştırmacılar için) ve bir çift küt uçlu forseps alın. Laringoskop ucunu ve forsepsi kullanarak ağzını hafifçe kaldırın. </li><li> Dili dışarı çekin ve saatlerce çekin.Forseps kullanarak yanlara doğru kaldırın. Laringoskop bıçağını ağzın arkasına doğru yönlendirin. Trakea açılıncaya kadar laringoskopu 90 derecelik açıyla hafifçe bastırın. Laringoskopu yerine tutun. </li><li> Diğer eli kullanarak, PE borusunun ucuna bağlı olan iletim borusunu alıp trakea sokun. İnokulumu sağlamak için üç yönlü valfi döndürün. Tüpü trakea mümkün olduğunca çabuk çekin. Akciğerlere inokulumun inhale edilmesini sağlamak için fareyi birkaç saniye dik tutun. NOT: Trakea çok uzun süre engellenirse fare boğar ve ölür. </li><li> Fareyi platformdan çıkarın. İyileşme süresi suşlara göre değişebilir; İşlemden sonra 30 dakika içinde hayvanın tamamen uyanık olduğundan emin olarak fareyi dikkatlice izleyin. </li><li> Intraperitoneal olarak 150 mg / kg D-luciferase enjekte edin ve akciğerleri in vivo bir görüntüleme sistemi kullanarak intratrakeal&#39;den 4, 24 ve 48 saat sonra görüntüleyinUyarıcıların aşılanması. Üreticinin yazılımını kullanarak belirli bölgelerden gelen fotonları nicelleştirin. </li></ol>

<ol><li>Barnes, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+approaches+to+asthma-chronic+obstructive+pulmonary+disease+overlap+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes.</a> J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).</li>
<li>Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+inflammation+in+cystic+fibrosis%3A+molecular+mechanisms+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Airway inflammation in cystic fibrosis: molecular mechanisms and clinical implications.</a> Thorax. 68 (12), 1157-1162 (2013).</li>
<li>Dhooghe, B., Noel, S., Huaux, F., Leal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+in+cystic+fibrosis%3A+pathogenesis+and+novel+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation in cystic fibrosis: pathogenesis and novel therapies.</a> Clin Biochem. 47 (7-8), 539-546 (2014).</li>
<li>Durham, A. L., Caramori, G., Chung, K. F., Adcock, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+anti-inflammatory+therapeutics+in+asthma+and+chronic+obstructive+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted anti-inflammatory therapeutics in asthma and chronic obstructive lung disease.</a> Transl Res. 167 (1), 192-203 (2015).</li>
<li>Sagel, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biomarkers+of+airway+inflammation+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biomarkers of airway inflammation in cystic fibrosis.</a> Curr Opin Pulm Med. 9 (6), 516-521 (2003).</li>
<li>Starkey, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+infectious+exacerbations+of+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Murine models of infectious exacerbations of airway inflammation.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (3), 337-344 (2013).</li>
<li>Cacalano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+and+B+cell+expansion+in+mice+that+lack+the+murine+IL-8+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil and B cell expansion in mice that lack the murine IL-8 receptor homolog.</a> Science. 265 (5172), 682-684 (1994).</li>
<li>Simonet, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+impaired+neutrophil+migration+in+mice+overexpressing+human+interleukin-8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Long-term impaired neutrophil migration in mice overexpressing human interleukin-8.</a> J Clin Invest. 94 (3), 1310-1319 (1994).</li>
<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transiently+transgenized+mice+with+a+bovine+interleukin+8+%28CXCL8%29+promoter%2Fluciferase+reporter+construct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct.</a> PLoS One. 7 (6), e39716(2012).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+lung+inflammatory+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+and+its+modulation+by+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin.</a> J Transl Med. 13, 251(2015).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+lung+inflammation+in+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice.</a> J Transl Med. 14 (1), 226(2016).</li>
<li>De Simone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genetic+background+influences+the+response+to+the+opportunistic+Pseudomonas+aeruginosa+infection+altering+cell-mediated+immunity+and+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication.</a> PLoS One. 9 (9), e106873(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Önceki bir çalışmada 11 , bIL-8-Luc&#39;a bağlı BLI ve BAL işaretleyicileri arasında bir kontrast gösterildi. Fare suşları 12 içindeki duyarlılığın diferansiyel derecesine dayanırdı. Bu nedenle, bIL-8-Luc modelinin farklı bir fare suşuna uygulanması için, hem BLI hem de daha standart hale getirilmiş inflamatuvar belirteçler açısından inflamatuvar yanıta ilişkin ilk çalışma gereklidir. Fare transfeksiyonu hafif akciğer iltihabına ve DNA enjeksiy...

Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve bronşektazi gibi kronik akciğer hastalıkları hava yolu inflamasyonu ile karakterizedir. Hava yolu inflamasyonu ödem, hücresel infiltrasyon, T lenfosit ve mast hücresi aktivasyonu, artmış havayolu salgıları ve aşırı kollajen depozisyonu ile karakterizedir. CF çok sistemli bir hastalıktır ve mortalite ve morbiditenin başlıca nedeni akciğer bakteriyel enfeksiyonudur ve pulmoner alevlenme artar. Akciğer fonksiyonundaki azalma, 1 , 2 , 3 , 4 nispeten daha fakir sonuçlara yol açar. Solunum yollarının iltihaplanma durumu genellikle, balgam gibi alt ve üst hava yollarından türetilmiş materyalde inflamatuar süreç sırasında işe alınan immünolojik belirteçlerin değerlendirilmesiyle gözlemlenir ve değişken reska bul etmez. Bronkoskopiler de yapılır 5 . Murin modelleri, hava yolu inflamasyonu ile karakterize olan ve etkili tedaviler veya tedaviler henüz tanımlanmamış olan hastalıkların patogenezini ve evrimini araştırmak için değerli araçlardır. Akciğer enfeksiyonu ve enflamasyonunun hayvan modelleri, insan koşullarını taklit eden kimyasalların rolü ( örn., Sigara dumanı maruziyeti, LPS, elastaz, ovalbümin, poli I: C vb. De dahil olmak üzere astım ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır Yukarıdaki kombinasyonlar gibi) 6 . İnflamasyonla ilgili parametrelerin ölçümü, bakteriyel yük, akciğerlerdeki sitokinler ve toplanan bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvı gibi faktörleri ölçmek için invaziv yaklaşımlar gerektirdiğinden, hayvanların feda edilmesini gerektirir. Ayrıca, genellikle histolojik incelemeler gereklidir. Enflamatuar yanıt kinetiği hakkında bilgi edinme imkanı numErous fareler. Bu nedenle, hayvanları feda etmeye gerek duymadan bu tür bilgileri elde etmeye yarayan bir teknik, teknik, etik, ekonomik ve operasyonel üsler için değerlidir. IL-8 iltihaplanma sürecinde lökositleri iltihaplı dokuya sokmak için gerekli bir oyuncudur. Enflamatuar yol aktivasyonunun çalışması için moleküler okuma yazısıdır. MIP-2 ve KC, farelerde insan IL-8&#39;in işlevsel homologları olabilir. Fareler, insan CXCR2 7,8&#39;in bir homologu olan sadece bir potansiyel IL-8 reseptörünü ifade eder, ancak bir raportör geni tahrik eden bir heterolog IL-8 gen promotörünü modüle edebilmektedirler. Bir sığır IL-8 promotör / lusiferaz raportör yapısının farelerde transaktive edilebileceği gözleminden sonra yakın zamanda bir akciğer iltihabı murin modeli geliştirildi. Bu özellik, canlı yaşamda inflamatuvar cevabı izlemek için biyolüminesans görüntülemenin (BLI) kullanılmasına olanak tanırNimals 9 . Bu model bakteri exoproducts ( örneğin, LPS veya bakteri suşları tarafından salınan ürünler) veya TNFalpha 10 , 11 tarafından tetiklenen iltihap incelemek için uyarlanmıştır. İlaç keşfi süreci, CF, astım ve KOAH gibi akciğer hastalıklarını tedavi edebilen eski ve yeni anti-inflamatuar moleküllerin geliştirilmesi ve optimizasyonu üzerine odaklanmıştır. Bu yeni kimyasal varlıklar, akıllı klinik deneylerin tasarımını kolaylaştırmak için belirli klinik fenotiplerle bağlantılı olabilen hayvan modellerinde hızlı ve rahat bir şekilde test edilmelidir.

