Name: metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım Stafilokok aureus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, Staphylococcus aureus metabolitlerini tandem sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, bakteri metabolizması ve patojenite ilişkisini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, bir Kurtuluş Ödülü NIH Pathway (GM 099893 hibe) ve fakülte başlangıç ​​fonları SRB yanı sıra bir Araştırma Projesi Grant (GM 042219 hibe) tarafından kısmen finanse edildi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayın için çalışmalarını göndermek için karar hiçbir rolü olmuştur.

Tampon çözeltiler hazırlanması 1. <ol><li> fosfat tamponlu tuzlu su hazırlama, ultra saf ile 1x nihai bir konsantrasyona kadar 10 x PBS stok çözelti seyreltilerek (PBS, pH 7.4) (distile ve deiyonize) su. </li><li> 2 ml asetonitril içindeki, 2 ml metanol, ultra saf H2O 1 mL ve formik asit 19 uL (0.1 mM son konsantrasyon) birleştirerek söndürme çözeltisi hazırlayın. </li><li> LC-MS, aşırı saf su, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) ilave etmek suretiyle, bir çözücü hazırlanır. </li><li> asetonitril, formik asit (% 0.2 [hacim / hacim] nihai konsantrasyon) eklenerek LC-MS solvent B hazırlayın. Not: Bütün çözeltiler yüksek saflıkta reaktifler elde edildi (genellikle, yüksek performanslı sıvı kromatografi sınıfı) kullanılarak hazırlanmalıdır. Çözümler her deneyden önce taze hazırlanmış ve kullanımdan önce buz üzerinde muhafaza edilmelidir. </li></ol> Kararlı hal S. aureus Büyüme 2. Kurulması <ol><li> Streak S. aureuBir dondurulmuş gliserol stokundan triptik agar (TSA) üzerinde izolasyonu için ilgi lar suşları. 16-24 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> triptik soya suyu (TSB) ya da her bir suşun tek koloniler ile steril cam inkübasyon tüplerde başka bir uygun ortam içinde 4 mL inoküle. eğimli inkübe (~ 70 ° açı) 16-20 saat boyunca 37 ° C&#39;de dakika (rpm) 60 rotasyon dönme ile. Not: Hücresel fizyolojisini etkiler, burada aşama 2.2 tarif edilenler de dahil olmak üzere, standart yöntemler kullanıldığında, gece boyuncaki kültürleri oksijen gradyanlar yatkındır. Böylece, (bkz adımlar 2,4-3,2, aşağıda) biyolojik kararlı durum sağlamak için çoklu arka seyreltme stratejisini kullanır. </li><li> 600 nm (OD 600) de aşama 2.2 kültürlerin optik yoğunluğunun ölçülmesi için bir spektrofotometre kullanılır. bir optik referans (boş) olarak steril ortamı kullanın. Steril TSB ortamı 0.05 50 mL&#39;lik bir OD 600 bu hücrelerin seyreltin ayrı olarak, 250 mL DeLong şişelerinde (37 ° C&#39;ye kadar önceden ısıtılmış). </li><li> incukesmek 280 rpm&#39;de çalkalanarak, bir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de kültür. </li><li> Her 30 dakika, 600 ölçüm OD almak; Optik yoğunluklar arttıkça, bunların spektrofotometrenin doğrusal nüfuz aralığında kalacak şekilde TSB kültürleri seyreltilmesi için gerekli olabilir. </li><li> Adım 2.5 kültürler ~ 0.8-1.0 OD 600 elde zaman, 0.01-0.05 OD&#39;ye 600-37 ° C TSB 50 mL içine alt-kültürü ve tekrar 2.4 ve 2.5 adımları tekrarlayın. </li></ol> 3. Numune Toplama Kur <ol><li> Uygun bir kap içinde ezilmiş kuru buz dolu bir yatak hazırlayın (örneğin, cam tabak, buz kovası veya soğuk). </li><li> kültürlerin optik yoğunlukları arzu edilen hasat noktası yaklaştıkça, ≥5 dakika boyunca 35 mm işlemden geçirilmemiş olan Petri çanağı ve kuru buz üzerinde ön-soğutma çözeltinin söndürülmesi 1 ml. NOT: &quot;İstenilen hasat noktası&quot; deneysel hedeflerine bağlı olarak değişecektir. Örneğin, tek bir m incelemek için olanetabolites aerobik büyüme sırasında, bu