Name: Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin, mikroRNA-200 ve GRHL2 kullanarak sarkoma hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişini (MET) nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, kanser agresifliği ve tedavi stratejileri üzerine önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JAS Duke Kanser Enstitüsü, Duke Üniversitesi Genitoüriner Onkoloji Laboratuvarı ve Ortopedi Duke Üniversitesi Bölümü&#39;nden destek kabul eder. HL Teorik Biyolojik Fizik Ulusal Bilim Vakfı (NSF) Merkezi tarafından desteklenmiştir (NSF FİZ-1.427.654) ve NSF DMS-1361411, ve Texas Eyaleti Kanser Araştırma bir CPRIT olarak (Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü) Akademik Rice University&#39;de. KEW NIH F32 CA192630 MKJ tarafından desteklenen ve HL Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta ve Donald S. Coffey ile yararlı tartışmalar yararlanmıştır.

Reaktiflerin hazırlanması 1. <ol><li> fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin (5,000 U / mL), DMEM, 500 mL, 5 mL, 50 mL ilave edilerek hücre kültürü için DMEM hazırlayın. Bu ortam, en fazla altı ay için 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 10 uM&#39;lik bir son konsantrasyon elde nükleaz içermeyen su içinde liyofilize primerler yeniden süspanse edin. -20 ° C&#39;de, primerlerin yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. </li><li> radyoimmünopresipitasyon deneyi (RIPA), tampon (150 mM NaCl,% 0.5 sodyum deoksikolat,% 0.1 SDS, 50 mM Tris, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce, proteaz inhibitör kokteyli ile tamamlamak ve kullanım sırasında buz üzerinde tampon tutun. 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 0.45 um polietersülfon filtre kullanılarak sterilize etmek için su ve şırınga filtresi 10 mg / ml polibren (heksadimetrin bromür) hazırlayın. Çözelti altı aya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> PBS, 10 ml 10 mg nitrotetrazolivm klorür, 1 mg / ml çalışma çözeltisi hazırlayın. 4 ° C&#39;de saklayın.</li></ol> GRHL2 2. lentiviral İletimi 1.gün <ol><li> Levha takviye edilmiş DMEM 2 mL, 6 gözlü bir plakanın her çukuruna 3 x 10 5 HEK293T hücreleri. Otomatik bir hücre sayacı hücreleri sayısal olarak. % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de bir gece kültürden sonra,% 60 konfluent - Hücreler 40 olmalıdır. </li></ol> 2. gün <ol start="2"><li> 1.8 pΔ8.9 ug ve pCMV-VSV&#39;nin 0.2 ug ile birlikte, serum içermeyen ortam, 200 uL 2 boş vektör ug (pCMV-UBC EGFP) ya da 2, pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24 ug, 25 seyreltin -G yardımcı plazmid. Ayrı bir tüp içinde, transfeksiyon başına serumsuz ortam (iki numune için 400 uL 8 uL), 200 uL bir lipid bazlı transfeksiyon reaktifi 4 uL seyreltin. Her plazmid çözeltisine transfeksiyon reaktifi karışımın 200 uL ilave edilir ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> incuba sırasındabelirleme, vakum aspirasyon ile orta çıkarılması ve 1 mL PBS ile hücrelerin durulanarak HEK293T hücreleri yıkayın. serumsuz ortamın 800 mcL ile PBS değiştirin. % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de 2 saat boyunca hücrelerin her bir adım 2.2 damla damla plazmid karışımını inkübe: 20 dakika sonra, transfeksiyon tepkin maddesi 200 uL ekleyin. </li><li> Dikkatle vakum aspirasyon ile transfeksiyon ortamı ortadan kaldırmak ve takviye edilmiş DMEM 2 mL ile değiştirin. Gece boyunca kültür için inkübatör hücreleri dönün. NOT: HEK293T hücreleri gevşek yapışık bulunmaktadır. Ortam değişimi tabak veya şişe tabanından hücrelerin çıkarılmasını sınırlamak için dikkatle gerçekleştirilmelidir. </li></ol> 3. Gün <ol start="5"><li> Takviye edilmiş DMEM 2 mL transfekte HEK293T hücrelerinin ve plaka üzerinde, 6 gözlü bir plakanın her çukuruna 3 x 10 5 RD hücreleri ortamı yenileyin. Gece boyunca Kültür hücreleri. RD hücreleri, ticari olarak temin edilebilen insan rabdomiyosarkom hücre çizgisidir. </li></ol> 4. Gün </p&gt; <ol start="6"><li> HEK293T hücrelerinden viral ortamı toplayın. yeni bir 15 ml konik içine HEK293T hücrelerinin ve yerden DMEM ortamı pipetle. Dikkatle geri ertesi gün için kuluçka yeni DMEM medya ve yer HEK293T hücreleri ile değiştirin. </li><li> iki yeni 50 ml konik borular (GRHL2 transfeksiyon için, boş vektör transfeksiyonu için) ve başka içine, 10 mg / viral medya mL&#39;si başına ml polibren 2 uL ekleyin. 3 ml&#39;lik bir şırınga pistonu çıkarılması ve uç için 0.45 um polietersülfon filtre iliştirmek Şırınga filtre viral ortam. <ol><li> şırınganın haznesine adım 2.6 toplanan virüs ortam ekleyin ve polybrene ihtiva eden yeni bir 50 mL konik tüp içine ortam dalma. Vakum aspirasyon ile RD hücrelerinden Ortamı çıkarın ve RD hücrelerinden üzere filtre virüs ortamı eklenir. </li></ol></li></ol> 5. Gün <ol start="8"><li> Viral medya toplandıktan sonra tekrarlayın Gün 4. HEK293T hücreleri atılabilir. </li></ol> 7. Gün </strong&gt; <ol start="9"><li> Yıkama RD 1 mL PBS ile hücre ve 200% 0.05 tripsin uL çukur başına ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir takviye edilmiş bir ortam, 2 ml ekleyin ve yeni bir 15 ml konik hücre süspansiyonu hareket ettirin. Oda sıcaklığında ve aspirat ortamı 5 dakika boyunca 250 x g&#39;de santrifüje hücreleri. DMEM, 1 mL içinde süspanse (% 5 FBS ve% 1 ile takviye penisilin-streptomisin). NOT: FBS daha yüksek bir yüzdesi kullanılarak flow sitometri sırasında tıkanma neden olabilir <ol><li> flow sitometri için filtre hücreleri. Buz üzerinde boru ve yer tüpler akış sitometrisi bir 30 um filtre üzerinden 1 ml RD hücre süspansiyonunun tatbik edilmesi için bir pipet kullanın. </li><li> DMEM, 0.5 mL içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine kriteri + EGFP hücreler 26 buz üzerinde,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ve yer ile desteklenmiştir. Plaka eGFP + kültür inkübatörü içinde 12 oyuklu plaka ve yer tek bir kuyusuna takviye edilmiş DMEM, 1 mL toplam tasnif edilen hücreler. ; NOT: akışından sitometri bu transdüksiyon sonra EGFP + hücrelerinin verimi, genellikle düşük (50,000-100,000 hücre). 3. adıma ilerlemeden önce, 14 gün - Hücreler 10 kültürlenebilir gerekebilir. </li></ol></li></ol> miR-200s 3. Ters transfeksiyonu <ol><li> Tekrarlanan donma / erime döngülerinden kaçınmak için -20 ° C&#39;de nükleazsız H2O kısım stokları ve deposunu kullanan miR-200 taklit 50 uM stokları hazırlayın. </li><li> serumsuz ortam 300 uL veya 300 uL serumsuz ortama 50 uM negatif kontrol miRNA&#39;nm 9 uL, her 50 uM miR-200 mimik (miR-200a, miR-200b ve miR-200c) 3 uL ekleyin. </li><li> serumsuz ortam 600 uL siRNA özgü transfeksiyon reaktifi 6 uL ekleyin ve iki boru, adım 3.2 iki mıR karışımlarının her biri için bir içine bu karışımın 300 uL bölün. transfeksiyon reaktifi 300 uL bir karışımı ile adım 3.2 &#39;den her mıR karışımı 300 uL birleştirin. Oda te 20 dakika süreyle inkübe edinmperature. </li><li> kuluçka sırasında, 2.4 mL, Bölüm 2&#39;de oluşturulan EV veya GRHL2 eksprese 600,000 eGFP + RD hücrelerinden oluşan bir hücre süspansiyonunun muamele başına serumsuz ortam (250 hücre / ml) hazırlayın. </li><li> 24 oyuklu bir plaka, altı kuyu içine miR-200 karışımı ya da adım 3.3 negatif kontrol karışımı oyuk başına 100 uL ekleyin ve daha sonra her bir miR karışımın üç kuyu içine her bir hücre süspansiyonu 400 uL ekleyin. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C &#39;de hücreler bir gece boyunca inkübe edin ve ortamı değiştirmek tam ertesi gün DMEM takviye etmek. Uygun tampon (aşağıya bakınız) kullanılarak analiz için 2 gün sonra hücreler toplanır. MET geçiren RD sarkom hücrelerinin zaman atlamalı görüntüleme tamamlayıcı malzeme olarak kullanılabilir. Görüntü otomatik canlı hücre görüntüleyici 27 kullanan bir 10X amacı ile her kuyu her 2 saat. </li></ol> 4. RNA ekstraksiyonu, ters transkripsiyon ve qPCR <ol><li> Standart bir RNA kullanılarak üreticinin talimatlarına göre RNA Özüekstraksiyon kiti 24. Çıkarılan RNA -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> RNA konsantrasyonu ölçmek. Çözülme ve buz üzerinde RNA ile çalışır. RNA konsantrasyonlarının ölçümü, üreticinin protokolüne uygun olarak, bir plaka okuyucu spektrofotometre ile 260 nm&#39;de UV absorbansı ölçmek. nükleaz içermeyen su ile en düşük konsantrasyonu, tüm numuneler seyreltin. </li><li> Tamamlayıcı DNA (cDNA) içine toplam RNA ters transkripsiyon gerçekleştirin. Bir 20 uL reaksiyon hacmi 24 transkriptaz ve nükleaz içermeyen su, ters PCR tamponu, dNTP karışımı (100 mM), rastgele heksamer primerleri ile total RNA en az 100 ng birleştirin. imalatçının protokolüne göre RT döngüleri çalıştırın. cDNA, -20 ° C de, uzun süreli saklanabilir. </li><li> Nükleaz içermeyen H2O 80 uL 100 uL 20 uL reaksiyonları seyreltin </li><li> bir floresans bazlı interkalasyon boya 2x qPCR ana karışımı 5 uL, her biri 10 uM primer 0.06 uL, karıştırınörnek başına seyreltilmiş RT reaksiyonunun nd 2 uL. </li><li> floresan bazlı ana karışımı için üreticinin protokole göre çalıştırın qPCR. </li><li> Delta BT yöntemi ile mRNA&#39;nın nispi miktarlarını ölçmek ve GAPDH için normalize. Her tedavi grubu için ortalama ± standart sapma biyolojik tekrarın ortalaması mRNA ekspresyonunu çizilir. NOT: Bu RNaz içermeyen plastik ve reaktif maddelerin kullanıldığı olarak RNases, temastan kaçınmaya RNA ile çalışırken özel önlemler alınmalıdır. Sigara atılabilir ekipman RNases kaldırmak için kullanılmadan önce tedavi edilmelidir. </li></ol> 5. Bağışık Boyama <ol><li> 24 oyuklu bir formatta RD hücrelerinden vakum aspirasyon adım 3.6, aspirat ortam et. </li><li> oyuk başına% 4 paraformaldehit (PFA), 500 uL ekleyerek hücreleri saptamak ve oda sıcaklığında 15 dakika (RT) enkübe edilir. tespit sonra, fosfat yer hücreleri gerektiğinde gece boyunca 4 ° C&#39;de tuzlu su (PBS) ve mağaza tamponlu. </li><li> PermeabilizePBS +% 0.2 Triton-X100, 500 uL ilave edilmesi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe göre hücre. vakum aspirasyon ile, permeabilizasyon tamponu çıkarın ve üç kez PBS ile yıkayın. </li><li> % 5 bovin serum albümini, 500 uL (BSA) / PBS içinde Blok ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Hücreler, bir gece boyunca, gerekirse 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Primer antikor seyreltme hazırlayın. 