Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu biyolüminesans görüntüleme yönteminin genel amacı, alfa-sinüklein fibrillerinin periferik enjeksiyonundan sonra bir Parkinson hastalığı fare modelinin merkezi sinir sistemindeki nöroinflamasyonu ölçmektir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıkların fare modellerinde nöroinflamasyonun ne zaman ve ne dereceye kadar meydana geldiğini belirlemeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, nöroinflamasyonun, herhangi bir farede nörolojik hastalık gelişene kadar noninvaziv ve tekrar tekrar izlenebilmesidir.

Bu tekniğin anlamı, nörolojik hastalığın 10. saat tanısıdır, çünkü sinir iltihabına bağlı biyolüminesanstaki artış sadece nörolojik hastalığa eşlik etmekle kalmaz, aynı zamanda sıklıkla nörolojik hastalıktan önce gelir. Ameliyat için hayvanı uygun şekilde uyuşturarak başlayın. Bir ayak parmağını sıkıştırın ve hayvanın cerrahi bir anestezi düzlemini belirtmek için uzuvları geri çekmediğini onaylayın.

Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için oftalmik merhem sürün. Hayvanı, başı araştırmacıya bakacak şekilde sırt yaslanmış bir pozisyonda bir ısıtma plakasına dikkatlice sabitlemek için yapışkan bant kullanın. Daha sonra 27 gauge tek kullanımlık bir hipodermik şırıngayı beş mikrolitre sonikasyonlu alfa-sinüklein fibril ile doldurun.

Daha sonra, hayvanın ağzını açık tutmak için bir çift künt burunlu başparmak forseps kullanın ve dilin alt tarafını enjeksiyon için erişilebilir hale getirmek için dili dikkatlice dışarı çekmek için daha küçük forseps çiftini kullanın. Şırınganın iğnesini, hipoglossal sinire yakın bir şekilde dilin sağ veya sol alt tarafına yerleştirin. Beş saniye sonra, aşıyı yavaşça enjekte edin.

Aşının dokuya nüfuz etmesini sağlamak için iğnenin beş saniye daha yerinde kalmasına izin verin ve ardından iğneyi dikkatlice geri çekin. Enjeksiyondan sonra, hayvanı serbest bırakın ve tamamen iyileşene kadar sürekli izleme altında ısıtma plakası üzerinde kalmasına izin verin. İntraperitoneal enjeksiyonlar için, hayvanları izofluran içeren bir anestezi odasında kısaca narkotize edin.

Yine, hayvanın ayak parmağını sıkıştırın ve uygun anesteziyi sağlamak için arka ayağını çekmediğini onaylayın. 27 gauge tek kullanımlık hipodermik şırıngayı 50 mikrolitre sonikasyonlu alfa-sinüzin fibirlleri veya PBS ile doldurun. Hayvanı, başı araştırmacıdan uzağa ve yaklaşık 45 derece aşağı bakacak şekilde sırt pozisyonunda tutun.

Karın duvarının arkasında bulunan ince bağırsağa veya çekuma nüfuz etmeden doğrudan farenin peritonuna enjekte edin. Anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin. Görüntülemeden önce, izofluran anestezi uygulanmış farelerin kafalarını tıraş edin ve epilasyon yapın.

Spesifik olmayan biyolüminesansı engellemek için kulakları tahriş edici olmayan bir işaretleyici ile siyaha boyayın. Enjeksiyondan önce hayvanları tartın. Ardından, vücut ağırlığının kilogramı başına 150 miligram enjeksiyon için tam D-Luciferin hacmini hesaplayın.

İntraperitoneal olarak hesaplanan D-Luciferin hacmini enjekte edin ve ardından her bir hayvanı anestezi odasına geri koyun. Görüntüleme yazılımını başlatın. Görüntüleme sistemi çalışma sıcaklığına ulaştıktan sonra, kontrol panelindeki Başlat düğmesine tıklayarak sistemi başlatın.

Ardından Luminescent ve Photo düğmelerini seçin. Pozlama süresini 60 saniyeye, Gruplamayı ortaya, F/Stop'u bire ve EM kazancını kapalı olarak ayarlayın. Engelle'yi ve ardından Aç'ı seçin.

Ve sonra sekmenin altında konu yüksekliği, açılır menüden 1.50'yi seçin. D-Luciferin ile enjeksiyondan on dakika sonra, hayvanları görüntüleme odasındaki ısıtma plakasına yerleştirin ve kaslarının anestezi çıkışına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun. İzofluran akışını inhalasyon odasından görüntüleme odasına geçirin ve görüntüleme odasının kapısını uygun şekilde kapatın.

