In Vitro Görüntüleme ve floresan etiketli GnRH Analoglarının İlaç Hedefleme Etkinliğinin nicelleştirmesinde

Bu prosedürün genel amacı, insan kanser hücre kültürlerinde GnRH bazlı ilaç taşıyıcı sistemlerin etkinliğini araştırmak ve tahmin etmektir. Bu yöntem, farklı insan kanser türlerinin hücrelerinin GnRH hedefli anti-kanser ilaçlarını ne kadar verimli kullandığı gibi, hedeflenen anti-kanser tedavisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin temel avantajı, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi analizinin aynı anda kullanılmasına izin veren yeni floresan etiketli GnRH analogları kullanmasıdır.

Bu tekniğin etkileri, anti-kanser tedavisine doğru uzanır, çünkü GnRH reseptörleri çeşitli kanser hücre tiplerinde yüksek oranda eksprese edilir ve bunların seçici olarak hedeflenmesini sağlar. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Bianka Gurbi olacak. Başlamak için, kültürlenmiş ortamı, tohumlanmış bir mikroskobik slaydın yedi oyuğunun her birinden çıkarın.

Daha sonra, negatif kontrol kuyusuna 250 mikrolitre önceden ısıtılmış tam ortam ve kalan altı kuyucuğun her birine 250 mikrolitre önceden ısıtılmış GnRH fit tohum işleme ortamı ekleyin. Slaytı bir inkübatörde 37 santigrat derecede, beş saat boyunca yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Beş saatlik inkübasyondan sonra, ortamı her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra, her bir oyuğa 250 mikrolitre sabitleme çözeltisi ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Hücreler sabitlendikten sonra, sabitleme solüsyonunu atın ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Her bir oyuğa PBS'de hazırlanan 250 mikrolitre beş mikromolar floresan prob çözeltisi ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Floresan prob çözeltisini çıkardıktan sonra, hücreleri 250 mikrolitre PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın. Son olarak, her bir kuyucuğa üç ila dört damla montaj ortamı ekleyin. Mikroskop altında görüntülenene kadar slaytı oda sıcaklığında karanlıkta tutun.

Kültürlenmiş ortamı, tohumlanmış bir mikroskobik slaydın beş oyuğunun her birinden çıkarın. Daha sonra, önceden ısıtılmış tam ortamdan 250 mikrolitre negatif kontrol kuyusuna ve işlenmemiş hücrelerle birlikte ikinci kuyuya ekleyin. Kalan üç oyuktaki hücreleri, 10 mikromolar GnRH FITC içeren önceden ısıtılmış tedavi ortamı ile ön işlemden geçirin.

Slaytı bir inkübatörde 37 santigrat derecede, bir saat boyunca yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. Daha sonra, ortamı sadece işlenmiş hücrelerden çıkarın ve hücreleri önceden ısıtılmış tam ortamdan 250 mikrolitre ile yıkayın. Ardından, yıkama ortamını çıkarın.

Ardından, üç kuyucuğun her birine 250 mikrolitre önceden ısıtılmış tam ortam ekleyin. Slaytı bir inkübatörde 37 santigrat derecede, bir saat boyunca yüzde beş karbondioksitte inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı beş kuyucuğun hepsinden atın ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın.

Daha sonra PBS'yi çıkarın ve hücreleri 250 mikrolitre sabitleme solüsyonu ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin. Daha sonra, sabitleme solüsyonunu atın ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Her bir oyuğa 250 mikrolitre engelleme çözeltisi ekleyin ve slaytı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Negatif kontrol hariç her kuyucuktan bloke edici çözelti aspire edin. Hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkadıktan sonra, her oyuğa 250 mikrolitre primer antikor çözeltisi ekleyin. Slaytı oda sıcaklığında karanlık bir yerde bir saat inkübe edin.

Beş kuyucuğun her birinden çözeltileri çıkarın ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Ardından, PBS'yi çıkarın ve 250 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Slaytı karanlıkta bir saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.

