Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Bu deneyin genel amacı, yeni nesil dizileme için uygun bitki yaprak dokusundan hem plastid hem de mitokondri DNA'sı olmak üzere yüksek kaliteli organel DNA'sını izole etmek için kullanılan iki yöntemi karşılaştırmaktır. Bu yöntemler, taksonlar arasındaki organel çeşitliliğinin kapsamı ve organel genom dizisi veya yapısındaki değişikliklerin gelişimi ve stres tepkisini nasıl etkilediği gibi bitki biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. İki tekniği, belirli bir organel tipini zenginleştiren diferansiyel santrifüjleme yöntemini ve daha küçük donmuş doku örneklerinden toplam organel DNA'sını geri kazanan meta fraksiyonlama tekniğini karşılaştıracağız.

Buğday fidesi yetiştirmek için standart prosedür, köşe başına dört ila altı tohum bulunan kare saksılarda vermikülit içine tohum ekmektir. Saksıları 16 saatlik ışık döngüsüne sahip bir seraya aktarın. Bitkileri her gün sulayın.

Bitkileri çimlenme üzerine çeyrek çay kaşığı granül 20-20-20 MPK gübre ile ve çimlenmeden yedi gün sonra tekrar gübreleyin. Buğday fidelerinin, bitki tohumlarının ekilmesi ve standart prosedürde olduğu gibi bitkilerin bakımı için. Ancak saksıları karanlık bir büyüme odasına yerleştirin.

Bu fideleri karanlık bir büyüme odasında yetiştirmenin bir alternatifi, seradaki bitkileri uygun havalandırma ile örtmektir. Bu prosedürdeki ilk adım organelleri izole etmektir. Beş gram taze doku toplayın ve buz üzerinde soğutulmuş bir beherde soğuk, steril suda durulayın.

Makas kullanarak, yaprak dokusunu yaklaşık bir santimetrelik parçalar halinde doğrudan iki seramik taşlama silindiri içeren önceden soğutulmuş 50 milimetrelik bir tüpe kesin. Prosedür boyunca numuneleri buz üzerinde tutun. Çapraz kontaminasyonu önlemek için, numuneler arasındaki makası değiştirmek önemlidir.

Numuneleri çeker ocaktan alın ve her 20 mililitrelik tüpe 50 mililitre STE tamponu ekleyin. Numuneleri bir doku öğütme aparatında önceden soğutulmuş kriyojenik öğütme bloklarına yerleştirin ve numuneleri dakikada 1.750 dönüşte 30 saniye boyunca öğütün. Numuneleri yaklaşık bir dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Numune konumlarını döndürün ve dakikada 1.750 dönüşle 30 saniye daha öğütün. Numuneleri buz kovasına geri koyun. Her numune için, buzun içine yerleştirilmiş 50 mililitrelik temiz bir tüpe bir huni yerleştirin ve huniye bir kat filtrasyon bezi yerleştirin.

Filtrasyon bezini beş mililitre STE tamponu ile önceden ıslatın ve akışı koruyun. Homojenize dokuyu huniye dökün. Öğütme tüpünü 15 mililitre STE tamponu ile durulayın, duvarları ve kapağı durulamak için tüpü tekrar kapatın ve ters çevirin ve içindekileri huniye dökün.

Seramik taşları dikkatlice çıkarın ve ardından filtrasyon bezini huniye sıkın ve sıkın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için numuneler arasında eldivenleri değiştirin. Dökülmeyi önlemek için tüp kapaklarını parafin film ile sarın.

2.000 x G'de, dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından, peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire etmek için serolojik bir pipet kullanın ve sıkı bir sızdırmazlık contası olan 50 mililitrelik yüksek hızlı bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Bir teraziye küçük bir buz kabı yerleştirin, teraziyi yırtın ve her bir süpernatanı tartın.

Tüpleri 0.1 grama kadar dengelemek için STE tamponu kullanın ve ardından 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 18.000 x G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme tamamlandığında, numuneleri çeker ocak içine geri koyun ve süpernatanı atın. Peletin üzerine bir mililitre ST tamponu ekleyin ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak hafifçe yeniden askıya alın.

25 mililitrelik bir son hacim elde etmek için 24 mililitre ST tamponu ekleyin. Karıştırmak için boya fırçasını bir süspansiyon içinde hafifçe döndürün ve ardından boya fırçasını çıkarmadan önce tüm sıvıyı çıkarmak için bir tüpün yan tarafındaki boya fırçasına bastırın. Tüpleri dengeledikten sonra, 20 dakika boyunca dört santigrat derecede 18.000 x G'de santrifüjleyin.

Bu santrifüjleme sırasında, metin protokolünde açıklandığı gibi DNA'nın 1 çözeltisini hazırlayın ve numune başına 1.5 mililitrelik bir tüpe 200 mikrolitre ayırın. Santrifüjleme tamamlandığında, süpernatanı atın ve tüpü kurulayın. Her yüksek hızlı santrifüj tüpüne 300 mikrolitre STE tamponu ekleyin ve yumuşak bir boya fırçası kullanarak peleti yeniden süspanse edin.

Boya fırçasını, 200 mikrolitre DNA'nın 1 solüsyonunu içeren önceden hazırlanmış 1,5 mililitrelik tüpe yerleştirin ve fırçaya sıkışmış kalıntıları çıkarmak için boya fırçasını döndürün. DNA'nın 1 çözeltisini yüksek hızlı santrifüj tüpüne pipetleyin ve karıştırmak için hafifçe döndürün. Parafin filmi her tüpün üstüne sarın ve 37 santigrat derecede 30 dakika su banyosunda inkübe edin.