durumda ana göstergeleri asetat atılımı ve post-üstel gelişme fazı 32, 33 boyunca asetat yeniden asimilasyon bulunmaktadır. Genel olarak, bu noktada, özel bir gelişme aşamasında (örneğin, üstel faz) içinde olmalıdır. Bu aşamada ilişkili belirli OD600 değerleri farklı bakteriyel suşlara ve büyüme ortamı arasında değişebilir. </li><li> Bir kauçuk tıpa içinde (-20 ° C&#39;ye kadar önceden soğutulmuş) bir paslanmaz çelik filtre hamuru yerleştirin ve bir ev tipi vakum veya vakum pompasına bağlı bir vakum şişesi üstüne yerleştirin. </li><li> vakum uygulayın ve üstüne bir karışık selüloz ester zarı (0.22 um gözenek boyutu) yerleştirin. NOT: frit eşit bir çapa sahip olan bir filtre kullanımı ve uygun örnek bir filtreden yerine kenar üzerine çekilir emin olmak için bu filtre merkezi kritiktir. Buz soğukluğunda steril H membran ıslatma 2 O yardımcı olabilirbir membran yerleştirmek ile. </li></ol> 4. Örnek Hasat <ol><li> OD 600 ~ 0.4-0.5 &#39;de, şişeye kültüre 13 mL kaldırmak için serolojik bir pipet kullanın ve filtreye örnek uygulamak. </li><li> Numunenin tamamı, filtre edildikten sonra, hemen orta ilişkili metabolitleri yıkamak için buz soğukluğunda PBS ≥5 mL ile filtre yıkayın. </li><li> vakum ayırın ve frit filtreyi kaldırmak için steril bir cımbız kullanın. Önceden soğutulmuş söndürme çözeltisi içine filtre (hücre tarafı aşağı) ters çevirin. Sıvı metabolik aktiviteyi kontrol altına alınması, hücrelerin hızlı söndürme sağlamak için kaldırılmıştır kısa sürede (saniye içinde, örneğin) hızlı bir şekilde yukarıdaki adımları gerçekleştirmek için önemlidir ve: NOT. </li><li> ≥20 dakika boyunca kuru buz üzerinde soğutma çözelti içinde filtre inkübe edin. </li><li> Petri kabındaki filtre (hücre tarafı yukarıda) tersine ve t ve hücreler durulama için bir mikropipet kullanarak steril cımbız kullanarako söndürme çözeltisi içine membrana. </li><li> ve söndürme çözeltisi içinde hücreler süspansiyon haline yeniden daha sonra 0.1 mm silis boncuklar ~ 100 uL içeren steril 2 ml darbeye dayanıklı tüp hücre süspansiyonu aktarın. kuru buz üzerinde ya da -80 ° C&#39;de bu saklayın. </li></ol> 5. metabolit Ekstraksiyon <ol><li> ıslak buz üzerinde çözülme örnekler ve döngüler arasındaki kuru buz üzerinde 2 dakika soğutma süreleri ile, 6,000 rpm&#39;de dört 30 s açılışları olan bir homojenleştiricide hücreleri parçalamak. </li><li> Maksimum hızda önceden soğutulmuş, soğuk mikrosantrifüj içinde 15 dakika için lizatları netleştirmek (yani ≤4 ° C&#39;de 18.213 x g&#39;de). </li><li> Temiz bir mikrosantrifüj tüpüne süpernatant aktarın. </li><li> Mikropipet kullanılarak, adım 6&#39;da kalıntı peptit içeriğinin miktarının belirlenmesi için bir mikrosantrifüj tüpüne numunenin çok küçük bir kısmını aktarmak; -80 ° C&#39;de kalan saklayın. Not: yedek numune hacmi aşama 6.1&#39;de kullanılan BCA bağlı olarak değişir. BuNumune derhal analiz için ıslak buz üzerinde saklanır ya da -80 ° C&#39;de donduruldu olmalıdır. </li></ol> 6. Bikinkoninik asit (BCA) deneyi <ol><li> Her bir örnek için kalıntı peptit konsantrasyonunu belirlemek için aşama 5.4 numuneleri kullanılarak, bu kit, üretici tarafından tavsiye edildiği gibi bir BCA deneyi gerçekleştirmek. </li></ol> 7. LC-MS <ol><li> LC-MS çözücü B 75 uL, 75 uL S. aureus özü, aşama 1.4&#39;te hazırlanan karıştırın. </li><li> Girdap 5 dakika boyunca 13.000 x g&#39;de karıştırın ve sıkma için. </li><li> bir sıvı kromatografisi (LC) şişenin içine yüzer maddelerinden 100 uL yerleştirin ve kapağı. hiçbir hava kabarcığı numunede sıkışıp emin olun. </li><li> LC-MS otomatik numune alıcı üzerine LC şişeleri yükleyin ve yazılımda çalışan listesini düzenlemek &quot;Çevrimdışı Çalışma Listesi Editör.