metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

Bu örnekleme yönteminin genel amacı, Tandem Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi ile yapılacak sonraki nicelleştirmeler için Staphylococcus aureus'dan metabolit örnekleri toplamaktır. Laboratuvarımız, insan sağlığıyla ilgili bakterilerde metabolizma ve patogenez arasındaki etkileşimi incelemekle ilgilenmektedir. Şu anda, model organizma olarak insan fırsatçı patojeni Staphylococcus aureus'u kullanıyoruz.

Yanıtlamak istediğimiz temel sorulardan biri, bakterilerin konak enfeksiyonu sırasında besin tükenmesiyle karşılaştıklarında fizyolojilerini ve patojenitelerini nasıl ayarladıklarıdır. Bu teknik, aktif olarak büyüyen hücrelerdeki birçok metabolik yolak arasında spesifik metabolitlerin dağılımına dair, fizyolojik durumlarını minimum düzeyde bozarak anlık bir görüntü sunduğu için avantajlıdır. Başlamak için, donmuş gliserol stoktan ilgili S.aureus suşlarını izolasyon için tryptic soy agar üzerine ekim yapın.

Hücreleri 37 °C'de 16-24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, steril cam inkübasyon tüplerindeki 4 mL triptik soya suyu veya TSB'yi, her suşun tek kolonileriyle ekimleyin. Kültürleri, rotasyonla eğimli bir şekilde 37 °C'de 16-20 saat boyunca inkübe edin.

Kültürlerin 600 nanometredeki optik yoğunluğunu (kısaca OD600) ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bu ölçümü baz alarak, hücreleri 250 mL'lik Delong erlenlerinde, 50 mL steril TSB besiyeri içinde 0,05 OD600 değerine seyreltin. Kültürleri, 37 °C sıcaklıktaki bir benmari banyosunda 280 rpm hızda çalkalayarak inkübe edin.

Her 30 dakikada bir OD600 ölçümleri yapın. Optik yoğunluklar arttıkça, kültürlerin spektrofotometrenin lineer absorbans aralığında kalmasını sağlamak için TSB ile seyreltilmesi gerekebilir. Hücreler büyürken, metin protokolünde açıklandığı şekilde mevcut olan en yüksek saflıktaki reaktifleri kullanarak ekstraksiyon tampon çözeltilerini taze olarak hazırlayın.

Kültürlerin OD600 değeri 0,8 ile 1,0 arasına ulaştığında, bunları 50 mL taze ön ısıtılmış TSB içine 0,01 ile 0,05 OD600 değerine gelecek şekilde alt kültüre aktarın ve inkübasyon ile ölçüm adımlarını tekrarlayın. Cam kap, buz kovası veya soğutucu gibi uygun bir kapta kırılmış kuru buz yatağı hazırlayın. Kültürlerin optik yoğunlukları istenen hasat noktasına yaklaştığında, 35 mm'lik işlem görmemiş bir petri kabına 1 mL saptırma (quenching) çözeltisi ekleyin ve kuru buz üzerinde en az 5 dakika ön soğutma yapın.

Bizim amaçlarımız için istenen hasat noktası, yaklaşık 0.4 ile 0.5 arasındaki bir optik yoğunluktur. Ancak bu değer, deneysel hedeflere bağlı olarak değiştirilebilir. Ardından, kauçuk bir tıpa içerisine paslanmaz çelik bir filtre frit yerleştirin ve bunu merkezi vakum sistemine veya bir vakum pompasına bağlı bir vakum erleninin üzerine yerleştirin.

Vakumu uygulayın ve üzerine karma selüloz ester membran yerleştirin. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için frit ile aynı çapta bir filtre kullanın. Belirli bir koşul altındaki metabolik bollukların anlık bir görüntüsünü sağlamak amacıyla, hücreleri toplamak ve metabolik aktiviteyi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde durdurmak kritik önem taşır.

