Name: 5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi In vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, 5-mC nokta-blot tekniğiyle kondrosit değişiminde DNA metilasyon seviyelerini nasıl nicelendirebilirsiniz. Bu yöntem, otojen kondrosit implantasyonu tedavilerinde fenotip değerlendirmesi için güvenilir ve hızlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma aşağıdaki hibeler tarafından desteklenmiştir: Çin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Guangdong Eyaleti, Çin Doğal Bilimler Vakfı (No. 2015A030313772); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı Finanse Projesi (No. 2013M530385); Çin&#39;in Guangdong Eyaletindeki Tıbbi Araştırma Kurumu (No. A2016314); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

Bu çalışma, Shenzhen İkinci Halklar Hastanesi İnsan Ahlakı Komitesi tarafından onaylandı. 1. İnsan Eklem Kıkırdak Doku Koleksiyonu ve Kondrosit Kültürü <ol><li> Malzemelerin hazırlanması <ol><li> Dulbecco&#39;nun% 10 sığır fetüsü serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiş modifiye kartal ortamı (DMEM) ortamı hazırlayın. 1 mg / mL kollajenaz II,% 0.25 tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve bir hücre süzgeci (40 μm naylon) hazırlayın. </li></ol></li><li> İnsan eklem kıkırdak doku koleksiyonu <ol><li> Eklem kıkırdağı travma sonrası donör hastaların diz eklemlerinden ayırın. Tüm katılımcılardan bilgilendirilmiş onam almak. </li><li> Kıkırdak, 1-2 mm 3 parçaya steril bir neşter kullanarak ve DMEM&#39;de 1 mg / mL kolajenaz II ile kıyılmış kıkırdaktan digest kondrositler 37 ° C&#39;de 12-16 saat boyunca kesilir. </li><li> Ortaya çıkan cel filtrelemeL süspansiyonu, bir hücre süzgeci (40 um) vasıtasıyla süspansiyon haline getirildi ve PBS ile iki kez yıkandı. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomis ile takviye edilmiş DMEM&#39;de bir hemositometre ve tohum yoğunluğunda 20,000-30,000 hücre / cm2 olan hücreleri sayın. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübatörde kültür </li></ol></li><li> Tek katmanlı kondrosit genişlemesi <ol><li> % 0,25 tripsin-EDTA kullanarak alt birleşik hücreleri hasat edin ve 6,600 hücre / cm2&#39;lik bir yoğunluğa getirin. Ortamı haftada iki kez değiştirin. </li><li> Tekli tabakalarda altı kanala kadar kondrosit kültür edin ve 1, 2, 3, 4 ve 5. pasajları değerlendirin. </li></ol></li></ol> 2. Genomik DNA (gDNA) Ekstraksiyonu <ol><li> Toplama hücreleri ve 10 milyon hücre başına 500 μL liziz tamponu (15 mM Tris pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0,% 0.5 SDS, 200 μg / mL RNaz A) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. Pipetleme ve hızlı inversiyon ile hücreleri tekrar süspanse edin ve daha sonra 37 ° C&#39;de 1 saat inkübe edin. </li><li> birDd proteinase K&#39;yi 160 ug / mL hücre lisat konsantrasyonunda kurutun ve karışım şiddetle tersine çevirin. 6 saat 55 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir hacim Tris pH 7.9 doymuş fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin. Vorteks veya numuneyi elle yaklaşık 20 s boyunca iyice çalkalayın. </li><li> Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüjleyin. Üst sulu fazı çıkarın ve katmanı yeni bir tüp haline getirin. </li><li> Fenolü çıkarmak için eşit hacimde kloroform ile özütleyin ve üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. </li><li> 0,1 numune hacmi 3 M sodyum asetat pH 8.0 ve 2 hacim% 100 etanol ilave ederek DNA&#39;yı çökeltin. </li><li> GDNA&#39;yı çöktürmek için tüpü gece boyunca -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Numuneyi pellet gDNA&#39;ya 16,000 xg&#39;de 10 dakika 4 ° C&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Numuneyi% 70 etanol ile üç kez yıkayın ve 13.000 x g&#39;de 4 ° C&#39;de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> Süpernatanı çıkarT dikkatle ve daha sonra havayla kurutun. DNA&#39;yı 10 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA içinde tekrar süspanse edin. </li></ol> 3. DNA Metilasyon Profillemesi <ol><li> Üreticinin protokolüne göre, toplam 500 ng genomik DNA kullanarak bisülfit dönüştürme reaksiyonunu gerçekleştirmek için bir DNA metilasyon kiti kullanın. 10 uL elüsyon tamponunda (50 ng / μL) elute edin. </li><li> Üreticinin protokolüne göre ticari bir kit kullanarak DNA metilasyon profillemesini gerçekleştirin. </li></ol> Dot Blot Analizi <ol><li> İzole edilen DNA&#39;yı (örnek başına 1 mg) 0.1 M NaOH içinde 95 ° C&#39;de 10 dakika boyunca denature edin. DNA&#39;yı buz üzerinde 1 M NH4OAc ile nötralize edin ve sonra iki kat seyreltin. N + membranda seri seyreltilmiş genomik DNA&#39;nın 2 μL&#39;sini spotlayın. </li><li> Memeyi 80 ° C&#39;de 30 dakika blot edin. </li><li> N + membranı TBS-T&#39;de% 5 BSA içinde 1 saat ıslatılarak spesifik olmayan antikor bağlanma yerlerini bloke edin. Reaksiyon olarak 10 cm&#39;lik bir Petri kabı kullanınOda sıcaklığında iyon odası. </li><li> TBST&#39;de beş dakika 5 kez yıkadıktan sonra membranı bir gece boyunca 4 ° C&#39;de TBS-T&#39;de bir fare anti-5-metilcytozin (5-mC) monoklonal antikor (1: 1000) ile inkübe edin. </li><li> Membranı TBS-T içinde üç kez beş kez yıkayın ve sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBS-T&#39;de ikincil bir antikor, HRP-konjuge koyun anti-fare immünoglobülin-G (IgG) (1: 5000) ile inkübe edin. </li><li> Membranı TBS-T içinde üç kez 5 dakika yıkayın. </li><li> Enzim substratını membrana ekleyin ve 5-10 dakika inkübe edin. Üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak ikincil antikor sinyalini görselleştirin. </li></ol>