15 ml konik içine% 5 BSA pipetle 200 uL / ​​göz başına PBS (12 kuyu = 2.4 mL) ve% 5 BSA mL&#39;si başına birincil antikor 1 uL ekleyin / PBS içinde gerekli. Vakum aspirasyon ile Bloklama tamponunu çıkarın ve her bir oyuğa seyreltilmiş birincil antikor 200 uL dağıtın. <ol><li> 1 hücreleri inkübe:% 5 BSA 1000 seyreltilmiş primer antikorlar / PBS içinde 1 saat süre ile, oda sıcaklığında ya da gece boyunca 4 ° C&#39;de karıştırıldı. İnkübasyondan sonra, hücreler PBS ile iki kez yıkanır. </li></ol></li><li> yukarıdaki gibi% 5 BSA / PBS, aynı hacimde ikincil antikor seyreltme hazırlayın. 2,000 seyreltme: 1 kullanarak uzak-kırmızı boya-konjüge edilmiş ikincil antikor ekleyin. Ayrıca eklemekkarışıma Hoechst boya 1 ug / ml. PBS çıkarın ve her bir oyuğa karışımdan 200 uL ekleyebilir. <ol><li> karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. PBS ile 3 kez yıkayın, PBS hücrelerin bırakın ve folyo kullanarak ışık hücreleri korur. Gerekirse Hücreler, 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol></li><li> 650 nm - eksitasyon dalga boyu 594 ile ters epifloresans mikroskop 400X toplam büyütmede Resim hücreleri. </li></ol> 6. Western Blot <ol><li> buz gibi soğuk PBS ile iki kez 3.6 hücreleri yıkayın. Buz üzerinde, 1 x RIPA 50 uL lize hücreleri 1 x proteaz inhibitör kokteyli ile takviye edilmiş tampon. </li><li> 15 dakika boyunca 4 ° C &#39;de kaya lizatları, 5 dakika örnekleri açıklamak için yüksek hızda (20,000 xg) 1.5 ml tüpler içine lizatları ve santrifüj toplar. gerektiğinde hücre lizatları, -80 ° C&#39;de uzun süreli saklanabilir. </li><li> bir Bradford tahlili kullanılarak toplam protein miktarını ve yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine protein eşit miktarda kısım. Brin2-merkaptoetanol ile takviye edilmiş RIPA tamponu ve 3x Laemmli yükleme tamponu kullanılarak eşit hacme gr numune. </li><li> 95 ° C&#39;de 5 dakika süre ile 1 x Laemmli numune yükleme tamponu içinde inkübe edin ve 45 dakika boyunca 200 V&#39;de% 4-12 Tris-glisin jel kullanılarak SDS-PAGE çalıştırın. hücre serisine bağlı olarak protein yüklü kadar artar. Bazı durumlarda, toplam proteinin 50-100 ug mezenkimal hücre çizgilerinde e-kaderin tespit etmek için gereklidir. </li><li> 1x Tris-glisin transfer tampon maddesi içinde 50 V, 2 saat boyunca bir nitroselüloz zar üzerine transfer proteinleri. </li><li> Oda sıcaklığında ya da gece boyunca BSA tabanlı bloke edici tampon içinde 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca blok membran. </li><li> , Bloke edici tampon 5 ml 1.000 konsantrasyon membrana olarak seyreltme ve yumuşak, oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle sallanan inkübe: 1 ile birincil antikorlar seyreltilir. % 0.05 Tween-20 ile PBS içinde yıkama zar 3 kez. </li><li> Kızılötesi floresan bağlanmış İkincil ile oda sıcaklığında 1 st için membranlar inkübe1 de y antikoru: Yukarıda anlatıldığı gibi, blokaj tamponu içinde 20,000 seyrelti. </li><li> % 0.05 Tween-20 ile PBS içinde membran, iki kez yıkanır ve PBS içinde daha sonra bir kez. </li><li> Standart kızılötesi floresens kullanarak görüntü membran. </li></ol> 7. tutunmadan çoğalması Tahliller NOT: Ayrıntılı yumuşak agar denemesi protokolü için, 28 bkz. <ol><li> Sıcak su banyosu içerisinde 42 ° C&#39;ye kadar sıcak steril 2x DMEM ortamı. Bu süre boyunca, ısı 3 dakika süreyle mikrodalgada içinde% 1 agaroz önceden otoklava. gerekli ya da tamamen eriyene kadar bir zamanda, ilave bir 30 s için mikrodalga. 42 ° C su banyosu için agaroz hareket ettirin. </li><li> bir steril bir muhafaza içinde 42 ° C&#39;de su içinde bir çanak içinde bir 50 mL konik tüp yerleştirilir ve 1% 1 agaroz ve 2x DMEM ortamı karışımı: 6 gözlü bir plakada göz başına 1.5 mL karışım 1 oranı muhasebe. Her zaman DMEM agaroz pipetleme hatası hesaba / ekstra hazırlayıp kabarcıklarını önlemek için. </li><li> Karışımı ekleyinhiçbir kabarcık sağlanması da kenarları oluşturur ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletildi. </li><li> alt tabaka katılaşan edilirken, ortam aspire ve 1 ml PBS ile bir kez yıkanarak 3. adımda Transfekte edilmiş RD hücrelerinden her grup hazırlar. PBS aspire ve% 0.05 tripsin 0.2 mL eklenir ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir tek hücre süspansiyonu meydana getirmek üzere medya ve çiğnemek hücreler 0.8 mL tripsin nötralize. 15 ml konik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Hücre sayımı ve oyuk başına 10,000 hücre için gerekli olan hücre süspansiyonu hacmi hesaplamak. </li><li> tamamen eriyene kadar bir seferde 30 s, ardından 3 dakika süreyle mikrodalgada% 0.6 agaroz ısıtın. 42 ° C su banyosuna agaroz hareket ettirin. </li><li> bir steril bir muhafaza içinde 42 ° C&#39;de su içinde bir çanak içinde bir 50 mL konik tüp yerleştirin. 6 gözlü bir plakada göz başına, 1.5 mL hazırlanması için 1: 1 oranında% 0.6 agaroz ve seyreltilmiş hücre süspansiyonu karıştırın. Her zaman pipetleme hatalarını hesaba mix agaroz / ekstra hücre süspansiyonu hazırlamak vekabarcıklarını önlemek için. NOT: Burada 42 ° C&#39;de çalışmak önemlidir. sıcaklık çok düşükse karışım kaplama önce katılaşması olacak ve 42 ° C&#39;nin üzerindeki sıcaklıklar, hücre canlılığını etkileyecektir. </li><li> hücreler bir kaç kez ezilip karıştırılarak İyice karıştırın ve kabarcık formu sağlayarak, gözlere hücre karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca katılaşmaya sağlar. </li><li> Her bir takviye edilmiş bir ortam, 2 ml de ekleme ve inkübatör plakaları hareket eder. <ol><li> 3-4 hafta veya çok hücreli koloniler oluştururlar kadar haftada bir kez medya değiştirin. Vakum aspirasyon yoluyla ortamları çıkartırken agar dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olun. Alternatif olarak, sıvı ortamın üst tabakayı kaldırmak için bir P1000 kullanın. </li><li> 200 uL Nitro Mavi Tetrazolyum klorür çözeltisi eklenerek (1 mg / PBS ml) yumuşak agar plakaları leke ve 37 ° C&#39;de gece boyunca plaka inkübe edilir. görüntüleme için PBS ile ertesi gün medya değiştirin. </li><li> ters çevrilmiş bir mikroskop 40X toplam büyütmede Resim kuyular. </li><li> koloni alanı ve sayısı için ImageJ analiz yapın. Arsa biyolojik çoğaltır koloni sayısı standart sapma ortalaması ±. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition%2C+TGF-beta%2C+and+osteopontin+in+wound+healing+and+tissue+remodeling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Burn+Care+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury.</a> J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT-MET+in+renal+disease%3A+should+we+curb+our+enthusiasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">EMT-MET in renal disease: should we curb our enthusiasm.</a> Cancer Lett. 341 (1), 24-29 (2013).</li>
<li>Carew, R. M., Wang, B., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+EMT+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">The role of EMT in renal fibrosis.</a> Cell Tissue Res. 347 (1), 103-116 (2012).</li>
<li>Willis, B. C., Borok, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+EMT%3A+mechanisms+and+implications+for+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced EMT: mechanisms and implications for fibrotic lung disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (3), L525-L534 (2007).</li>
<li>Ye, X., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Plasticity%3A+A+Central+Regulator+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Plasticity: A Central Regulator of Cancer Progression.</a> Trends Cell Biol. 25 (11), 675-686 (2015).</li>
<li>Li, L., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+human+cancer%3A+comprehensive+reprogramming+of+metabolism%2C+epigenetics%2C+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in human cancer: comprehensive reprogramming of metabolism, epigenetics, and differentiation.</a> Pharmacol Ther. 150, 33-46 (2015).</li>
<li>Tsai, J. H., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+plasticity+in+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal plasticity in carcinoma metastasis.</a> Genes Dev. 27 (20), 2192-2206 (2013).</li>