<table><tbody><tr><td>FMT 2500 Floresan Tomografi Sistemi</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina serie II Klinik öncesi In Vivo; Görüntüleme Sistemi</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 750 HIZLI</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10001EX</td><td>Işıktan koruyun, probu 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Dişi akraba BalbC</td><td>Harlan Laboratuvarları İtalya</td><td></td><td>Kullanımdan önce, hayvanlar en az 5 gün boyunca yerel vivaryum koşullarına alıştırıldı</td></tr><tr><td>bIL-8-Luc plazmid</td><td>Tıbbi Veterinerlik Bilimi Bölümü, Parma Üniversitesi, İtalya</td><td></td><td>Plazmidi -20 °C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>pGL3basic vektör</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td>Vektörü -20 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>JetPEI DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Polyplus transfeksiyon</td><td>201B-001G</td> DNA ve JetPEI karışımı, 7 D-lusiferin potasyum tuzu 1 g Perkin Elmer Inc.<td>'in nihai N/P oranı ile formüle edildi</td></tr><tr><td></td><td>.</td><td>122796</td><td>Işıktan koruyun, -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Living Image yazılımı</td><td>Caliper Life Sciences,</td> <td>Experimental Builder</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex Sitokin Test Kiti</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>M60-009RDPD</td><td>Açılmamış kiti 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr><tr><td>Penn-yüzyıl modeli DP-4M Kuru güç susturucu</td><td>Penn-century</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>Gaz anestezi sistemi XGI-8</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Deneysel Oluşturucu</td><td></td></tr><tr><td>PE190 mikro tıbbi boru</td><td>2biyolojik aletler snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>İğnesiz şırınga 5 mL</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>Pistonun levhalarını bir makasla kesin</td></tr><tr><td>Hamilton 0,10 mL (model 1710)</td><td>Gaz geçirmez</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3 Musluk</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>İğneli Şırınga 1 mL</td><td>Pic çözeltisi</td><td>3,071,260,300,320</td><td>İğnesiz kullanım</td></tr><tr><td>Plastik besleme tüpleri 18ga x 50 mm</td><td>2biyolojik aletler snc</td><td>FTP-18-50</td><td>Ucu eğik kesin&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bir il-8 geçici transgenize edilmiş fare modeli<emin vivo</em&gt; İnflamatuvar yanıtların uzun vadeli İzlenmesi

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Hava yolu inflamasyonu genellikle bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkilidir ve akciğer hastalığının önemli bir belirleyicisini temsil eder. Çeşitli faktörlerin iltihap önleyici yeteneklerinin in vivo olarak belirlenmesi zor ve bronkoalveoler lavaj ve in situ analiz için akciğerlerin çıkarılması gibi terminal prosedürleri gerektirir ve aynı farede uzunlamasına görselleştirme önlenir. Burada, akciğer iltihabı, heterolog bir IL-8 sığır promoterinin kontrolü altındaki lusiferaz raportör genini eksprese eden geçici olarak transgenize edilmiş farelerde Pseudomonas aeruginosa kültür süpernatantının (SN) intratrakeal instilasyonu yoluyla indüklenir. Akciğerdeki lusiferaz ifadesi, instilasyondan sonra 2,5 ila 48 saatlik bir zaman aralığında in vivo biyolüminesan görüntü (BLI) analizi ile izlenir. Prosedür 2 - 3 ay içinde birden fazla kez tekrar edilebilir, böylece aynı farelerde inflamatuvar yanıtı değerlendirmek mümkün olurHayvanları yok etme ihtiyacı var. Bu yaklaşım akciğerde etkili olan pro ve antiinflamatuvar faktörleri gerçek zamanlı olarak izlemeye ve fonksiyonel ve farmakolojik araştırmalara uygun görünmektedir.