<ol><li>Brittberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+deep+cartilage+defects+in+the+knee+with+autologous+chondrocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation.</a> N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).</li>
<li>Pareek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Outcomes+After+Autologous+Chondrocyte+Implantation%3A+A+Systematic+Review+at+Mean+Follow-Up+of+11.4+Years%5BTitle%5D)+AND+%22Cartilage%22%5BJournal%5D)">Long-Term Outcomes After Autologous Chondrocyte Implantation: A Systematic Review at Mean Follow-Up of 11.4 Years.</a> Cartilage. 7 (4), 298-308 (2016).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+networking+of+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro+and+its+implications+for+cell-based+cartilage+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Cytokine networking of chondrocyte dedifferentiation in vitro and its implications for cell-based cartilage therapy.</a> Am J Transl Res. 7 (2), 194-208 (2015).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+dedifferentiated+human+articular+chondrocytes+in+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (4), 599-603 (2013).</li>
<li>Duan, L., Liang, Y., Ma, B., Zhu, W., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+in+chondrocyte+phenotype+maintenance+for+cell-based+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation in chondrocyte phenotype maintenance for cell-based cartilage repair.</a> Am J Transl Res. 7 (11), 2127-2140 (2015).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling+in+chondrocyte+dedifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling in chondrocyte dedifferentiation in vitro.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print] (2016).</li>
<li>Bhat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+detection+at+single+base+resolution+using+targeted+next+generation+bisulfite+sequencing+and+cross+validation+using+capillary+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">DNA methylation detection at single base resolution using targeted next generation bisulfite sequencing and cross validation using capillary sequencing.</a> Gene. , (2016).</li>
<li>Shi, X. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+Genome-wide+DNA+Methylation+Profiles+Altered+in+Kashin-Beck+Disease+Using+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Environ+Sci%22%5BJournal%5D)">Exploring Genome-wide DNA Methylation Profiles Altered in Kashin-Beck Disease Using Infinium Human Methylation 450 Bead Chips.</a> Biomed Environ Sci. 29 (7), 539-543 (2016).</li>
<li>Li, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+HPLC+Method+for+Determining+the+Genomic+Methylation+Levels+of+Taxus+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimization of an HPLC Method for Determining the Genomic Methylation Levels of Taxus Cells.</a> J Chromatogr Sci. 54 (2), 200-205 (2016).</li>
<li>Maghbooli, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+as+a+possible+biomarker+fordiabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation as a possible biomarker fordiabetic retinopathy.</a> Diabetes Metab Res Rev. 31 (2), 183-189 (2015).</li>
<li>Barlic, A., Drobnic, M., Malicev, E., Kregar-Velikonja, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+gene+expression+in+human+articular+chondrocytes+assigned+for+autologous+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of gene expression in human articular chondrocytes assigned for autologous implantation.</a> J Orthop Res. 26 (6), 847-853 (2008).</li>
<li>Legendre, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+hyaline+cartilage+matrix+synthesis+in+collagen+sponge+scaffolds+by+using+siRNA+to+stabilizechondrocytes+phenotype+cultured+with+bone+morphogenetic+protein-2+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced hyaline cartilage matrix synthesis in collagen sponge scaffolds by using siRNA to stabilizechondrocytes phenotype cultured with bone morphogenetic protein-2 under hypoxia.</a> Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 550-567 (2013).</li>
<li>Niethammer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+autologous+chondrocyte+quality+of+matrix-based+autologous+chondrocyte+implantation+in+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">Analysis of the autologous chondrocyte quality of matrix-based autologous chondrocyte implantation in the knee joint.</a> Int Orthop. 40 (1), 205-212 (2016).</li>
<li>Hayatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bisulfite+genomic+sequencing+used+in+the+analysis+of+epigenetic+states%2C+a+technique+in+the+emerging+environmental+genotoxicology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The bisulfite genomic sequencing used in the analysis of epigenetic states, a technique in the emerging environmental genotoxicology research.</a> Mutat Res. 659 (1-2), 77-82 (2008).</li>
<li>Haque, N., Nishiguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+sequencing+for+cytosine-methylation+analysis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bisulfite sequencing for cytosine-methylation analysis in plants.</a> Methods Mol Biol. 744, 187-197 (2011).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