<li>Bitting, R. L., Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Garcia-Blanco, M. A., Armstrong, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+epithelial+plasticity+in+prostate+cancer+dissemination+and+treatment+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The role of epithelial plasticity in prostate cancer dissemination and treatment resistance.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (2-3), 441-468 (2014).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Migration+and+Invasion+Uncoupled%3A+Increased+Migration+Is+Not+an+Inexorable+Consequence+of+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular Migration and Invasion Uncoupled: Increased Migration Is Not an Inexorable Consequence of Epithelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Mol Cell Biol. 34 (18), 3486-3499 (2014).</li>
<li>Mathow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeb1+affects+epithelial+cell+adhesion+by+diverting+glycosphingolipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Zeb1 affects epithelial cell adhesion by diverting glycosphingolipid metabolism.</a> EMBO Rep. 16 (3), 321-331 (2015).</li>
<li>Ware, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+of+resistance+to+gefitinib+mediated+by+cellular+reprogramming+and+the+acquisition+of+an+FGF2-FGFR1+autocrine+growth+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">A mechanism of resistance to gefitinib mediated by cellular reprogramming and the acquisition of an FGF2-FGFR1 autocrine growth loop.</a> Oncogenesis. 2, e39(2013).</li>
<li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+versus+mesenchymal+phenotype+determines+in+vitro+sensitivity+and+predicts+clinical+activity+of+erlotinib+in+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 11 (24 Pt 1), 8686-8698 (2005).</li>
<li>Jolly, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+elucidating+the+connection+between+epithelial-mesenchymal+transitions+and+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Towards elucidating the connection between epithelial-mesenchymal transitions and stemness.</a> J R Soc Interface. 11 (101), 20140962(2014).</li>
<li>Mani, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epithelial-mesenchymal+transition+generates+cells+with+properties+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells.</a> Cell. 133 (4), 704-715 (2008).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+is+regulated+via+microRNA-200%2FZEB1+axis+control+of+tumour+cell+PD-L1+expression+and+intratumoral+immunosuppression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Metastasis is regulated via microRNA-200/ZEB1 axis control of tumour cell PD-L1 expression and intratumoral immunosuppression.</a> Nat Commun. 5, 5241(2014).</li>
<li>Nicolazzo, C., Gradilone, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+of+circulating+tumor+cells+in+soft+tissue+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Significance of circulating tumor cells in soft tissue sarcoma.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , 697395(2015).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://mcb.asm.org/content/early/2016/07/08/MCB.00373-16.abstract">Mesenchymal-epithelial transition in sarcomas is controlled by the combinatorial expression of miR-200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Bae, Y. K., Choi, J. E., Kang, S. H., Lee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-Mesenchymal+Transition+Phenotype+Is+Associated+with+Clinicopathological+Factors+That+Indicate+Aggressive+Biological+Behavior+and+Poor+Clinical+Outcomes+in+Invasive+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Breast+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial-Mesenchymal Transition Phenotype Is Associated with Clinicopathological Factors That Indicate Aggressive Biological Behavior and Poor Clinical Outcomes in Invasive Breast Cancer.</a> J Breast Cancer. 18 (3), 256-263 (2015).</li>
<li>Humphries, B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA-200+family%3A+small+molecules+with+novel+roles+in+cancer+development%2C+progression+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The microRNA-200 family: small molecules with novel roles in cancer development, progression and therapy.</a> Oncotarget. 6 (9), 6472-6498 (2015).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+of+primary+high-grade+soft+tissue+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling of primary high-grade soft tissue sarcomas.</a> Genes Chromosomes Cancer. 51 (11), 982-996 (2012).</li>
<li>Petrof, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+GRHL2+result+in+an+autosomal-recessive+ectodermal+Dysplasia+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in GRHL2 result in an autosomal-recessive ectodermal Dysplasia syndrome.</a> Am J Hum Genet. 95 (3), 308-314 (2014).</li>
<li>Werner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+the+transcription+factor+grainyhead-like+2+%28GRHL2%29+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual roles of the transcription factor grainyhead-like 2 (GRHL2) in breast cancer.</a> J Biol Chem. 288 (32), 22993-23008 (2013).</li>
<li>Werth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+grainyhead-like+2+regulates+the+molecular+composition+of+the+epithelial+apical+junctional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factor grainyhead-like 2 regulates the molecular composition of the epithelial apical junctional complex.</a> Development. 137 (22), 3835-3845 (2010).</li>
<li>Somarelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-Epithelial+Transition+in+Sarcomas+Is+Controlled+by+the+Combinatorial+Expression+of+MicroRNA+200s+and+GRHL2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-Epithelial Transition in Sarcomas Is Controlled by the Combinatorial Expression of MicroRNA 200s and GRHL2.</a> Mol Cell Biol. 36 (19), 2503-2513 (2016).</li>
<li>Varma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Grainyhead-like+2+and+NK2-homeobox+1+form+a+regulatory+loop+that+coordinates+lung+epithelial+cell+morphogenesis+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Grainyhead-like 2 and NK2-homeobox 1 form a regulatory loop that coordinates lung epithelial cell morphogenesis and differentiation.</a> J Biol Chem. 287 (44), 37282-37295 (2012).</li>
<li>Pruitt, S. C., Mielnicki, L. M., Stewart, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fluorescent+protein+expressing+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fluorescent protein expressing cells by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 263, 239-258 (2004).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+morphological+screen+identifies+novel+microRNAs+that+regulate+neuroblastoma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A high-content morphological screen identifies novel microRNAs that regulate neuroblastoma cell differentiation.</a> Oncotarget. 5 (9), 2499-2512 (2014).</li>
<li>Borowicz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+soft+agar+colony+formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The soft agar colony formation assay.</a> J Vis Exp. (92), e51998(2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+proteomics+and+genomics+analysis+reveals+a+novel+mesenchymal+to+epithelial+reverting+transition+in+leiomyosarcoma+through+regulation+of+slug%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Integrated proteomics and genomics analysis reveals a novel mesenchymal to epithelial reverting transition in leiomyosarcoma through regulation of slug.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (11), 2405-2413 (2010).</li>
<li>Alba-Castellon, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snail1+expression+is+required+for+sarcomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Snail1 expression is required for sarcomagenesis.</a> Neoplasia. 16 (5), 413-421 (2014).</li>
<li>Takaishi, M., Tarutani, M., Takeda, J., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+to+Epithelial+Transition+Induced+by+Reprogramming+Factors+Attenuates+the+Malignancy+of+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal to Epithelial Transition Induced by Reprogramming Factors Attenuates the Malignancy of Cancer Cells.</a> PLoS One. 11 (6), e0156904(2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Sarkomları bir mezenkimal kökenli nadir fakat son derece agresif kanserlerdir. bunların mezenkimal kökenli rağmen, sarkom bir alt kümesi, bir daha epitel benzeri bir duruma fenotipik dönüşmesine görünmektedir. Daha fazla epitel benzeri tümörlü hastaların 24 daha az agresif olduğu gibi bu MET benzeri anahtarı, prognostik bir önemi vardır. klinik önemine rağmen, sarkomlarda bu fenotipik geçişlerini sürüş moleküler mekanizmalar çok az çalışma vardır. sarkom hücrelerindek...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55520/induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells">Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells</a>. An author name was updated.

Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Fenotipik plastisite hücre fenotipleri arasında tersinir bir geçiş anlamına gelir ve genel olarak iki tip epitelyal-to-mezenşimal (EMT) geçişler ve mezenkimal-için-epitel geçişler (MET) bölünür. Bu fenotipik plastisite bu gelişme ve yara iyileşmesi 1 olarak çok hücreli organizmalardan normal süreçlerde önemli bir rol oynar; Bununla birlikte, bu aynı yollar ve gen ekspresyonu programları da fibroz, hastalığa yol açabilir (inceleme 2, 3, 4) ve karsinoma metastazı (referanslar 5, 6, 7 gözden, 8). Metastaz sırasında, örneğin, EMT hücre polarite, hücre-hücre etkileşimleri bozar ve istila 9, 10 destekler. Birlikte, EMT katkıdaKanser hücresi yayılmasını kolaylaştıran bir fenotipik durumuna s. Buna ek olarak, EMT aynı zamanda kanser hücre metabolizması 6 deregülasyonu, ilaç direnci 11, 12 geliştirilmesi dahil olmak üzere agresif fenotipi sürücü diğer fenotipik değişiklikler, artmış tümör başlatma yeteneğine 13, 14 ve bağışıklık kaçırma 15 ev sahibi bir dizi yol açar. Fenotipik esneklik de karsinoma ilerlemesinde çalışılmıştır; Bununla birlikte, sarkomlar da fenotipik plastisite sergiler. karsinom fenotipik esneklik aynı sürücülerin bazıları da sarkom plastisite ve agresiflik katkıda sanki İlginçtir, o görünür. Örneğin, sarkom hastaların dolaşımdaki tümör hücrelerinin (kapalı zaman eğrilerinin) EpCAM&#39;ı, tipik olarak, epitel hücreleri 16 üzerinde bulunan bir hücre yüzeyi proteinini ifade etmek için gösterilmiştir. Addiarası olarak, 250 yumuşak doku sarkomu örnekleri epitelyal benzeri veya mezenşimal benzeri gen ifadesine dayalı olarak sınıflandırılmıştır. Epitel benzeri biyomarker imzadaki hastalar mezenkimal benzeri biyomarker imza 17 olan hastalarda daha iyi bir prognozu vardı. Bu, daha fazla epitel benzeri karsinom olan hastaların daha mezenkimal benzeri tümörler 18 olan hastalarla karşılaştırıldığında daha iyi sonuçlar sahip olduğu birçok karsinom, tutarlıdır. Bazı sarkomlar biyolojik ve MET tutarlı gen sentezleme yolları gösterilirken, bu fenotipik esneklik moleküler temelleri yeterince anlaşılamamıştır. sarkomda MET mekanizmaları ve sürücüleri incelemek için iki epitel özgü faktörleri kullanılarak MET indüksiyon bir model geliştirdi, mikroRNA (miR) -200 ailesi ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2). miR-200S Messen 3&#39; UTR bağlanarak gen ekspresyonunu regüle küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar ailesidirger RNA ve protein içine önleme çevirisi. miR-141 ve miR-200a ihtiva eden bir ve miR-200b, miR-200c ve miR-429 de dahil olmak üzere - diğer miR-200 ailesi, iki alt grup oluşur. MiR-200 ailesinin üyeleri epitel dokuları açısından zengindirler ve miR-200s kaybı karsinomları 19 metastaz ile ilişkilidir. MiR-200 ailesi de normal doku 20 ile karşılaştırıldığında yumuşak doku sarkomları aşağı regüle edilir. MiR-200&#39;ler benzer şekilde, GRHL2 epitel gelişimi 21 için önemli olan düzenlenmesinde anahtar rol oynar. GRHL2 transkripsiyon faktörü, E-kadherin gibi epitel genleri, yukarıya doğru düzenlemek için iki şekilde hareket eder: 1) epitel hücrelerinde, GRHL2 şirketinden EMT ana regülatör bastırmaktadır, ZEB1 22; ve 2) GRHL2 direkt olarak epitel genlerin 23 transkripsiyonunu aktive eder. Bizim önceki araştırmalar göstermiştir ki sarkom hücrelerinde miR-200&#39;ler ve GRHL2 birleşik ifadesiBir MET benzeri fenotip 24 indükler. Burada, miR-200S ve GRHL2 ektopik ekspresyonu ile sarkom hücrelerindeki MET indüksiyon in vitro bir model oluşturmak için ayrıntılı protokol mevcut.