&quot; <ol><li> &quot;Örnek Adı&quot; doldurun (örn vahşi tip-1), &quot;Örnek pozisyonu&quot; (örneğin, P1-A1), &quot;Yöntem&quot; (örneğin, Formik Acid-Negatif Yöntem) ve &quot;Veri Dosyası&quot; (örneğin, vahşi tip-1) sütun. düğmesi &quot;Kaydet Çalışma Listesi&quot; butonuna tıklayın. &quot;Kütle Spektrometresi Veri Toplama İş İstasyonu&quot; yazılım ve giriş önceden kaydedilmiş Çalışma listesi açın. Sürekli LC-MS ölçümü başlatmak için &quot;Başlat Çalışma Listesi Çalıştır&quot; butonuna tıklayın. </li></ol></li><li> LC sistemi ile TOF spektrometre, bir sütun üzerinde örnekleri Ayrı bir uçuş (TOF) spektrometrenin bir zamana sütun bağlantı ve çift. aşağıdaki gibi, bir mobil faz gradyanı kullanın: 0-2 dak% 85 solvent B; 3-5 dakika, 80% solvent B; 6-7 dk,% 75 çözücü B; 8-9 dk,% 70 çözücü B; 10-11,1 dakika,% 50 çözücü B; 11,1-14 dakika,% 20 çözücü B; ve 14,1-24 dakika,% 5 solvent B; % 85 Çözücü B 10 dakika yeniden dengeleme süresi ve 0.4 ml min-1 bir akış oranı ile sona erer. </li><li> Izokratik pompa kullanılarak, aynı anda toplu eksen kalibrasyonu olanak sağlamak için çalışma ile bir referans kütlesi çözeltisi aşılamak. NOT: Bu adımStandart TOF spektrometresi kılavuzunda dayanmaktadır. <ol><li> asetik asit D4 ve heksakis (1H, 1H, 3H-tetrafloropropoksi) referans kütlesi çözeltisi olarak phosphazine gerçek zamanlı kalibrasyonu gerçekleştirmek için karışımını kullanarak. 2.5 ml dak akış hızı ile izokratik pompa -1 infüzyon için kullanılır. </li></ol></li></ol> İyon sayar 8. Toplu düzeltme <ol><li> (1 çoğaltmak, örneğin, vahşi tip) bir toplu düzeltme için bir referans örnek olarak hizmet etmek için herhangi bir örnek belirtin. </li><li> Referans numune içindeki tüm metabolitler için iyon sayımı toplamını hesaplar. Tüm numuneler için bu hesaplamayı tekrarlayın. </li><li> oranı oluşturmak için, referans numunenin toplam iyon sayımı ile her bir numunenin toplam iyon sayısı bölün. </li><li> Her bir metabolit için bir toplu düzeltilmiş iyon sayımı elde etmek için örnek / referans oranı ile bir numune içinde her bir metabolitin iyon sayısı bölün. </li></ol> 9. Peptid Normalleştirme <ol><li> DHer bir metabolit için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için aşama 6&#39;da BCA analizi peptit konsantrasyonu ile adım 8&#39;de elde edilen her bir numune için seri düzeltilmiş iyon sayım değerlerinin ivide. Not: Aşama 9.1&#39;de elde edilen her bir metabolit için normalleştirilmiş, toplu toplu düzeltilmiş iyon sayısı ile doğrudan suşları arasında karşılaştırıldı ve istatistiksel analizi (-test örneğin, bir Mann-Whitney U) tabi tutulabilir. Seçenek olarak ise, bilinen bir metabolit değişmeden ya tedavisi veya genetik arka tarafından ayrışma metabolit nedeniyle değişiklikleri tespit etmek için bir değer olarak kullanılabilir olması. Ekstraksiyon tamponu L-norvalinyl veya gluraric asit, bilinen bir miktarının sisteme duhul edilmesi Örnek işleme 34 boyunca kaybını düzeltmek için kullanılabilir. </li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Tüm küçük moleküllü metabolitleri merkez metabolik yollardaki ortak kökenli aracılığıyla birbirine bağlanır. üstel büyüme sırasında, bakteriyel hücreler, belirli koşullar altında, fizyolojik durumunun bir görüntü sağlar, biyolojik ve metabolik kararlı halde bulunmaktadır. Cody ilv ve GTP yanıt vererek besin yeterliliğini izler. Ilv ve GTP havuzları damla olarak, Cody aktivitesi büyük olasılıkla artan besin tüketme 30 artan uyum, hedef genlerin ekspresyonunu ayarlama azalır. Bir Cody eksikliği suş...