BIL-8-Luc geçici transjenik fare modeli, salgılatılmış virülans faktörleri içeren konsantre bakteriel süpernatant (30x) ile uyarılan farelerde akciğer iltihaplanmasının in vivo olarak izlenmesi için kullanıldı. İndüklenen enflamatuar yanıt, in vivo görüntüleme ile BLI sinyalindeki bir artış olarak saptanabilirdi. Pro-inflamatuar aktivite instilasyondan 2.5 saat sonra açıkça saptanabilirken, BLI sinyali 5 ila 24 saat arasında en yüksek paya ulaştı ve hala 48 saatte sapta...

Burada açıklanan yöntem, non-invaziv biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla farelerin akciğerlerinde IL-8 promotöre bağlı inflamasyon aktivasyonunun görselleştirilmesine olanak tanır. Aynı hayvan lusiferaz muhabiri yapısının teslim edildiği andan itibaren iki aya kadar birden fazla kez BLI&#39;ye tabi tutulabilir.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli<emIn vivo</em&gt; İnflamatuvar Yanıtların Uzun Vadeli İzlenmesi

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Bu prosedürün genel amacı, bakteriyel kültür süpernatantı gibi pro-inflamatuar bir uyarıcı ile noninvaziv bir zorlama sonrası farelerdeki akciğer inflamasyonunu gerçek zamanlı olarak izlemektir. Bu yöntem, hangi bakteriyel ürünlerin solunum yolu enfeksiyon hastalıklarından sorumlu olduğu gibi konakçı-patojen etkileşimlerine ilişkin spesifik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, invaziv olmaması ve aynı hayvanların zaman içinde tekrar tekrar izlenmesine olanak tanımasıdır.Kurulum adımlarının yalnızca metin yoluyla öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi önemlidir. Prosedürü Francesca Ruscitti, Angela Sandri ve araştırma grubumun dış iş birlikçileri olan Federico Boschi uygulamalı olarak gösterecektir. In vivo gen iletimi için önce nükleik asit kompleksini oda sıcaklığına getirin.Ardından, deney hayvanının kuyruğunu 30 saniye boyunca 50 ile 53 °C arasındaki suda ısıtın. Kuyruk venleri genişlediğinde, fareyi uygun bir sabitleme cihazına yerleştirin ve 200 µL kompleksi enjekte etmek için 27 ile 30 gauge bir iğneyi, genişlemiş bir kuyruk venine 20 ile 30 derecelik bir açıyla yerleştirin. Toplam hacmin tamamı uygulandığında, iğneyi çıkarın ve enjeksiyon bölgesine basınç uygulayın.Yirmi dört ila 48 saat sonra, biyolüminesans görüntülemeden 15 dakika önce, tamamen anestezi altındaki karmaşık enjeksiyon yapılmış en fazla beş hayvana, kilogram başına 10 mililitre taze hazırlanmış D-Luciferin intraperitonal olarak enjekte edin. In vivo görüntüleme sistemini açın, görüntüleme haznesine bir parça siyah karton yerleştirin ve ardından fareleri görüntüleme haznesine yerleştirin. In vivo görüntüleme sistemi yazılımını açın ve sistemi başlatın.Lüminesans seçeneğini işaretleyin; ardından uyarım filtresinin bloklama (block) ve emisyon filtresinin açık (open) konumda olduğunu onaylayın. Lüminesans görüntüleme modu için beş dakikalık bir pozlama süresi, sekizli binning ve bir f-stop değeri seçin. Fotoğraf görüntüleme modu için ise dörtlü binning ve sekiz f-stop değeri seçin.Görüş alanı menüsü altından, 19 by 19 santimetrelik bir alana ve 1.5 santimetrelik bir denek yüksekliğine sahip D görüş alanını seçin. Tüm parametreler ayarlandığında, hayvanların görüntüsünü almak için Acquire seçeneğine tıklayın. Görüntü alındıktan sonra, hayvanları tam iyileşme gerçekleşene kadar izleyerek kafeslerine geri koyun.