3: DNA Metilasyon Analizi

DNA metilasyonu, farklı hücresel bağlamlar altında gen ekspresyonunu etkileyen DNA'nın kimyasal bir modifikasyonudur. Anormal DNA metilasyonu kanser gibi hastalıklarla ilişkilendirildiğinden, birçok araştırmacı bu sürecin mekanizması ve işlevleri ile ilgilenmektedir.

Bu videoda, DNA metilasyonunun arkasındaki prensipleri ve bunu tespit etme yöntemlerini ele alacağız. Daha sonra, bu yöntemlerden biri olan bisülfit analizi ve bu tekniğin bazı uygulamaları için genel bir protokol keşfedeceğiz.

İlk olarak, DNA metilasyonunun ne olduğuna ve nasıl tespit edilebileceğine bir göz atalım.

Bu biyokimyasal süreç sırasında bir hücre, DNA'sındaki sitozin bazlarına metil grubu olarak bilinen kimyasal bir etiket ekler. Metillenmiş sitozinlerin çoğu, aynı DNA zincirindeki guanin bazlarının yanında meydana gelir ve bu bitişik nükleotidler ve onları birbirine bağlayan fosfodiester bağı "CpG'ler" olarak adlandırılır. Omurgalı CpG'lerin çoğu metillenmiş olsa da, metillenmemiş olanlar, aktif olarak eksprese edilen genlerin promotörlerinin yakınındaki CpG "adalarında" birbirine yakın olma eğilimindedir. ve diğer çeşitli düzenleyici dizi öğeleri.

DNA metilasyonundaki değişikliklerin gen regülasyonuna nasıl katkıda bulunduğu hala yoğun bir araştırma konusudur. CpG adalarının metilasyonu, belirli genlerin kökene özgü ekspresyonu olan genomik damgalama gibi epigenetik süreçlerde görülen kararlı, uzun vadeli gen susturma ve ayrıca X-kromozom inaktivasyonu, dişi memelilerin her hücresindeki iki X-kromozomundan birinin susturulması için önemli görünmektedir. CpG adalarının anormal metilasyonuna bağlı olarak kritik genlerin baskılanmasının da kontrolsüz hücre büyümesine katkıda bulunduğu ve bunun da kansere yol açabileceği gösterilmiştir. Mekanik olarak, DNA metilasyonu, transkripsiyon faktörlerinin promotörlerle birleşmesini önleyerek veya histonları değiştiren ve kromatini transkripsiyonel olarak izin verilmeyen bir duruma yeniden modelleyen proteinleri işe alarak gen susturmaya katkıda bulunabilir.

DNA'nın metilasyon durumunu tespit etmek için birkaç yöntem vardır.

Bir teknik, HELP testi, sırasıyla sadece metillenmemiş veya hem metillenmemiş hem de metillenmemiş CCGG dizilerini parçalayan HpaII ve MspI adı verilen iki kısıtlama endonükleazını içerir. Bu iki enzim tarafından üretilen sindirim modellerini karşılaştırarak, DNA'nın metilasyon durumu çıkarılabilir.

Metillenmiş DNA immünopresipitasyonu veya "MeDIP" olarak adlandırılan başka bir yöntem, metillenmiş DNA dizilerini zenginleştirmek için metillenmiş sitozinlere bağlanan antikorları kullanır.

Son olarak, bisülfit analizi, metillenmemiş sitozini urasile dönüştüren bir kimyasal reaksiyon gerçekleştirerek DNA'daki metillenmiş sitozini metillenmemiş sitozinden ayırt etmek için kullanılır. Bu dönüşümü takiben, bisülfit ile muamele edilmiş DNA, PCR'ye tabi tutulabilir, dizilenebilir ve bir referans genom ile karşılaştırılabilir. Metillenmemiş sitozinler, referansta bulunan, ancak bisülfit analizi ve PCR'yi takiben timinlerle değiştirilenlerdir. Araştırmacılar, bisülfit ile muamele edilmiş DNA'yı kütle spektrometresine tabi tutarak, genomdaki farklı CpG'leri doğrusal olarak temsil eden ve her birindeki metilasyon derecesini gösteren "metilasyon epigramları" da oluşturabilirler. Bu tür epigramlar, araştırmacılar farklı hücre tipleri arasındaki metilasyon modellerini karşılaştırmak isterlerse özellikle yararlıdır.

Şimdi bisülfit analizi protokolüne derinlemesine bir göz atalım.