Bakteriyel patojenler konak ortamında birçok zorluklarla uğraşmak zorundadır. Bağışıklık hücreleri tarafından doğrudan saldırısına ek olarak, ev sahibi de, bakterinin yaşamda kalması ve çoğaltma üreten beslenme bağışıklık 1, 2 temel besin ayrı tutmaktadır. Bu düşmanca ortamlarda hayatta kalmak için, bakteriyel patojenler virülans faktörleri dağıtın. Bu faktörlerin bazıları bakteriler bağışıklık karşılığına izin; diğer faktörler doku türevi bileşenleri 3, 4, 5, tüketerek eksik besin doldurmak için bakteri sağlayabilir, örneğin hiyaluronidaz, thermonuclease ve lipaz gibi sindirim enzimleri, salgılanan içerir. Gerçekten de, bakteriler virülans, 6 faktörleri 7 üretimine hücrenin fizyolojik durumunu bağlayan düzenleyici sistemleri gelişmiştir, <s<html> class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10 kadar. Artan miktarda kanıt vücut metabolizmasını ve virülans bağlayan kritik bir regülatör olarak Cody işaret ediyor. İlk dipeptit permeaz (DPP) gen 11 bir bastıncısı olarak Bacillus subtilis keşfedilmiştir, ancak Cody hemen hemen tüm düşük G + C Gram-pozitif bakteriler 12, 13 tarafından üretildiği bilinmektedir ve düzenler karbon katılan genlerin onlarca azot metabolizması 14, 15, 16, 17, 18, 19. Patojenik türlerde, Cody, en önemli hastalık oluşturma gen 20, 21 bazı ekspresyonunu kontrol,. ef &quot;&gt; 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody ligandların iki sınıf ile bir DNA-bağlama proteini olarak aktive edilir: dallı zincirli amino asitler (BCAAs, izolösin, lösin ve valin [ILV]) ve GTP transkripsiyonu bu besinler bol olduğunda., Cody bastırmaktadır (ya da bazı durumlarda, uyarır). bu besin sınırlı hale geldikçe, Cody aktivitesi aşamalı olarak azalır,-yolları yeniden merkezi metabolizmaya bağlı çeşitli metabolik yollar aracılığıyla öncüleri bir kademeli transkripsiyonel yanıt olarak ortaya çıkan 28, 29, 30. Kütle spektrometrisi (LC-MS) bağlanmış Tandem sıvı kromatografisi doğru küçük moleküllü hücre içi metabolitler 31 tanımlamak ve miktarını güçlü bir tekniktir. transkripsivonel ile eşleştirilmiş zamanriptome analizi (örneğin, RNA-Dizi), bu analitik akışı çevresel veya beslenme stres yanıt olarak oluşan fizyolojik değişiklikler hakkında fikir verebilir. Burada, LC-MS ile Staphylococcus aureus hücreleri ve daha sonra analiz metabolit ekstraksiyonu için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaklaşım S. aureus fizyolojisi üzerinde Cody pleiotropik etkilerini göstermek için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Malzeme / Ekipman a < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DeLong Kültür Şişesi (250 mL)</td><td>Belco</td><td>2510-00250</td><td></td></tr><tr><td>Yan Kol Şişesi, 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>5340</td><td></td></tr><tr><td>3 delikli Kauçuk Tıpa, #7</td><td>Fisher</td><td>14-131E</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Filtre tutucu / frit</td><td>VWR</td><td>89428-936</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı, 35 mm</td><td>Corning</td><td>430588</td><td>Doku kültürü ile işlem görmemiş</td></tr><tr><td>Karışık selüloz ester membranı, 0.22 & mu; m gözenek boyutu</td><td>Kırlangıç GSWP02500</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Darbeye dayanıklı tüpler, 2 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1420-9600</td><td></td></tr><tr><td>Silika Boncuklar, 0,1 mm</td><td>Biospec Products Inc</td><td>11079101Z</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 homojenizatör</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119-200-RD000.0</td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA Protein Test Kiti</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Cogent Diamond hidrit tip C sütunu</td><td>Agilent</td><td>70000-15P-2</td><td></td></tr><tr><td>Doğru-Kütle Uçuş Süresi (TOF) LC-MS, 6200 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G6230B</td><td></td></tr><tr><td>Quat Pompa, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G4204A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bin Pompası, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G4220A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Valf Tahriki, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G1107A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İzokratik Pompa, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G1310B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TCC, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G1316C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Örnekleyici, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G4226A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termostat, 1290 Serisi</td><td>Agilent</td><td>G1330B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><güçlü > Kimyasal< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Triptik Soya Suyu</td><td>Becton Dickinson</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar, Granül</td><td>Becton Dickinson</td><td>214530</td><td>Katı ortam %1,5 [a/h] agar</td></tr><tr><td>içerir Fosfat tamponlu salin (pH 7.4) 10x</td><td>Ambion</td><td>AM9624</td><td>Taze olarak ultra saf su</td></tr><tr><td>Asetonitril</td> <td>ile 1 katına kadar seyreltinFisher Scientific</td><td>A955-500</td><td>Optima LC-MS</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A456-500</td><td>Optima LC-MS; toksik</td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318</td><td>Kütle spektrometresi için,% 98</td></tr> <tr><td>< güçlü > Yazılım< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>MassHunter</td><td>Agilent</td><td>G3337AA</td><td></td></tr><tr><td><güçlü> Bakteriyel Suş</ güçlü></td><td><güçlü>Tür</güçlü</td><td>><güçlü>Suş</güçlü></td><td><güçlü>Genotip</güçlü></td></tr><tr><td>SRB 337</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td><td>vahşi tip</td></tr><tr><td>SRB 372</td><td>Staphylococcus aureus</td><td>USA200 MSSA UAMS-1</td> <td>& Delta; codY::erm</td></tr><tr><td colspan="4">aListelenen kimyasallar ve malzemeler açıklanan yönteme özgüdür ve standart laboratuvar kimyasallarını veya malzemelerini içermez.</td></tr></tbody></table>