Çözeltiyi her bir kuyucuktan aspire edin ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile yıkayın. Yıkama PBS'sini çıkarın ve ardından her bir oyuğa beş mikromolar floresan prob içeren 250 mikrolitre PBS ekleyin. Slaytı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Floresan prob çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın ve hücreleri 250 mikrolitre PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın. Son olarak, her bir kuyucuğa üç ila dört damla montaj ortamı ekleyin. Mikroskop altında görüntülenene kadar slaytı karanlıkta oda sıcaklığında tutun.

Hücreleri ters çevrilmiş bir konfokal lazer tarama mikroskobu altında görüntüleyin. 488 nanometre ve 633 nanometre lazerleri açın. Lazer amplifikasyonunu ve iğne deliği boyutunu kontrol edin.

Negatif kontrol örneğini görüntüleyin. Çekirdek için gözlemlenen sinyali optimize edin ve FITC ve Alexa 546'nın sinyalini sıfıra yakın olacak şekilde ayarlayın. Ardından, aynı parametreleri kullanarak, muamele edilen numuneleri görüntüleyin.

Tohumlanmış bir kültür plakasının yedi kuyusunun tümünden tüm ortamı atın. Daha sonra, negatif kontrol kuyucuğuna bir mililitre önceden ısıtılmış tam ortam ve kalan altı kuyucuğa bir mililitre önceden ısıtılmış işlem ortamı ekleyin. Plakayı bir inkübatörde 37 santigrat derecede, beş saat boyunca yüzde beş karbondioksitte inkübe edin.

Ortamı tüm kuyucuklardan attıktan sonra, hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın. PBS'yi çıkarın ve ardından her bir oyuğa 500 mikrolitre Tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrılana kadar plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin, bu yaklaşık 10 dakika sürecektir.

Bir mililitre tam ortam kullanarak, her bir kuyucuktaki Tripsin'i nötralize edin ve plakayı sallayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe pipetleyerek askıya alın. Süspansiyonları ayrı FACS tüplerine aktarın ve numuneleri dört dakika boyunca dört santigrat derecede 150 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatantları dikkatlice boşaltın. Ardından, her bir FACS tüpüne 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse edin. FACS tarafından analiz edilene kadar tüpleri buz üzerinde tutun.

Burada farenks karsinomu hücrelerinde GnRH tutulumunun analizi sunulmuştur. Bir mikromolar GnRH floresan kompleksi ile beş saatlik tedavi, farenks kanseri hücrelerinde lokalize yeşil floresan sinyali olarak ortaya çıkan hafif, ancak ayırt edilebilir bir alımla sonuçlandı. Kompleks dozajın ek artışı, farenks karsinomu hücrelerinde GnRH alımının doz bağımlılığını gösteren gelişmiş alıma yol açtı.

Akciğer kanseri hücrelerinde GnRH'nin reseptöre bağlı alımı ve reseptöründeki ligandın hücresel dağılımı, floresan GnRH kompleksi ile eş zamanlı tedavi ve tip bir GnRH reseptörü ve çekirdeğinin boyanması ile analiz edildi. Sonuçlar, tip bir GnRH reseptörünün hücre zarı ile ilişkili olduğunu, GnRH proteininin ise hücrelerde içselleştirildiğini ve sitoplazmalarında kaldığını göstermektedir. Farenks karsinomu hücrelerinde GnRH tutulumu da FACS analizi kullanılarak incelenmiştir.

Sonuçlar, hücreler bir mikromolar GnRH konjugatı ile tedavi edildiğinde gözlenen GnRH alımının, hücrelere uygulanan doz 10 mikromolar ile arttırıldığında güçlü bir şekilde arttığını göstermektedir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa sekiz saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, işlem görmüş numuneleri ve floresan boyaları doğrudan ışıktan korumayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, GnRH hedefli ilacın belirli bir kanser türünün büyümesini ne kadar verimli bir şekilde inhibe edebileceği gibi ek soruları yanıtlamak için hücre canlılığı veya apoptoz tahlilleri gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu gelişmeden sonra bu teknik, kanser tedavisi alanındaki araştırmacıların, GnRH bazlı ilaç taşıyıcı sistemlerin kanser hücrelerinin yapışmasındaki etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, kanser hücrelerinin GnRH hedefli tedavilere duyarlılığını araştırmak için bu floresan etiketli GnRH konjugatlarının nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.