<table><tbody><tr><td>Kontes otomatik sayıcı</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası slaytları</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Termal Döngüleyici</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR mikroplaka</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Hızlı Evrensel qPCR Kiti</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Başlangıç Bloğu (PBS) Engelleme Tamponu</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>BSA bazlı engelleme tamponu</td></tr><tr><td>Agaroz Genel Amaçlı LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin/SDS Tamponu</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş.</td><td>161-0732</td><td>Çalışma tamponu</td></tr><tr><td>10x Tris/Glisin Tamponu</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Transfer tamponu</td></tr><tr><td>RIPA Tamponu</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 & mu; m nitroselüloz</td><td>GE Sağlık Yaşam Bilimleri 10600012</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kiti</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Numune Tamponu (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Hücresi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş</td>. <td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Hücre</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları A.Ş</td>. <td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>%0,05 Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA taklit negatif kontrol #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA taklit</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA taklit</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA taklit</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>11088-021</td><td>serumsuz ortam</td></tr><tr><td>anti-Ecadherin antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta aktin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-tavşan AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Durdurma Proteaz ve Fosfat İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Çift Renkli</td><td>Bio-Rad Laboratuvarlar A.Ş</td>. <td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; Akış için m filtresi</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R IDT</td><td></td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro mavisi tetrazolium&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>heksadimetrin bromür</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polibren</td></tr><tr><td>3 mL şırınga</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Steril şırınga filtresi</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı tüp</td><td>352063</td><td></td><td>akış sitometri tüpleri</td></tr><tr><td>Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>ters transkripsiyon kiti</td></tr><tr><td>% 4 paraformaldihit</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