İlgilenilen belirli bölgelerden yayılan fotonları nicelleştirmek için görüntüleme sistemi yazılımını açın ve ilgilenilen bölge aracını seçin. Tür menüsünden Ölçüm İlgilenilen Bölgesi'ni seçin ve bir hayvanın göğüs bölgesi etrafında kare bir ilgilenilen bölge çizmek için kare aracını kullanın. Aynı boyutlarda ilgilenilen bölgeler oluşturmak için bu ilgilenilen bölgeyi diğer hayvanların her birine kopyalayıp yapıştırın ve tüm ilgilenilen bölgelerin toplam yoğunluğunu ölçmek için İlgilenilen Bölgeyi Ölç seçeneğine tıklayın.Ardından Export'a tıklayın ve ilgi bölgeleri ölçüm verilerinin kaydedileceği klasörü seçin. In vivo gen aktarımından en az yedi gün sonra, beş mililitrelik şırıngaları bir yay, 100 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngası ve tek kullanımlık bir gösterge ile üç yollu bir stopkok'a bağlayın. Bir parça PE 190 mikro tıbbi tüpü, tek kullanımlık göstergeye ve pen sentry iğnesine bağlayın.Beş mililitrelik şırıngayı 800 mikrolitre hava ile doldurun. Musluğu çevirerek 100 mikrolitrelik şırıngayı doldurup tüpteki süpernatantı çekin ve ardından anestezi uygulanmış deney faresini pleksiglas entübasyon platformuna yerleştirip hayvanı kesici dişlerinden sabitleyin. Baskın olmayan elinizle laringoskopu açın; diğer elinizdeki küt uçlu pensetle laringoskop ucunu kullanarak ağzı nazikçe aralayın.Dille yan tarafa çekmek ve laringoskop kanatını ağzın arka kısmına doğru yönlendirmek için pens kullanın. Trakea açıklığı görünür hale gelene kadar laringoskopu 90 derecelik aşağı yönlü bir açıyla çok nazikçe bastırın. Diğer elinizi kullanarak, PE tüpünün ucuna bağlı olan iletim tüpünü trakeaya yerleştirin ve Pseudomonas aeruginosa inokülümünü vermek için üç yollu vanalı sistemi döndürün; inokülümün tamamı verildiğinde tüpü hızlıca geri çekin.İnokülümün akciğerlere solunmasını sağlamak için fareyi birkaç saniye dik tutun. Son olarak, inoküle edilen hayvanlara kilogram başına 150 miligram D-Luciferin intraperitonal olarak enjekte edin ve intratrakeal stimülasyon kurulumundan 4, 24 ve 48 saat sonra akciğerleri in vivo görüntüleme sisteminde görüntüleyin; ardından az önce gösterildiği gibi foton kantifikasyonunu gerçekleştirin. Burada, az önce gösterildiği gibi salgılanmış virülans faktörleri içeren konsantre bakteriyel süpernatant ile challenge edilen bovin interlökin-8 lusiferaz geçici transgenik BALB/c farelerinde akciğer enflamasyonunun gerçek zamanlı in vivo izlenmesi için biyolüminesans görüntüleme kullanılmıştır.İndüklenen enflamatuar yanıt, kurulumdan sonra erken bir dönemde, 2,5 saatte biyolüminesans sinyalindeki artış olarak tespit edildi; foton emisyonu beş ila 24 saat arasında zirveye ulaştı ve stimülasyondan sonra en az 48 saate kadar tespit edilebilir düzeyde kaldı. Bu prosedürün ardından, tedavi üzerine oluşan immün hücrelerin sayısı ve türleri hakkında ek soruları yanıtlamak için bronkoalveoler lavaj gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, farelerde akciğer enflamasyonunun nasıl oluşturulacağı ve biyolüminesans görüntüleme kullanılarak in vivo olarak nasıl izleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