In vitro kondrosit farklılaşması, kıkırdak defekti onarımı tedavisinde ACI sonuçlarını ciddi şekilde tehlikeye atar 11,12. ACI sonuçlarını optimize etmek için ayrılmamış kondrositlerin kullanılmasını önlemek çok önemlidir 13 . Çalışmalar, genel DNA metilasyon seviyesinin kondrosit dediferansiyasyonunun derecesi ile ilişkili olduğunu ileri sürdü4,6. Bu nedenle, klinik uygulamasından önce kondrositlerin genel DNA metilasyon durumunu saptamak için güvenilir ve hızlı bir yöntem oluşturmak zo...

Otolog kondrosit implantasyonu (ACI), eklem kıkırdak defekti 1 , 2&#39;yi tedavi etmek için nispeten yeni ve en gelişmiş yöntemdir. ACI&#39;da önemli adımlardan biri , in vitro tek katlı kültür yoluyla kondrositlerin çoğaltılmasıdır. Yükseltme sırasında, hiyalin kondrositler fenotiplerini kolayca kaybederler ve difuzensiz hale gelirler; bu ACI tedavisi için istenmeyen 3 , 4&#39;tür . ACI tedavisinin sonucunu optimize etmek için replantasyondan önce kondrosit farklılaşmasının derecesi belirlenmelidir. Kondrositlerin durumunu belirlemek için ekonomik ve hızlı bir yol oluşturmak zorunludur. Son zamanlarda, DNA metilasyonu ve kondrosit ayrımı ayırma arasındaki ilişki çok dikkat çekti 4 , 5 , 6 . DNA metilasyonu,Ich metil grupları DNA&#39;ya ilave edilir ve sonuçta sitozin kalıntılarının 5-metilcytosine (5-mC) dönüştürülmesi sağlanır. Kondrosit ayrımcılığında DNA metilasyon biyolojisini aydınlatmak için ilk adım şimdiye kadar zorlu olduğu kondrositlerin DNA metilasyon seviyesini değerlendirmektir. Bisülfit genomik sekanslama, DNA metilasyonunu analiz etmek için en yaygın kullanılan tekniktir 7 , 8 . Bu deneyde, bisülfit dönüşümü DNA bozunumuna neden olur ve bu nedenle tahlil için önemli miktarda numune sağlanmalıdır. Ayrıca, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) küresel DNA metilasyon seviyelerini 9 , 10&#39;u ölçmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, HPLC analizi genomik DNA sindirimini gerektirir. Ayrıca ileri ve pahalı deneysel araçlar gereklidir. Bu nedenle, yüksek maliyetin yanı sıra, bu deneysel prosedürler zaman kazandırıcı niteliktedirharcanmasına neden olur. Anti-5-mC antikorlar, şimdi karmaşık genomlardan 5-mC içeren genomik DNA&#39;nın bağışıklık lekelenmesi imkânı yaratan ticari olarak piyasaya sürülmüştür. Bu raporda, bir dizi tek katmanlı kültür içinde yetiştirilen kondrositlerden genomik DNA çıkardık. İnsanlardaki kondrositlerdeki 5-mC içeriğini farklı sayıda pasajla değerlendirmek için bir nokta blot testi kullandık. Düşük ayrıştırılmış kondrositlerde, düşük dereceli ayrımcılığa sahip kondrositlere kıyasla 5-mC içeriğinin arttığını tespit ettik. Ayrıca, ayrımlaşma durumu ile 5-mC düzeyleri arasında bir ilişki olduğunu tespit ettik. Son olarak, 5-mC içeriğindeki değişikliklerin kondrosit fenotipi ile ilişkili olduğunu bildirdik. Bu nedenle, 5-mC nokta leke testi, kondrositlerdeki DNA metilasyon seviyesini tespit etmek için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdir.