sarkoma hücreler mezenkimal-epitel geçişler endüklenmesi

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

Fenotipik plastisite hücreleri geçici olarak başka bir soy özellikleri elde ettiği bir olguya karşılık gelir. karsinoma ilerleme sırasında, fenotipik plastisite işgali, yayılmasını ve metastaz sürer. fenotipik plastisite çalışmaların çoğu epitel türetilmiş karsinom bağlamında olmuştur Nitekim, bir mesenchymal- benzer bir fenomen geçiren sarkomlar bir alt kümesi ile de fenotipik plastisite sergiler, mezenkimal kaynaklı olan sarkomu, çıkıyor epitel geçiş (MET). Burada, sırasıyla ardışık GRHL2 ve miR-200 ailesi, hücre transdüksiyonunu ve transfeksiyon kullanılarak ifade sarkom hasta samples.We gözlemlenen bu MET benzeri fenomen taklit etmek için miR-200 aile ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) içeren bir yöntem geliştirdi daha iyi sarkom hücrelerinde bu fenotipik geçişlerinin moleküler temellerini anlamak. miR-200S ve GRHL2 ifade sarkomu hücreleri gelişmiş epitel characterist gösterdiHücre morfolojisi ve epitel ve mezenkimal biyobelirteçlerinin değiştirilmesinin ics. Bu yöntemleri kullanarak gelecekteki çalışmalar ile göç, invazyon, metastatik eğilimi ve tedavi direnci gibi sarkom hücreleri üzerinde MET benzeri işlemler, fenotipik sonuçlarını anlamak için kullanılabilir.

sarkom hücrelerindeki MET indüksiyonu için Şema Sarkom hücrelerindeki MET benzeri değişikliklerin indüksiyonu için genel bir zaman çizelgesi, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. Protokol miR-200 etti (Şekil 1B) transfeksiyonu takiben GRHL2 (Şekil 1A), transduse edilmesiyle başlar. GRHL2 veya miR-200 aile üyeleri tek basma ifade edildiğinde RD hücrelerinin görünümünü etkileyen mümkün ...

Biz burada mikroRNA-200 aile üyeleri ve grainyhead benzeri 2 (GRHL2) kombine ektopik ifadesine dayalı sarkom hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişler (MET) uyarılması için bir hücre kültürü yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem kanser agresiflik ve tedavileri hakkında fenotipik esneklik biyolojik etkilerini daha iyi anlamak için uygundur.

Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

Bu prosedürün genel amacı, sarkomlardaki mezenkimal-epitelyal geçişlerin fenotipik sonuçlarını incelemektir. Bu yöntem, epitelyal benzeri sarkomların neden mezenkimal benzeri sarkomlara kıyasla daha üstün sonuçlara sahip olduğuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sarkomlardaki mezenkimal-epitelyal geçişlerle ilişkili alt akış gen düzenleyici ağlarını ve fenotipleri incelemek için kolay ve tekrarlanabilir bir araç sağlamasıdır.Sarkomlardaki fenotipik plastisiteyi daha iyi anlayarak, sarkomları daha indolent epitelyal benzeri bir duruma kaydırmamıza olanak tanıyacak terapötik müdahaleler belirlemeyi umuyoruz. Prosedürü, laboratuvarımızdaki iki lisans öğrencisi olan Jackson Xu ve Shivee Gilja uygulamalı olarak gösterecektir. Transdüksiyonun ilk gününde, altı kuyucuklu bir plakanın iki kuyucuğuna, 2 mL takviye edilmiş DMEM içerisinde 3 × 10⁵ HEK293T hücresi ekleyin.Plakayı 37 °C'de %5 karbondioksit ile inkübe edin. Gece boyu kültür yaptıktan sonra hücreleri mikroskop altında inceleyin. Hücreler %40 ila %60 konfluens değerinde olmalıdır.Ardından, 1.8 µg p delta 8.9 ve 0.2 µg pCMV-VSV-G yardımcı plazmidi içeren 200 µL serumsuz ortam bulunan ayrı tüplerde, iki µg boş vektörü ve iki µg GRHL2 içeren vektörü seyreltin. Başka bir tüpte, her bir transfeksiyon için 200 µL serumsuz ortam içerisinde dört µL lipid bazlı transfeksiyon reaktifini seyreltin. İki örnek için bu miktarlar sekiz µL ve 400 µL olacaktır.Her bir plazmid çözeltisine 200 µL transfeksiyon reaktifi karışımı ekleyin ve ardından örnekleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bu sırada, HEK293T hücrelerinden besiyerini uzaklaştırmak için bir vakum aspiratörü kullanın. Hücreleri 1 mL PBS ile bir kez durulayın ve ardından PBS'yi 800 µL serumsuz besiyeri ile değiştirin.20 dakika geçtikten sonra, ekili hücrelerin bulunduğu her bir kuyucuğa 400 µL transfeksiyon reaktifi plazmit karışımını damla damla ekleyin. Kabı 37 °C'de %5 CO2 içeren ortamda iki saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, transfeksiyon ortamını vakum aspirasyonu ile dikkatlice uzaklaştırın.HEK293T hücreleri gevşek yapışkan hücrelerdir, bu nedenle besiyerini aspire ederken hücrelerin kap veya flask tabanından uzaklaşmamasına dikkat edin. Aspire edilen besiyerini iki mililitre takviyeli DMEM ile değiştirin. Hücreleri gece boyu kültürlenmek üzere inkübatöre geri yerleştirin.Ertesi gün, transfekte edilmiş HEK293T hücrelerindeki besiyerini tazeleyin, ardından her kuyucuğunda 2 mL desteklenmiş DMEM bulunan altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 3x10⁵ RD insan rabdomiyosarkom hücresi ekleyin. Her iki plağı da gece boyunca kültüre edin. Dördüncü günde, HEK293T hücrelerinden viral besiyerini toplamak için bir pipet kullanın ve bunu biri boş vektör içeren lentivirüs, diğeri ise GRHL2 plazmidi içeren lentivirüs için olmak üzere iki yeni 15 mL konik tüpe aktarın.Besiyerini dikkatlice yeni DMEM ile değiştirin ve HEK293T hücrelerini gece boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, biri boş vektör transfeksiyonu ve diğeri GRHL2 transfeksiyonu için olmak üzere iki yeni 50 mL konik tüpe, mililitre başına iki µL 10 mg/mL polybrene ekleyin. Üç mL'lik bir şırınganın pistonunu çıkarın ve şırınganın ucuna 0,45 µm polietersülfon filtre takın.Daha önce toplanan viral besiyerini şırınganın gövdesine ekleyin ve polybrene içeren yeni 50 milliliter'lik konik tüplerden birinin içine enjekte edin. Bu adımı diğer örnek için de tekrarlayın. Ardından, RD hücrelerindeki besiyerini vakumlu aspirasyonla uzaklaştırın ve filtrelenmiş viral besiyeri örneklerinin her birinden iki mililitreyi RD plakasının ayrı kuyucuklarına ekleyin.RD hücrelerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, viral ortam toplama işlemini tekrarlayın ve daha önce enfekte edilmiş RD hücrelerini içeren aynı kuyucuklara enfeksiyon ortamı ekleyin. Viral ortam toplandıktan sonra HEK293T hücreleri atılabilir.Hücreleri iki gün daha inkübe edin. Yedinci günde, RD hücrelerini 1 mL PBS ile yıkayın, ardından her kuyucuğa 200 µL %0,05 trypsin ekleyin. 37 °C'de beş dakika inkübe edin.İki mililitre takviye edilmiş besiyeri ekleyin ve ardından hücre süspansiyonunu yeni 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 250 g'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra besiyerini aspire edin ve hücreleri %5 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilmiş bir mililitre DMEM içinde yeniden süspanse edin.Hücreleri akış sitometrisi hazırlığı için filtrelemek amacıyla, bir pipet kullanarak bir mililitre RD hücre süspansiyonunu steril 30 µm tüp üstü filtreden geçirerek akış sitometrisi tüplerine aktarın. Tüpleri buz üzerine yerleştirin. Bir akış sitometrisi kullanarak, EGFP pozitif hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 0,5 ml DMEM içeren 1,5 ml'lik mikro santrifüj tüplerine ayırın.Sıralanan hücreleri tekrar buz üzerine yerleştirin. Hem boş vektör hem de GRHL2 transdüksiyonlarından elde edilen EGFP pozitif hücreleri, 12 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına, toplam bir mililitre takviye edilmiş DMEM içerisinde ekleyin. Ardından hücreleri kültür için inkübatöre yerleştirin.Akış sitometrisi sonrası EGFP pozitif hücre verimi genellikle 50.000 ile 100.000 hücre aralığında olup oldukça düşüktür. Bu nedenle, bir sonraki adıma geçmeden önce hücrelerin 10 ila 14 gün daha kültüre edilmesi gerekebilir. Bir mikrocentrifüj tüpüne, her bir 50 µM miR-200 mimic örneğinden üç µL'yi 300 µL serumsuz medyuma ekleyin.Ayrı bir tüpe, 300 µL serumsuz medyuma 9 µL 50 µM negatif kontrol mikro RNA ekleyin. Ardından, başka bir mikrosantrifüj tüpüne, 600 µL serumsuz medyuma 6 µL siRNA spesifik transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bu karışımın 300 µL'sini, her biri iki miR karışımından biri için olmak üzere iki tüpe paylaştırın.Her bir miR karışımının 300 µL'sini, 300 µL'lik transfeksiyon reaktifi karışımı ile birleştirin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, her bir işlem için serumsuz ortamda mikrolitre başına 250 hücre olacak şekilde, 2.4 mL içinde MD vektörü veya GRHL2 eksprese eden 600.000 EGFP pozitif RD hücresinden oluşan bir hücre süspansiyonu hazırlayın.24 kuyucuklu bir plakada, altı kuyucuğun her birine 100 µL miR-200 veya negatif kontrol karışımı ekleyin. Ardından, her bir miR karışımının bulunduğu üçer kuyucuğa, her bir hücre süspansiyonundan 400 µL ekleyin. Plakayı 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, besiyerini tam takviyeli DMEM ile değiştirin. İki gün sonra hücreleri uygun tampon çözelti kullanarak analiz için toplayın. Otomatik bir canlı hücre görüntüleyici ve 10X objektif kullanarak her bir kuyuyu iki saatte bir görüntüleyin.Bu zaman atlamalı görüntüler, GRHL2, EGFP ve miR-200 miRNA'larını eksprese eden RD hücrelerinde mezenkimal-epitelyal geçişi veya MET'yi göstermektedir. Hücreler, artan hücreler arası adezyonlar ve daha yuvarlak bir morfoloji ile iğ şeklinden parke taşı görünümüne dönüşür. Diğer tedavi koşullarında MET gözlemlenmemiştir.Bunun yerine hücreler, az sayıda hücreler arası tutunmaya sahip, uzamış, iğ şeklinde bir morfoloji sergiler. MET indüksiyonu sırasında, GRHL2 ve miR-200 aşırı ekspresyonu üzerine RD hücrelerinde meydana gelen morfolojik değişim, qPCR ve western blotting ile ölçüldüğü üzere, epitelyal belirteç E-cadherin'in yukarı regülasyonu ile birlikte seyretmiştir. miR-200s eklenmesi tek başına E-cadherin'i yukarı regüle etmiş, ancak kombine miR-200s ve GRHL2 aşırı ekspresyonu E-cadherin ekspresyonunu sinerjik olarak artırmıştır.İmmünofloresans mikroskobisi ile gösterildiği üzere, beyaz oklarla belirtilen epitel yapışma molekülleri EpCAM ve TJP-1'in hücreden hücreye bağlantılarında bir artış meydana gelmiştir. Epitel proteinlerinin yukarı regülasyonuna, QRT-PCR ile belirlenen mezenkimal genler ZEB1 ve Notch1'in aşağı regülasyonu eşlik etmiştir. MET indüksiyonu, yumuşak agar büyüme analizleri ile ölçüldüğü üzere, RD hücrelerinin anchorage-bağımsız büyümesini azaltmıştır.Yumuşak agardaki büyüme inhibisyonu yalnızca miR-200'ler tarafından yönlendirildi, çünkü GRHL2'nin aşırı ekspresyonu ankorajdan bağımsız büyümede artışa yol açtı. Bu durum, GRHL2 ekspresyonunun ankorajdan bağımsız büyümeyi indüklediğini gösteren önceki raporlarla tutarlıdır. Bu prosedürün ardından, sarkomlarda MET'in fenotipik sonuçlarını aydınlatmak amacıyla hücre migrasyonu, invazyon, metastaz ve tedaviye yanıtla ilgili değişiklikleri ölçen assayler dahil olmak üzere diğer yöntemler uygulanabilir.