metabolit analizi için bir tandem sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; stafilokok aureus</em

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

bakteriyel patojenler engellemek için bir çaba, ana sıklıkla enfeksiyon yerinde besinlerin kullanılabilirliğini sınırlamaktadır. Bu sınırlama düzenleyici faktörler hücresel metabolizmayı ayarlayarak, cevap hangi anahtar metabolitlerin bolluklarını değiştirebilir. Son yıllarda, proteinler ve RNA bir dizi hastalık oluşturma gen ekspresyonunun önemli regülatörleri olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, Cody proteini dallı zincirli amino asitler ve GTP seviyelerine yanıt ve yaygın olarak düşük G + C Gram-pozitif bakteriler ile muhafaza edilir. Staphylococcus aureus küresel regülatör olarak, Cody virülans ve metabolik genlerin onlarca ifadesini kontrol eder. Biz S. aureus Cody, kısmen, potansiyel konak ortamında karşılaşılan besin sınırlayıcı koşullara uyum sağlama çabası içinde olan metabolik durumunu değiştirmek için kullandığı varsayımında. Bu makale kütle spektrumu ile birleştiğinde sıvı kromatografisi kullanılarak S. aureus metabolitleri çıkarılması ve analiz edilmesi için bir yöntem tarif etmektedirtrometry, bu hipotezi test etmek için geliştirilen bir protokoldür. yöntem ayrıca, sürekli kemostat kültürlerin kullanmadan biyolojik kararlı duruma ve sürekli havalandırma sağlamak gibi titizlik ve tekrarlanabilirlik sağlayacaktır iyi uygulamaları, vurgulamaktadır. USA200 metisiline duyarlı S. aureus Bağıl UAMS-1 ebeveyn soy izole izogenik codY mutantı aspartat (örneğin, treonin ve izolösin) elde edilen amino asit önemli artışlar sergilemiştir ve (bunların ön azalır, örneğin aspartat ve O-asetilhomoserin ). Bu bulgular, bir RNA seq analizi ile elde edilen transkripsiyon veriler ile iyi bir korelasyon: Cody boş mutantta 10- ve 800-kat arasında up-regüle bu yolların genler idi. transcriptome ve metabolom küresel analizlerini Coupling çevresel veya beslenme stresle karşılaştıklarında bakteri phys içine potansiyel kavrayış sağlayan onların metabolizmasını değiştirebilir nasıl ortaya çıkarabilirbesin tüketme ile ilişkili iological değişiklikler enfeksiyon sırasında yaşadı. Bu bulgular, yeni anti-infektifler ve terapötik maddelerin geliştirilmesi için yol açabilecektir.

Biz zengin, karmaşık ortamda in vitro büyüme sırasında S. aureus hücre içi metabolit havuzları analiz ettik. Prensip kanıtı olarak, karşılaştırıldığında, metisiline duyarlı S. aureus osteomiyelit arasında metabolit profilleri UAMS-1 (vahşi tip [WT]) ve küresel bir transkripsiyonel düzenleyici Cody (Δ codY) 26 eksik izogenik soy izole eder. Protokol aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi kararlı durum, WT ve Cody soylarının ...