60 saniye süren biyolüminesansı ölçmek için elde düğmesine tıklayın. İzofluran akışını durdurun ve ardından hayvanları kafeslerine geri koyun. Biyolüminesansı ölçmek için araç paleti menüsünü açıp ROI Araçları'nı seçerek görüntüleme yazılımını kullanın.

Tür altında, Ölçüm ROI'si'ni seçin. ROI Araçları içinde, daire aracını tıklayın ve açılır menüden çekilecek ROI sayısını seçin. İdeal olarak üç fare için üç.

Resimde, her bir ROI'ye sağ tıklayın ve özellikler altında genişlik ve yüksekliği 1,25 santimetre olarak ayarlayın. Her bir ROI'yi ölçülen beyin alanı üzerinde konumlandırın. Görüntünün sol üst kısmında, birimler panelini fotonlardaki ışıma olarak ayarlayın.

Ardından araç paleti menüsünü açın. Görüntüyü seçin, renk ölçeğinin minimum ve maksimum değerlerini ayarlayın ve ayarlayın. Örneğin, 200.000'den bir milyona kadar.

Son olarak, dosya altında, verileri kaydetmek için kaydet'e tıklayın. Burada gösterildiği gibi, alfa-sinüklein fibrilleri ile intraperitoneal enjeksiyondan sonra, beş A53T sinüklein GFAP lusifer raportör transgenik fareden dördü, mor karelerle gösterildiği gibi 229 gün içinde nörolojik hastalık geliştirdi. Bununla birlikte, interglossal olarak enjekte edilen beş fareden sadece biri, yeşil dairelerle gösterildiği gibi 285 gün içinde nörolojik hastalık geliştirdi.

Biyolüminesans görüntüleme, transgenik farelerin, nörolojik hastalık belirtileri geliştirmeden kısa bir süre önce beyinlerinden ve omuriliklerinden yüksek biyolüminesans yaydığını ortaya koydu. Bu biyolüminesans, intraperitoneal enjeksiyondan sonra daha belirgindi, PBS enjeksiyonundan sonra yoktu, bu da astrositik gliozis olmadığını düşündürüyordu. Bu şekil, alfa-sinüklein fibrillerinin intraperitoneal enjeksiyonundan sonra zaman içinde transgenik farelerin beyinlerindeki biyolüminesansı göstermektedir.

Mavi, yeşil, kahverengi ve turuncu dairelerle gösterildiği gibi. Steradian başına santimetre kare başına saniyede 2 milyon foton eşiğinin üzerinde artan biyolüminesans seviyeleri, bu dört ayrı farenin nörolojik hastalık belirtileri geliştirmesinden birkaç hafta önce gözlendi. Beş hayvandan biri, alfa-sinüklein fibrilleri ile intraglossal enjeksiyondan 285 gün sonra ölmeden kısa bir süre önce yüksek biyolüminesans seviyeleri gösterdi.

Buna karşılık, sağlıklı PBS enjekte edilen kontrol fareleri ve intraperitoneal enjeksiyondan sonra hastalık geliştirmeyen bir hayvan için, kırmızı dairelerle gösterilen alfa-sinüklein fibrilleri ile, biyolüminesans sinyali gözlem süresi içinde eşiğin altında kaldı. Hastalıklı hayvanların beyin bölümlerinin GFAP ve Iba1'e karşı antikorlarla immünofloresan boyanması, alfa-sinüklein birikintileri olan bölgelerde mikrogliozis ve reaktif astrositler ile nöroinflamasyonu doğruladı. Alfa-sinüklein birikintileri biriktirmeyen sağlıklı hayvanlar, GFAP ve Iba1 için çok az lekelenme gösterdi.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa bir saatten daha kısa sürede yapılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, nörodejenerasyon alanındaki araştırmacıların, farelerin merkezi sinir sistemindeki nöroinflamasyonu noninvaziv olarak keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, farelere alfa-sinüklein fibrilleri ile periferik olarak nasıl enjekte edileceğini ve CNS nöroinflamasyonunu izlemek için biyolüminesans görüntülemenin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamalısınız.

Prosedürün genel amacı, alfa-sinüklein fibrilleri ile intraglossal veya intraperitoneal enjeksiyon yoluyla nörolojik hastalığı periferik olarak indüklemek ve zaman içinde nöroinflamasyonun indüksiyonunu noninvaziv olarak görüntülemektir.