<table><tbody><tr><td><güçlü >Reaktifler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>37 °C'de sıcak; Kullanmadan önce C su banyosu</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>HyClone, Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>D-PBS, 2+/Mg2+</td></tr><tr><td>FBS</td><td>içermez, Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>% 1 Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Mallinckrodt</td><td>4440</td><td></td></tr><tr><td>İzoamil Alkol</td><td>Sigma</td><td>I-3643</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Gibco BRL</td><td>15513-039</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Gibco BRL</td><td>24568-2</td><td></td></tr><tr><td>TAE tamponu ve nbsp;</td><td>Bio Whittaker</td><td>16-011V</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış Su</td><td>Gibco BRL</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Biosharp Inc.</td><td>BL514A</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Biyotepeli Inc.</td><td></td><td></td>C58H114O26</tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant Inc.</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz, Tip II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[başlık]</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm çanak</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>Gama ile sterilize edilmiş</td></tr><tr><td>Yüksek hızlı santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>MIULAB</td><td>MTH-100</td><td></td></tr><tr><td>Karbondioksit hücre inkübatörü</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>Kimyasal Görüntüleme Analiz Sistemi</td><td>UVITEC Cambridge</td><td>ALLIANCE</td><td></td></tr></tbody></table>

5-mc nokta-blot testi kondrosit farklılaşmasımın dna metilasyon seviyesinin nicelendirilmesi<em&gt; in vitro</em

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

Hiyalin kondrositlerin fibroblastik kondrositlere ayrılması, genellikle in vitro olarak tek katlı kondrosit genişlemesine eşlik eder. Kondrositlerin küresel DNA metilasyon seviyesi, kondrosit fenotipinin kaybedilmesi için uygun bir biyolojik belirteç olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, farklı deneysel yöntemlere dayanan sonuçlar tutarsız olabilir. Bu nedenle, kondrosit farklılaşması sırasında küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kesin, basit ve hızlı bir yöntem oluşturmak önemlidir. Mevcut genom geniş metillendirme analiz teknikleri büyük oranda bisülfit genomik dizilemesine dayanmaktadır. Bisülfit dönüşümü sırasında DNA bozunumundan ötürü, bu yöntemler tipik olarak büyük bir numune hacmi gerektirir. Küresel DNA metilasyon seviyelerini ölçmek için kullanılan diğer yöntemler arasında, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) bulunur. Bununla birlikte, HPLC, genomik DNA&#39;nın tam sindirimini gerektirir. Ek olarak, HPLC&#39;nin yasakça yüksek maliyetiStrength, HPLC&#39;nin daha geniş bir uygulama alanını sınırlar. Bu çalışmada, genetik DNA (gDNA) çeşitli geçiş sayılarıyla kültürlenen insan kondrositlerinden ekstrakte edilmiştir. GDNA metilasyon seviyesi bir metilasyona özel dot blot testi kullanılarak tespit edildi. Bu dot blot yaklaşımında, tespit edilecek metile DNA&#39;yı içeren bir gDNA karışımı, daha önce çizilmiş bir dairesel kalıp şablonunun içindeki bir nokta olarak bir N + membranına doğrudan lekelenmiştir. Diğer jel elektroforez esaslı lekelendirme yaklaşımları ve diğer kompleks lekelenme prosedürleri ile karşılaştırıldığında, nokta leke yöntemi önemli zaman kazandırır. Ayrıca, nokta lekeleri, piyasada bulunan bir 5-mC antikor kullanılarak genel DNA metilasyon seviyesini algılayabilir. DNA metilasyon seviyesinin tek katmanlı alt-kültürler arasında farklılaştığını ve bu nedenle kondrosit ayrımlaştıncılığında önemli bir rol oynayabileceğini bulduk. 5-mC nokta leke, genel DNA metilasyon seviyesinin değerlendirilmesi için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntemdirKondrosit fenotipi.