Burada, sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile, Staphylococcus aureus ve bunların daha sonraki analiz metabolitlerin ekstraksiyonu için bir protokol açıklar.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım<em&gt; Stafilokok aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Bu örnekleme yönteminin genel amacı, Tandem Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometrisi ile yapılacak sonraki nicelleştirmeler için Staphylococcus aureus'dan metabolit örnekleri toplamaktır. Laboratuvarımız, insan sağlığıyla ilgili bakterilerde metabolizma ve patogenez arasındaki etkileşimi incelemekle ilgilenmektedir. Şu anda, model organizma olarak insan fırsatçı patojeni Staphylococcus aureus'u kullanıyoruz.Yanıtlamak istediğimiz temel sorulardan biri, bakterilerin konak enfeksiyonu sırasında besin tükenmesiyle karşılaştıklarında fizyolojilerini ve patojenitelerini nasıl ayarladıklarıdır. Bu teknik, aktif olarak büyüyen hücrelerdeki birçok metabolik yolak arasında spesifik metabolitlerin dağılımına dair, fizyolojik durumlarını minimum düzeyde bozarak anlık bir görüntü sunduğu için avantajlıdır. Başlamak için, donmuş gliserol stoktan ilgili S.aureus suşlarını izolasyon için tryptic soy agar üzerine ekim yapın.Hücreleri 37 °C'de 16-24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, steril cam inkübasyon tüplerindeki 4 mL triptik soya suyu veya TSB'yi, her suşun tek kolonileriyle ekimleyin. Kültürleri, rotasyonla eğimli bir şekilde 37 °C'de 16-20 saat boyunca inkübe edin.Kültürlerin 600 nanometredeki optik yoğunluğunu (kısaca OD600) ölçmek için bir spektrofotometre kullanın. Bu ölçümü baz alarak, hücreleri 250 mL'lik Delong erlenlerinde, 50 mL steril TSB besiyeri içinde 0,05 OD600 değerine seyreltin. Kültürleri, 37 °C sıcaklıktaki bir benmari banyosunda 280 rpm hızda çalkalayarak inkübe edin.Her 30 dakikada bir OD600 ölçümleri yapın. Optik yoğunluklar arttıkça, kültürlerin spektrofotometrenin lineer absorbans aralığında kalmasını sağlamak için TSB ile seyreltilmesi gerekebilir. Hücreler büyürken, metin protokolünde açıklandığı şekilde mevcut olan en yüksek saflıktaki reaktifleri kullanarak ekstraksiyon tampon çözeltilerini taze olarak hazırlayın.Kültürlerin OD600 değeri 0,8 ile 1,0 arasına ulaştığında, bunları 50 mL taze ön ısıtılmış TSB içine 0,01 ile 0,05 OD600 değerine gelecek şekilde alt kültüre aktarın ve inkübasyon ile ölçüm adımlarını tekrarlayın. Cam kap, buz kovası veya soğutucu gibi uygun bir kapta kırılmış kuru buz yatağı hazırlayın. Kültürlerin optik yoğunlukları istenen hasat noktasına yaklaştığında, 35 mm'lik işlem görmemiş bir petri kabına 1 mL saptırma (quenching) çözeltisi ekleyin ve kuru buz üzerinde en az 5 dakika ön soğutma yapın.Bizim amaçlarımız için istenen hasat noktası, yaklaşık 0.4 ile 0.5 arasındaki bir optik yoğunluktur. Ancak bu değer, deneysel hedeflere bağlı olarak değiştirilebilir. Ardından, kauçuk bir tıpa içerisine paslanmaz çelik bir filtre frit yerleştirin ve bunu merkezi vakum sistemine veya bir vakum pompasına bağlı bir vakum erleninin üzerine yerleştirin.Vakumu uygulayın ve üzerine karma selüloz ester membran yerleştirin. Tüm hücrelerin toplandığından emin olmak için frit ile aynı çapta bir filtre kullanın. Belirli bir koşul altındaki metabolik bollukların anlık bir görüntüsünü sağlamak amacıyla, hücreleri toplamak ve metabolik aktiviteyi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde durdurmak kritik önem taşır.Küçük gecikmeler bile hücrelerin kararlı durum fizyolojisini etkileyebilir. OD600 değeri 0,4 ile 0,5 arasındayken, balondan 13 mL