5-mC Nokta-Blot Testi Kondrosit Farklılaşmasımın DNA Metilasyon Seviyesinin Nicelendirilmesi In vitro

Bu deneyin genel amacı, kondrosit farklılaşması sırasında 5-Metilsitozin seviyelerini belirlemektir. Bu yöntem, otolog kondrosit implantasyonu gibi hücre bazlı kıkırdak defekti tedavisinde önemli soruların yanıtlanmasına yardımcı olabileceğini göstermektedir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kondrosit fenotipini değerlendirmek için genel DNA metilasyon seviyesini tespit etmek için güvenilir, basit ve hızlı bir yöntem olmasıdır.

Bu teknolojinin anlamı, otolog kondrosit implantasyonu payımız için standarttır, çünkü kondrosit farklılaşması sırasında DNA metilasyonu, kıkırdak defektleri için otolog kondrosit implantasyonu tedavisi için önemli bir engeldir. Bu yöntem, kondrosit farklılaşmasında DNA metilasyon seviyeleri hakkında bilgi sağlayabilse de, osteoartrit gibi diğer hastalık çalışmalarına da uygulanabilir. Bu yöntem için fikir ilk olarak bir nokta lekesi yönteminin referanslarındaki protokolleri okuduğumuzda aklımıza geldi.

Lütfen bu yöntemin gösterilmesinin kritik olduğunu gösterin, çünkü nokta leke durumlarının adlandırılması zordur. Genomik DNA denatüre edilmeli ve daha sonra seri olarak seyreltilmelidir. Daha sonra pozitif yüklü bir naylon membran üzerinde desteklenmelidir.

Prosedürleri göstermek, laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Zhaofeng Jia olacak. Bu çalışmada kullanılan eklem kıkırdak dokuları travma sonrası donör hastaların diz eklemlerinden izole edildi. Steril bir neşter kullanarak, kıkırdağı bir ila iki milimetre küp parçaya bölün.

Daha sonra kıyılmış kıkırdağa mililitre kollajenaz II ve DMEM başına bir miligram ekleyin. Ve kondrositleri sindirmek için 37 santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, elde edilen hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün

Hücreleri aşağı doğru döndürün. Süpernatanı atın, PBS ekleyin ve tekrar döndürün. Hücreleri bir hemositometre ile sayın.

Ve santimetre kare başına 20.000 ila 30.000 hücre yoğunluğunda tohum ve% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş DMEM. 48 saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatörde kültür. % 0.25 tripsin EDTA kullanarak alt birleşen hücreleri hasat edin.

Ve santimetre kare başına 6.600 hücre yoğunluğunda yeniden plakalayın. Kondrositleri altı pasaja kadar tek katmanlar halinde kültürleyin ve bir, iki, üç, dört ve beşinci pasajlarda değerlendirin. Bu işleme başlamak için, hücreleri tripsinizasyon ve santrifüjleme ile toplayın.

Daha sonra, pipetleme ve hızlı ters çevirme ile 10 milyon hücre başına 500 mikrolitre lizis tamponunda hücreleri yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Mililitre hücre lizatı başına 160 mikrogram konsantrasyonda proteinaz K ekleyin ve karışımı kuvvetlice ters çevirin.

55 santigrat derecede altı saat inkübe edin. Her numuneye bir hacim Tris pH 7.9 doymuş fenolden kloroforma izoamil alkole ekleyin. Numuneyi yaklaşık 20 saniye boyunca elinizle iyice çalkalayın.

Numuneleri oda sıcaklığında 13.000 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Fenolü çıkarmak için, her tüpe eşit miktarda kloroform ekleyin.

Elle sallayın ve aşağı doğru döndürün. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. 0.1 numune hacminde üç molar sodyum asetat pH sekiz ve iki hacim %100 etanol ekleyin.

Genomik DNA'yı çökeltmek için tüpleri gece boyunca eksi 20 santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, genomik DNA'yı peletlemek için numuneleri 16.000 kez G'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Numuneleri %70 etanol ile yıkayın.

Ve dört santigrat derecede 13.000 kez G'de iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve DNA peletini havayla kurutun. DNA'yı 10 milimolar tris pH sekiz 0.1 milimolar EDTA'da yeniden süspanse edin. İzole edilen DNA'yı 0.1 molar sodyum hidroksit içinde 95 santigrat derecede 10 dakika boyunca denatüre ederek bu işleme başlayın.

DNA'yı buz üzerinde bir molar amonyum asetat ile nötralize edin. Ve sonra iki kat çift damıtılmış su ile seyreltin. Nokta lekesi tahlillerindeki en kritik adım, numunelerin lekelenmesidir ve unutmayın, bunu yavaş ve dikkatli bir şekilde yapın.

Her benekli diziyi üç ila dört milimetre çapında küçültmeye çalışın. Dar ağızlı bir pipet ucu kullanarak, seri seyreltilmiş genomik DNA'nın iki mikrolitresini, ızgaranın ortasındaki pozitif yüklü bir naylon zar üzerine dikkatlice yerleştirin. Membranı 80 santigrat derecede 30 dakika

Daha sonra, zarı TBST'de% 5 BSA'ya batırarak spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini 10 santimetrelik bir petri kabında oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak bloke edin. Bir saat sonra, membranı her seferinde beş dakika boyunca TBST'de üç kez yıkayın. Membranı, gece boyunca dört santigrat derecede TBST'de bir fare anti-5-metilsitozin monoklonal antikoru ile inkübe edin.

Ertesi gün, membranı her seferinde beş dakika boyunca TBST'de üç kez yıkayın. Daha sonra ikincil bir antikor, yaban turpu peroksidaz konjuge koyun anti-fare immünoglobulin G ile TBST'de oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Membranı daha önce olduğu gibi TBST'de yıkadıktan sonra, enzim substratını membrana ekleyin ve beş ila 10 dakika inkübe edin.

Son olarak, üreticinin talimatlarına göre bir kemilüminesans kiti kullanarak ikincil antikor sinyalini görselleştirin. Altıncı pasaja kadar tek tabakalı bir tabakada kültürlenen kondrositler, art arda pasajlarla yüksek oranda sıkışan ve düzleşen ilerleyici fenotipik değişiklikler gösterdi. Bu morfoloji değişikliği, kondrosit farklılaşma sürecinin tipik bir örneğidir.

Genomik DNA, değişen sayıda pasajdan sonra kondrositlerden izole edildi ve DNA metilasyon seviyeleri 5-Metilsitozin spesifik nokta blot testi ile değerlendirildi. Noktaların yoğunlukları daha sonra görüntü J ile analiz edildi. Uzun süreli alt kültürle aşamalı olarak yüksek beş metilsitozin seviyesi gözlendi, bu da genel olarak artan metilasyon seviyeleri ile kondrosit farklılaşması arasında bir ilişki olduğunu düşündürdü. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 24 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, genomik DNA konsantrasyonunu ve saflığını en üst düzeye çıkarmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, monokültürde farklılaşma kondrositleri gibi ek soruları yanıtlamak için genomik DNA işleme profillemesi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, geliştirildikten sonra otolog kondrosit implantasyonu alanındaki araştırmacıların kondrositlerin DNA işlenmesini değerlendirmelerinin ve kıkırdak defekti tedavisinde kondrosit fenotipini belirlemelerinin önünü açmıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, kondrosit fenotipini değerlendirmek için dejenere işleme kolunu tespit etmek için 5-Metilsitozin nokta lekesinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Fenol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven giyilmesi gerektiğini unutmayın.