Başlamak için, genomik DNA preparatlarına sodyum hidroksit eklenir ve bunlar daha sonra 95 ° C'de inkübe edilir. Bu, DNA'yı denatüre eder ve bazlarını sonraki kimyasal reaksiyonlar için erişilebilir hale getirir. Sodyum metabisülfit daha sonra denatüre DNA karışımına eklenir ve iki kimyasal reaksiyon aşaması meydana gelir. İlk adım olan sülfonasyon sırasında, sitozin sülfonat oluşturmak için metillenmemiş bir sitozine bir sülfit grubu eklenir. Daha sonra, hidrolik deaminasyon sırasında, urasil sülfonat oluşturmak için sitozin sülfonattan bir amino grubu çıkarılır.

Kimyasal reaksiyonun bu ilk aşamalarını kolaylaştırmak için, DNA preparatı, buharlaşmayı önleyen ve sodyum metabisülfit konsantrasyonunun korunmasına yardımcı olan mineral yağ ile kaplanır. Reaksiyon daha sonra karanlıkta 55 ° C'de inkübe edilir. Bu adım sırasında, kinol gibi oksidasyonu önleyen bir ajan da karışıma eklenir.

Urasil sülfonat içeren ve mineral yağ içermeyen modifiye DNA'yı toplamak için karışım santrifüjlenir ve en alttaki sıvı tabaka geri kazanılır. Bu çözeltideki DNA daha sonra saflaştırılır.

Daha sonra, DNA karışımına sodyum hidroksit eklenir ve daha sonra 37 ° C'de inkübe edilir. Bu, tahmin edebileceğiniz gibi, sülfit grubunu urasil sülfonattan uzaklaştıran, urasil oluşturan ve kimyasal reaksiyonu tamamlayan desülfonasyonu indüklemek için yapılır.

Son olarak, karışım amonyum asetat ilavesi ile nötralize edilir ve DNA, etanol çökeltme ile toplanır. Bisülfite dönüştürülmüş DNA saflaştırıldıktan sonra PCR ve dizileme işlemine tabi tutulur.

Bisülfit analizi için temel tekniği tartıştığımıza göre, şimdi bazı deneysel uygulamalara bakalım.

Bazı araştırmacılar genomik baskıyı araştırmak için bisülfit analizi kullanır. Burada araştırmacılar, anne ve baba DNA'sının ayırt edilebilmesi için genetik farklılıklara sahip iki Arabidopsis türünü çaprazladılar. Elde edilen embriyolardaki ve ilişkili endospermdeki veya embriyoyu destekleyen dokudaki metilasyon paternleri daha sonra karşılaştırıldı. Bilim adamları, bu yöntemi kullanarak, protein kodlayan bir gen olan MEA'nin maternal alelindeki CpG'lerin embriyolarda metillenme eğiliminde olduğunu, ancak endospermde metillenmediğini buldular, bu da dokuya özgü baskıyı gösteriyor.

Diğer araştırmacılar, çevresel veya sosyal faktörlerin metilasyon modellerini nasıl değiştirebileceğini anlamak için bu tekniği kullanıyorlar. Burada, fare yavruları stres yaratmak için annelerinden ayrıldı ve daha sonra beyin dokuları izole edildi. Bisülfit ile muamele edilmiş DNA'nın dizilenmesini takiben, bilim adamları, hormon kodlayan bir gen olan AVP'deki metilasyon modellerinin, "ayrılmış" yavrularda belirli bir beyin bölgesinde değiştiğini belirlediler ve bu da erken yaşam deneyiminin uzun vadeli biyolojik etkileri için olası bir moleküler mekanizma olduğunu düşündürdü.

Son olarak, birçok araştırmacı, bireysel, benzersiz hücreler arasındaki metilasyon modellerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak için bisülfit analizini optimize etmeye çalışıyor. Burada araştırmacılar, bisülfit analiz yöntemini, tüm adımların agaroz içine gömülü bireysel fare oositleri üzerinde gerçekleştirilmesi için değiştirdiler ve bu da DNA kaybına karşı korunmaya yardımcı oldu. Araştırmacılar bu yöntemi kullanarak, çoklu metilasyon paterni verenleri arayarak diğer hücrelerle kontamine olmuş tek oosit örneklerini kolayca tanımlayabildiler.

Az önce JoVE'nin metilasyona duyarlı analizlerle ilgili videosunu izlediniz. Burada, DNA metilasyonunun gen düzenlemesinde oynadığı rolü, araştırmacıların genomdaki metillenmiş bölgeleri tanımlamak için kullandıkları yöntemleri, bisülfit analizi için genelleştirilmiş bir protokolü ve son olarak bu tekniğin bazı uygulamalarını tartıştık. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!