induction-of-mesenchymal-epithelial-transitions-in-sarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Doku mühendisliği fibroblast türevli doğal matris epitel hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını destekleyen bir stromal alt-tabakayı üretmek için gelişmekte olan bir araçtır. Burada tümör hücre biyolojisi farklı stromal hücre tiplerinin etkisini değerlendirmek için bu yöntemi uygulayarak bir protokol sunulmuştur.

Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Burada, epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren mezenkimal hücrelerde kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesini ve uygulanmasını açıklıyoruz.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.

Tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasında ekstrasellüler vezikül aracılı iletişim tanımlamak için osteosarkom preklinik fare modeli

Tümör Başlatan hücrelerin insan sarkomu hasta türevi xenograflarından floresan-aktif hücre sıralama ile yalıtılması için ayrıntılı bir protokol tanımlayarak, insan lökosit antijen-1 (HLA-1) ' i negatif bir işaret olarak kullanarak ve daha fazla doğrulama ve Bu HLA-1-negatif tümör başlatma hücrelerinin karakterizasyonu.

Sarkom hasta türevi xenografts tümör-başlatma hücrelerinin yalıtım ve karakterizasyonu

Hücresel sinyal yolları içinde EndMT ilgili soruşturma için yararlı olan endotel mezenkimal geçiş (EndMT), vitro indüksiyon için bir protokol açıklanmıştır. Bu deneysel modelinde, TGF-β MS-1 endotel hücreleri ile tedavi tarafından EndMT indüklenen.

Mezenkimal endotel geçiş büyüme faktörü β sinyal dönüşüm tarafından indüklenen moleküler Analizi

Kemik hücre dışı Matriks (BEM) modeli osteosarkom (OS) için de kurulan ve gösterilen işte. Bu uygun bir iskele birincil tümör büyüme vitro taklit ve OS histolojik ve cytogenic heterojenlik eğitim için ideal bir model sağlamak için kullanılabilir.

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Bu sinyalleme yolunda yer alan protein ve gen ekspresyonlarını inceleyerek TGF-β sinyallerini ve TGF-β kaynaklı EMT'yi araştırmak için sistematik bir iş akışı tanımlıyoruz. Yöntemler arasında Batı şişkinliği, luciferaz muhabiri tahlili, qPCR ve immünoresans lekeleme saydır.

Meme Kanseri ve Normal Hücrelerde TGF-β Sinyalizasyon ve TGF-β kaynaklı Epitel-mezenkimal Geçişin Incelenmesi

Mevcut protokol, Trombosit Aktive Edici Faktör (PAF) kaynaklı transformasyonu incelemek için modifiye edilmiş, dönüştürülmemiş bir meme epitel hücre hattı olan MCF10A'nın 3D 'üstte' kültürlerinin kurulmasını açıklamaktadır. İmmüno-floresan transformasyonu değerlendirmek için kullanılmış ve ayrıntılı olarak tartışılmıştır.

Üç Boyutlu Kültürlerde Fosfolipid Aracısı İndüklenmiş Transformasyon

Öğrenin, mikroRNA-200 ve GRHL2 kullanarak sarkoma hücrelerinde mezenkimal-epitel geçişini (MET) nasıl indükleyeceğinizi. Bu yöntem, kanser agresifliği ve tedavi stratejileri üzerine önemli bilgiler sağlar.

Sarkoma Hücreler Mezenkimal-Epitel Geçişler endüklenmesi

Daha fazla video keşfet