kültür almak için serolojik pipet kullanın. Örneği vakit kaybetmeden filtreye uygulayın.Tüm numune filtrelendikten sonra, besiyeriyle ilişkili metabolitleri uzaklaştırmak için filtreyi derhal 5 mL'den fazla olmayan buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Ardından vakumu kesin ve filtreyi fritten çıkarmak için bir çift steril cımbız kullanın. Filtreyi, önceden soğutulmuş sönümleme çözeltisinin içine ters çevirerek yerleştirin.Filtreyi, kuru buz üzerinde, söndürme çözeltisi içerisinde en az 20 dakika inkübe edin. Steril cımbız kullanarak filtreyi petri kabı içerisinde ters çevirin ve hücreleri membrandan söndürme çözeltisine durulamak için bir mikropipet kullanın. Hücreleri söndürme çözeltisi içinde yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonunu, yaklaşık 100 µL 0.1 mm silika boncuk içeren steril 2 mL darbe dayanımlı bir tüpe aktarın.Bunu kuru buz üzerinde veya -80 °C'de saklayın. Metabolit ekstraksiyonuna başlamak için, önce örnekleri ıslak buz üzerinde çözdürün. Ardından, hücreleri bir homojenizatörde, döngüler arasında kuru buz üzerinde iki dakikalık soğutma süreleri olacak şekilde, 6000 rpm'de 30 saniyelik dört kısa darbe ile parçalayın.Lizatları, önceden soğutulmuş bir soğutmalı mikrosantrifüj tüpünde maksimum hızda 15 dakika boyunca berraklaştırın. Santrifüj işleminin ardından, süpernatantı temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Metin protokolünde açıklandığı üzere, kalıntı peptit içeriğinin miktar tayini için numunenin küçük bir kısmını bir mikropipet kullanarak mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Numunenin geri kalanını 80 °C'de saklayın. Metabolitlerin sıvı kromatografisi ve kütle spektrometresi ile analizi için metin protokolüne başvurun. CodY proteini, bu besinlerin konsantrasyonundaki düşüşe yanıt olarak düzinelerce genin ekspresyonunu ayarladığından, dallı zincirli amino asit tükenmesini incelemek için CodY null mutantı kullanılmıştır.codY mutasyonu, S.aureus hücrelerinin büyüme hızı üzerinde çok az etkiye sahiptir. 3. saatteki optik yoğunluktaki düşüş, hasat öncesindeki hücre bölünme sayısını artıran ve gece boyu büyüme sırasında biriken çeşitli molekülleri seyrelten geri seyreltme adımını göstermektedir. İki suşun transkriptomlarının RNA dizileme analizi, aspartat amino asit ailesinin sentezinde yer alan genlerin ekspresyonunda anlamlı değişiklikler olduğunu göstermektedir.Burada, gen isimlerinin altındaki sayılar, vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında codY null mutantındaki ekspresyondaki kat değişimini göstermektedir. Ekstrakte edilen metabolitlerin LC-MS kantifikasyonunu takiben, iki suş arasındaki bolluklar karşılaştırılmıştır. Aspartat amino asit ailesi ile ilgili bazı bileşiklere odaklanıldığında, aspartat ve O-asetilhomoserin gibi öncüllerin bolluklarının codY mutantında azaldığı görülmektedir.Buna karşılık, treonin ve izoleusin gibi uç ürünler artış göstermiştir. Burada kesikli çizgi, bu deney için bolluktaki değişimlerin eşik değerini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi ile miktar tayini yapmak üzere Staphylococcus aureus'tan metabolitlerin nasıl hasat edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu protokol, modifikasyonlarla diğer bakteri türlerinden metabolit hasadı için de uygundur. Bakteriler dinamik ortamlara tepki verdiğinden, örnekleme tarafından tetiklenen potansiyel fizyolojik değişiklikleri en aza indirmek için filtreleme ve yıkama adımlarının hızlıca gerçekleştirilmesi önemlidir. Değişiklikler, örnekleme sırasında frit ve PBS soğuk tutularak da en aza indirilebilir.