Kondrositler, pasaj 6&#39;ya kadar tek tabaka halinde kültürlendi (P6). Kondrositler tek katmanlı kültürün ardışık geçişlerinde ilerleyici fenotipik değişiklikler gösterdi. P0 kondrosit morfolojisi yuvarlak iken, hücreler P6&#39;ya kadar ardışık pasajlarla son derece sıkıştı ve düzleşti ( Şekil 1 ). Bu morfolojik değişiklik, kondrosit ayrım ayırma işleminin tipik bir örneğidir. Bu arada ısı haritasının sonuçları CpG sitelerinin genel metilasyon seviyesinin uzun süreli al...

DNA metilasyonunu 5-metilsitozin (5-mC) nokta leke bazında ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kondrosit farklılaşması sırasında 5-mC düzeylerini saptadık. Bu basit teknik ACI tedavisinde kondrosit fenotipini hızlı bir şekilde belirlemek için kullanılabilir.

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi<em&gt; In vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bu deneyin genel amacı, kondrosit dediferansiyasyonu sırasındaki 5-Metilsitozin seviyelerini belirlemektir. Bu yöntem, otolog kondrosit implantasyonu gibi hücre tabanlı kıkırdak defekti tedavilerindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, kondrosit fenotipini değerlendirmek için genel DNA metilasyon seviyesini tespit eden güvenilir, basit ve hızlı bir yöntem olmasıdır.Bu teknolojinin önemi, otolog kondrosit implantasyonu çalışmalarımız için standarttır; çünkü kondrosit dediferansiyasyonu sırasındaki DNA metilasyonu, kıkırdak defektleri için uygulanan otolog kondrosit implantasyonu tedavisinde önemli bir engel teşkil eder. Bu yöntem, kondrosit dediferansiyasyonundaki DNA metilasyon seviyeleri hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, osteoartrit gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bir dot blot yönteminin referanslarındaki protokolleri okuduğumuzda edindik.Dot blot durumlarını tanımlamak zor olduğundan, bu yöntemin gösterimi kritik öneme sahiptir. Genomik DNA denatüre edilmeli ve ardından seri olarak dilüe edilmelidir. Daha sonra pozitif yüklü bir naylon membrana aktarılmalıdır.Prosedürler, laboratuvarımızdan lisansüstü öğrencisi Zhaofeng Jia tarafından gösterilecektir. Bu çalışmada kullanılan eklem kıkırdağı dokuları, travma sonrası donör hastaların diz eklemlerinden izole edilmiştir. Steril bir bistüri kullanarak kıkırdağı bir ila iki kübik milimetrelik parçalar halinde doğrayın.Ardından, kıyılmış kıkırdağa mililitre başına bir miligram kollagenaz II ve DMEM ekleyin. Kondrositleri sindirmek için 37 °C'de 12 ila 16 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, elde edilen hücre süspansiyonunu 40 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.Hücreleri santrifüjle çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın, PBS ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.Ardından, santimetrekareye 20.000 ile 30.000 hücre yoğunluğunda, %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş DMEM içerisine ekim yapın. 37 °C sıcaklıktaki bir inkübatörde 48 saat boyunca kültüre edin. Subkonfluent hücreleri %0,25 tripsin EDTA kullanarak hasat edin.Ardından santimetrekare başına 6.600 hücre yoğunluğunda yeniden ekleyin. Kondrositleri altı pasaja kadar tek tabaka halinde kültüre edin ve birinci, ikinci, üçüncü, dördüncü ve beşinci pasajlarda değerlendirin. Bu prosedüre başlamak için hücreleri tripsinizasyon ve santrifüjleme yoluyla toplayın.Ardından, hücreleri her 10 milyon hücre için 500 µL lizis tamponunda pipetleme ve hızlı ters çevirme yoluyla yeniden süspande edin. 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Hücre lizatı başına 160 µg/mL konsantrasyonda proteinaz K ekleyin ve karışımı kuvvetlice ters çevirin.55 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Her örneğe, örnek hacmiyle eşit miktarda Tris pH 7.9 doygun fenol-kloroform-izoamil alkol karışımı ekleyin. Örneği yaklaşık 20 saniye boyunca elinizle iyice çalkalayın.