Kuluçka sırasında, döndürerek yavaşça karıştırın. Geniş delikli bir pipet ucu kullanarak, pelet karışımını tüpten nazikçe pipetleyin ve 1,5 mililitrelik düşük bağlayıcı bir tüpe yerleştirin. Yüksek hızlı santrifüj tüpüne 500 mikrolitre 400 milimolar EDTA, pH 8.0 ekleyin.

Kalan peleti tamamen çıkarmak için nazikçe pipetleyin ve EDTA'yı pelet karışımını içeren düşük bağlayıcı tüpe aktarın. Ters çevirerek yavaşça karıştırın. 18.000 x G'de, dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı atın, her tüpü kurulayın ve peleti DNA izolasyonu için hemen kullanın. Bu yöntemde organel DNA, ticari DNA ekstraksiyon kolonları kullanılarak ekstrakte edilen toplam genomik DNA'dan zenginleştirilir. Üreticinin talimatlarına göre gerekli miktarda MBD2 FC proteinine bağlı manyetik boncuk hazırlayın ve reaksiyonları bir ila iki mikrogram toplam giriş DNA'sı kullanacak şekilde ölçeklendirin.

Bu gösteride, toplam giriş DNA'sının bir mikrogramı için 160 mikrolitre boncuk gereklidir. Metillenmiş nükleer DNA'yı yakalamak için, her bir numune için 160 mikrolitre MBD2 bağlı manyetik boncuk içeren bir tüpe bir mikrogram giriş DNA'sı ekleyin ve geniş delikli bir uçla hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. 1x'lik son konsantrasyon için uygun hacimde 5x bağlama yıkama tamponu ekleyin ve numuneyi karıştırmak için birkaç kez geniş delikli bir uçla yukarı ve aşağı pipetleyin.

Tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika döndürün. Aşağı çekme işleminin başarısı için, özellikle önemli boncuk topaklanması varsa, inkübasyon sırasında boncukların iyice karıştırılması çok önemlidir. Boncuk topaklanmasını önlemek ve metillenmiş DNA'nın aşağı çekilmesini sağlamak için, numuneleri geniş delikli bir pipet ucuyla nazikçe pipetleyin ve inkübasyon boyunca numuneleri iki ila üç kez hafifçe vurun.

DNA ve manyetik boncuk karışımını içeren tüpleri kısaca döndürün. Boncukları tüplerin yan tarafına toplamak için tüpleri en az beş dakika manyetik bir rafa yerleştirin. Çözelti berrak görünmelidir, metillenmemiş organellerle zenginleştirilmiş DNA içerir.

Geniş delikli uçlar kullanarak, boncukları rahatsız etmeden temizlenmiş süpernatanı dikkatlice çıkarın ve süpernatanı temiz, düşük bağlayıcı iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri 20 veya 80 santigrat derecede saklayın. Akut PCR testi, toplam genomik DNA'daki üç organele özgü implicon'un nispi bolluklarını ve her iki yöntemden elde edilen organel DNA fraksiyonunu değerlendirmek için kullanıldı.

Genel olarak, veriler diferansiyel santrifüjleme yönteminin tercihen mitokondri için zenginleştirdiğini göstermektedir. Metilfraksiyonlanmış toplam genomik DNA'nın metillenmemiş fraksiyonu, her iki organel implicon'un önemli ölçüde zenginleşmesini gösterir. Mitokondri veya kloroplast Çin baharı ve chris tarafından yetiştirilen buğday referans genomlarına eşlenen okuma yüzdeleri QPCR sonuçlarıyla tutarlıdır.

Diferansiyel santrifüjleme, mitokondri DNA'sı açısından daha zenginleştirilmiş DNA verir ve metilfraksiyonlama, muhtemelen iki organel genomunun doğal bolluğunu yansıtan DNA verir. E dahil olmak üzere numune etiketleri, idillenmiş numuneleri belirtir ve NE, idillendirilmemiş numuneleri belirtir. İlginçtir ki, idyllation organel bolluklarını değiştirmedi.

Her iki yöntemde de, mitokondri veya kloroplast referanslı genomların teorik kapsamı, 12 kütüphane atremultipleks edildiğinde bile 100x kapsama alanını aşıyor. Toplam genomik DNA, alan sonrası jel elektroforezinde dağınık bir yayma olarak göç eder ve 50 kilobazları aşar. Metilfraksiyonasyondan sonra nükleer fraksiyonun boyutu küçülür, ancak 50 kilobaz etrafında merkezlenmiş kalır, bu da metilfraktioantlı DNA'nın uzun okuma dizilimi için en uygun olduğunu düşündürür.

Bir kez ustalaştıktan sonra, her iki organel DNA ekstraksiyon tekniği, uygun şekilde yapılırsa, numune toplamadan nihai ürünün değerlendirilmesine kadar bir ila iki gün içinde yapılabilir. Metilfraksiyonlama tekniği, doku girdileri son derece düşük olduğundan, organel DNA çalışmalarının yelpazesini nadir ve zor örneklere büyük ölçüde genişletme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, aşağı akış çalışmaları için yalnızca mitokondri DNA'sı gerektiğinde diferansiyel santrifüjleme hala tercih edilebilir.

Benzer şekilde, santrifüjleme adımları, istenirse tercihen plastid DNA'yı çıkarmak için ayarlanabilir. Her iki organel DNA ekstraksiyon yöntemi, yeni nesil dizileme için uygun DNA verir, ancak metilfraksiyonlama, uzun okuma dizilemesi için ideal olan yüksek moleküler hızlı DNA verir.