an-il-8-transiently-transgenized-mouse-model-for-vivo-long-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem...

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

style='line-height:1.2;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;' dir='ltr'&gt;Source: Schmitz, K., et al., Farelerde Multipl Skleroz EAE Modelinde Optik Nörit ve Beyin İltihabının Biyolüminesansı ve Yakın Kızılötesi Görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2017).Bu video, optik sinirde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit veya EAE'nin neden olduğu iltihabı görselleştirme ve izleme yöntemini göstermektedir. biyolüminesans görüntüleme. Fareyi konumlandırmayı, reaktif enjeksiyonunu ve zaman içinde biyolüminesanstaki...

EAE Fare Modelinde Biyolüminesans Görüntüleme

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Bu el yazması, transdüksiyon-transplantasyon fare modelleri oluşturmak için kullanılan metodolojinin bir tanımını sağlar. Kemik iliği nakli yapılırken kaçınılması gereken teknik hataların ayrıntılı bir açıklaması yapılır. Yüksek viral titre, transfeksiyon / transdüksiyon ve ışınlamanın önemi hakkında net bir anlayış kazanılmalıdır.

Myeloproliferatif tümörün İletimi-Transplantasyon Fare Modeli

Burada, farklı fare dokuları içindeki IL-22 üreten hücreleri görselleştirmek için bir transgenik raportör fare modelini açıklıyoruz. Bu yöntem, faredeki diğer sitokinlerin veya salgı proteinlerinin yerini izlemek için kullanılabilir.

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Burada, canlı görüntüleme, farelerde aşılı fluorescently etiketli insan endometrium parçacıkları için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi seçim ilaçların etkileri izleme aracılığıyla endometriotic lezyon boyutu ve gerçek zamanlı olarak flüoresan muhabir tarafından yayılan Floresans miktar...

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Bir yaklaşım Kutanöz yaralama için doğuştan gelen bağışıklık yanıtının gerçek zamanlı algılama ve Staphylococcus aureus enfeksiyon farelerin için tanımlanır. Karşılaştırma LysM-EGFP tarafından (floresan nötrofil sahip) fareler LysM EGFP ile immünyetmezligi fare zorlanma olacak, biz anlayışımız enfeksiyon ve enfeksiyon mücadele için yaklaşımlar gelişimi önceden.

Bir fare modeli için değerlendirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı Staphylococcus aureus enfeksiyon

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Makale, erken gebeliksel iltihabın nörogelişim üzerindeki etkilerini incelemek için kapsamlı bir protokol sunar; bu model, güvenilirlik ve tekrarlanabilirliği sağlamak için temel metrikleri içerir.

Nörogelişim üzerindeki prenatal iltihabı değerlendirmek için erken gebeliksel anne immün aktivasyon fare modelinin oluşturulması

Öğrenin, farelerde biyolüminesans görüntüleme ile akciğer inflamasyonunu gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, aynı hayvanların tekrarlanan değerlendirmelerine olanak tanır ve solunum hastalıklarındaki konak-patojen etkileşimlerini anlamaya yardımcı olur.

Bir IL-8 Geçici Transgenize Edilmiş Fare Modeli

Daha fazla video keşfet