Örnekleri oda sıcaklığında, 13,000 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üstteki sulu fazı uzaklaştırın ve yeni bir tüpe aktarın. Fenolü uzaklaştırmak için her tüpe eşit hacimde kloroform ekleyin.Elle çalkalayın ve santrifüjle çöktürün. Üstteki sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. 0.1 örnek hacminde üç molar pH sekiz sodyum asetat ve iki hacim %100 ethanol ekleyin.Genomik DNA'yı çöktürmek için tüpleri gece boyunca -20 °C'de saklayın. Ertesi gün, genomik DNA'yı pelletlemek için örnekleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 16.000 ×g hızında santrifüj edin. Örnekleri %70 etanol ile yıkayın.Ardından 4 °C'de, 13.000 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve DNA peletini havada kurutun. DNA'yı 10 mM tris pH 8, 0,1 mM EDTA içerisinde yeniden süspanse edin. Bu prosedüre, izole edilen DNA'yı 0,1 M sodyum hidroksitte, 95 °C'de 10 dakika boyunca denatüre ederek başlayın.DNA'yı buz üzerinde bir molar amonyum asetat ile nötralize edin. Ardından çift distile su ile iki kat seyreltin. Dot blot analizlerindeki en kritik adım örneklerin damlatılmasıdır; bu işlemi yavaş ve dikkatli yapmayı unutmayın.Her bir damlatılmış diziyi üç ila dört milimetre çapında tutmaya çalışın. Dar ağızlı bir pipet ucu kullanarak, seri dilüe edilmiş genomik DNA'dan iki mikrolitre miktarını, ızgaranın merkezindeki pozitif yüklü naylon membrana dikkatlice damlatın. Membranı 80 °C'de 30 dakika boyunca blotlayın.Ardından, membranı 10 santimetrelik bir petri kabında, oda sıcaklığında, hafif sallama eşliğinde bir saat boyunca TBST içindeki %5 BSA ile ıslatarak spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke edin. Bir saat sonra, membranı her seferinde beş dakika olacak şekilde üç kez TBST ile yıkayın. Membranı, TBST içindeki fare anti-5-metilsitozin monoklonal antikoru ile dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, membranı TBST ile üç kez, her seferinde beş dakika boyunca yıkayın. Ardından, oda sıcaklığında bir saat boyunca TBST içindeki sekonder antikor, horseradish peroxidase konjuge koyun anti-fare immünoglobulin G ile inkübe edin. Membranı daha önce olduğu gibi TBST ile yıkadıktan sonra, membrana enzim substratını ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin.Son olarak, üretici talimatlarına uygun olarak bir kemilüminesans kiti kullanarak sekonder antikor sinyalini görselleştirin. Altıncı pasaja kadar tek tabaka halinde kültüre edilen kondrositler, ardışık pasajlarla birlikte oldukça sıkışmış ve düzleşmiş hale gelerek ilerleyici fenotipik değişiklikler göstermiştir. Bu morfolojik değişim, kondrosit dediferansiyasyon sürecinin tipik bir özelliğidir.Genomik DNA, farklı pasaj sayıları sonrasındaki kondrositlerden izole edilmiş ve DNA metilasyon seviyeleri 5-Metilsitozin spesifik dot blot analizi ile değerlendirilmiştir. Noktaların yoğunlukları daha sonra Image J ile analiz edilmiştir. Uzayan alt kültür süresiyle birlikte kademeli olarak artan beş metilsitozin seviyeleri gözlemlenmiş; bu durum, genel olarak artan metilasyon seviyeleri ile kondrosit dediferansiyasyonu arasında bir ilişki olduğunu göstermiştir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde yürütüldüğü takdirde 24 saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürü uygularken, genomik DNA konsantrasyonunu ve saflığını maksimize etmeyi hatırlamak önemlidir. Bu prosedürün ardından, monokültürdeki kondrositlerin dediferansiyasyonu gibi ek soruları yanıtlamak için genomik DNA metilasyon profilleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, otolog kondrosit implantasyonu alanındaki araştırmacıların, kondrositlerin DNA metilasyonunu değerlendirmelerine ve kıkırdak defekti tedavisinde kondrosit fenotipini belirlemelerine olanak sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, kondrosit fenotipini değerlendirmek için dejeneratif makine seviyesini tespit etmek amacıyla 5-Metilsitozin dot blot yönteminin nasıl kullanılacağına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Fenol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman eldiven takılması gerektiğini unutmayın.