a-tandem-liquid-chromatographymass-spectrometry-based-approach-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Yakalama Bileşikler fotoğraf crosslinking ve saflaştırma takip fonksiyonel geri dönüşümlü küçük molekül-protein etkileşim proteom karmaşıklığını azaltmak için trifunctional küçük moleküllerdir. Burada Yakalama...

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

Kaynak: Samuels, D. J. ve diğerleri. Staphylococcus aureus'un metabolit analizi için Tandem Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Tabanlı Yaklaşım. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, S. aureus'tan hücre içi metabolitleri tanımlamak ve nicelendirmek için sıvı kromatografi-kütle spektrometrisinin kullanımını göstermektedir. Metabolit ekstraksiyonu, peptid normalizasyonu, sıvı kromatografi ve kütle spektrometrik analizinde yer alan adımları özetlemektedir.

S. aureus'tan Metabolitlerin Analizi İçin Sıvı Kromatografi–Kütle Spektrometrisi Temelli Yaklaşım

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Her yerde bulunan ikinci haberci c-di-GMP, birçok bakterinin büyümesini ve davranışını kontrol eder. Hemen hemen her bakteri türünde c-di-GMP bağlayıcı proteinleri biyokimyasal olarak tanımlamak ve karakterize etmek için yeni bir Yakalama Bileşik Kütle Spektrometresi tabanlı teknoloji geliştirdik.

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Saccharomyces cerevisiaemayasında suda çözünen metabolitlerin ana sınıflarının tanımlanması ve nicelliği için bir protokol sunuyoruz. Açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve hassastır. Suda çözünür metabolitlerin yapısal izomerlerinin ve stereoisomerik formlarının birbirinden ayrılmasına izin verir.

Sıvı KromatografiSi Kullanan Saccharomyces Cerevisiae'nin Nicel Metabolomikleri Tandem Kütle Spektrometresi ile Birleştiğinde

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Öğrenin, Staphylococcus aureus metabolitlerini tandem sıvı kromatografi-kütle spektrometresi ile nasıl analiz edeceğinizi. Bu yöntem, bakteri metabolizması ve patojenite ilişkisini incelemek için kullanılır.

metabolit analizi için bir Tandem Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi tabanlı yaklaşım

Daha fazla video keşfet