Küçük gecikmeler bile hücrelerin kararlı durum fizyolojisini etkileyebilir. OD600 değeri 0,4 ile 0,5 arasındayken, balondan 13 mL kültür almak için serolojik pipet kullanın. Örneği vakit kaybetmeden filtreye uygulayın.

Tüm numune filtrelendikten sonra, besiyeriyle ilişkili metabolitleri uzaklaştırmak için filtreyi derhal 5 mL'den fazla olmayan buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Ardından vakumu kesin ve filtreyi fritten çıkarmak için bir çift steril cımbız kullanın. Filtreyi, önceden soğutulmuş sönümleme çözeltisinin içine ters çevirerek yerleştirin.

Filtreyi, kuru buz üzerinde, söndürme çözeltisi içerisinde en az 20 dakika inkübe edin. Steril cımbız kullanarak filtreyi petri kabı içerisinde ters çevirin ve hücreleri membrandan söndürme çözeltisine durulamak için bir mikropipet kullanın. Hücreleri söndürme çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonunu, yaklaşık 100 µL 0.1 mm silika boncuk içeren steril 2 mL darbe dayanımlı bir tüpe aktarın.

Bunu kuru buz üzerinde veya -80 °C'de saklayın. Metabolit ekstraksiyonuna başlamak için, önce örnekleri ıslak buz üzerinde çözdürün. Ardından, hücreleri bir homojenizatörde, döngüler arasında kuru buz üzerinde iki dakikalık soğutma süreleri olacak şekilde, 6000 rpm'de 30 saniyelik dört kısa darbe ile parçalayın.

Lizatları, önceden soğutulmuş bir soğutmalı mikrosantrifüj tüpünde maksimum hızda 15 dakika boyunca berraklaştırın. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Metin protokolünde açıklandığı üzere, kalıntı peptit içeriğinin miktar tayini için numunenin küçük bir kısmını bir mikropipet kullanarak mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Numunenin geri kalanını 80 °C'de saklayın. Metabolitlerin sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile analizi için metin protokolüne başvurun. CodY proteini, bu besinlerin konsantrasyonundaki düşüşe yanıt olarak düzinelerce genin ekspresyonunu ayarladığından, dallı zincirli amino asit tükenmesini incelemek için CodY null mutantı kullanılmıştır.

codY mutasyonu, S.aureus hücrelerinin büyüme hızı üzerinde çok az etkiye sahiptir. 3. saatteki optik yoğunluktaki düşüş, hasat öncesindeki hücre bölünme sayısını artıran ve gece boyu büyüme sırasında biriken çeşitli molekülleri seyrelten geri seyreltme adımını göstermektedir. İki suşun transkriptomlarının RNA dizileme analizi, aspartat amino asit ailesinin sentezinde yer alan genlerin ekspresyonunda anlamlı değişiklikler olduğunu göstermektedir.

Burada, gen isimlerinin altındaki sayılar, vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında codY null mutantındaki ekspresyondaki kat değişimini göstermektedir. Ekstrakte edilen metabolitlerin LC-MS kantifikasyonunu takiben, iki suş arasındaki bolluklar karşılaştırılmıştır. Aspartat amino asit ailesi ile ilgili bazı bileşiklere odaklanıldığında, aspartat ve O-asetilhomoserin gibi öncüllerin bolluklarının codY mutantında azaldığı görülmektedir.

Buna karşılık, treonin ve izoleusin gibi uç ürünler artış göstermiştir. Burada kesikli çizgi, bu deney için bolluktaki değişimlerin eşik değerini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi ile miktar tayini yapmak üzere Staphylococcus aureus'tan metabolitlerin nasıl hasat edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu protokol, modifikasyonlarla diğer bakteri türlerinden metabolit hasadı için de uygundur. Bakteriler dinamik ortamlara tepki verdiğinden, örnekleme tarafından tetiklenen potansiyel fizyolojik değişiklikleri en aza indirmek için filtreleme ve yıkama adımlarının hızlıca gerçekleştirilmesi önemlidir. Değişiklikler, örnekleme sırasında frit ve PBS soğuk tutularak da en aza indirilebilir.