a-5-mc-dot-blot-assay-quantifying-dna-methylation-level-chondrocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Bu videoda, DNA örneklerinin bir naylon zar üzerinde lekelenmesi ve ardından monoklonal antikorlar kullanılarak görselleştirme yoluyla insan kondrositlerindeki DNA metilasyon seviyesini in vitro olarak belirlemek için nokta lekeleme tekniği açıklanmaktadır. Bu, kültürün çeşitli aşamalarında kondrositlerin fenotipini belirlemeye yardımcı olur.

DNA metilasyonunun derecesini belirlemek için 5-metilsitozin nokta lekesi

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

Bu çalışma, kronik lenfositik lösemi (KL) hastalarında farklı şekilde metilasyona uğramış CpG bakımından zengin bölgelerin tanımlanması için optimize edilmiş bir metil-CpG-bağlanma alanı (MBD) sıralama protokolünü ve bir hesaplama hattını açıklamaktadır.

Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

Yeni 5-metilsitozin (oksi-mCs), 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) oksitlenmiş formları bulunan ve 5-carboxylcytosine (5caC) farklı DNA değişiklikleri benzersiz işlevsel roller ile temsil edebilir. Yarı nicel bir iş akışı görselleştirme oksi-mCs kayma dağıtım, sinyal şiddeti profil oluşturma ve colocalization için burada kullanılmıştır.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

Bu rapor amacı sağlam immunohistokimyasal algılama epigenetik işaretleri için iletişim kuralı tanımlamak için fare retina 5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) gelişmekte olan ve postmitotic.

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Bu protokol, insan eklem kıkırdağından kondrositlerin, Fibronektin Adezyon Testinden türetilmiş Kondroprojenitörlerin (FAA-CP'ler) ve Göçmen Kondroprojenitörlerin (MCP'ler) izolasyonunu detaylandırır. Bu hücreleri izole etmek ve karakterize etmek için enzimatik sindirim, fibronektin yapışması ve migrasyon bazlı testleri kapsar.

Fibronektin Adezyonu ve Migrasyon Testi Kullanılarak Kondrosit ve Kondroprojenitörlerin İzolasyonu

Olgun adipositler, homojen bir fibroblast benzeri hücre popülasyonuna yol açan farklılaşma yoluyla bol miktarda kök hücre kaynağını temsil edebilir. Kollajenaz sindirimi, olgun adipositleri insan yağından izole etmek için kullanılır. Protokolümüzün amacı, insan olgun adipositlerinden multipotent, farklılaşmış yağ hücreleri elde etmektir.

Tavan Kültürlerde Olgun adipositlerinde ve dediferansiyonunu ile İnsan adipoz Kök Hücre Üretimi

Spesifik DNA etiketi metil yeşili olan sabit biyolojik materyalin floresan boyanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Metil yeşili, seyreltilmiş sulu bir çözeltide kullanılır ve foto ağartmaya karşı çok dirençlidir. Uzak kırmızı emisyonu, derin örnek görüntülemeye izin verir ve bu da onu tüm embriyolar için özellikle yeterli hale getirir.

Embriyolar Floresan Etiketleme DNA Özgü Leke Metil Green Uygulaması

Öğrenin, 5-mC nokta-blot tekniğiyle kondrosit değişiminde DNA metilasyon seviyelerini nasıl nicelendirebilirsiniz. Bu yöntem, otojen kondrosit implantasyonu tedavilerinde fenotip değerlendirmesi için güvenilir ve hızlı bir yaklaşım sunar.

5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi

Daha fazla video keşfet