Çok Katlı Kortikal Ca ²⁺ Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca ²⁺ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Bu prosedürün genel amacı, serbestçe hareket eden bir farede kalsiyum göstergeleri kullanılarak birden fazla kortikal nöron katmanında nöronal aktivitenin aynı anda görselleştirilmesine izin vermek ve minyatür bir başa takılan floresan mikroskobu kullanarak nöral devrenin işleyişini anlamaktır. Bu yöntem, sistem sinirbilimi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir, örneğin, korteksin birden çok katmanında bilgi yayıcısı nasıldır? Bu tekniğin ana avantajı, genetik olarak kodlanmış nöronların büyük popülasyonlarını, zaman içinde güvenilir bir şekilde, serbestçe davranan hayvanlarda birden fazla kortikal katman boyunca görselleştirmeye izin vermesidir.

Serbestçe davranan bir hayvanda birden fazla kortikal katmandan genetik olarak kodlanmış nöronları görselleştirmek için aşağıdaki prosedürlerin gerçekleştirilmesi gerekir ve bu protokol, serbestçe davranan bir farede prizma probu implantasyonunu, taban plakası kurulumunu ve in vivo görüntülemeyi vurgular. Bu işleme başlamak için, virüs enjeksiyonundan bir ila iki hafta sonra, hayvanı stereotaksik aparata yerleştirin ve% 70 etanol içinde dezenfekte ederek ve lens kağıdı ile temizleyerek prizma probu implant ameliyatına hazırlanın. Ardından, 0,5 milimetre çapaklı bir mikro matkap kullanarak yuvarlak bir kraniyotomi açın.

Kraniotomi çapının prizma çapından biraz daha büyük olduğundan emin olun. Ardından, kraniotomiyi, prizma kortekse yerleştirildiğinde, düz kenarı virüs enjeksiyon bölgesine bakacak ve 150 ila 200 mikronluk bir yarıçap içinde olacak şekilde konumlandırın. Bundan sonra, dura'yı ince forseps ile çıkarın.

Beyin dokusu açığa çıktığında dokuyu daima steril tuzlu su ile nemli tutun. Bu aynı zamanda doku üzerindeki baskıyı da koruyacaktır. Prizma probu yerleştirilmesi sırasında beyin dokusundaki basıncı hafifletmek için, stereotaksik aparatın elektrot tutucu koluna düz kenarlı bir diseksiyon bıçağı takarak bir yerleştirme yolu oluşturun.

Bıçak plakası kafatasının eğriliğine dik olacak şekilde ve virüs enjeksiyon kolonuna paralel bir düzlemde bir açıyla monte edin. Bıçağı kraniyotominin üzerine, iç ortam kenarı boyunca ve virüs enjeksiyon bölgesinin yaklaşık 200 mikron lateraline, kesici kenarı arkaya bakacak şekilde dikkatlice yerleştirin. Bıçak ucu piaya değdiğinde Z eksenini sıfırlayın.

Ardından, kademeli olarak prizma probunun yerleştirileceği derinliğe indirin. Ardından, prizmanın ön kenarı için bir yol oluşturmak için bıçağı bir milimetre arkaya doğru hareket ettirin. Stereotaksik kol mikromanipülatörünü kullanarak bıçağı saniyede 10 mikronluk artışlarla yavaşça geri çekin ve insizyonun üzerine steril tuzlu su ile ıslatılmış bir parça jel köpük sünger yerleştirin.

Bunu takiben, lens tutucuyu stereotaksik manipülatör koluna önceki adımdaki bıçakla aynı açıyla takın. Prizmayı, prizmanın düz tarafı insizyonun üzerinde ve virüs enjeksiyon kolonuna paralel olacak şekilde hizalayın. Prizma doğru açıya geldiğinde, bu prob için beyin yüzeyinden 1.1 milimetrelik son Z seviyesine kadar 10 mikronluk artışlarla kademeli olarak beyne indirin.

Kraniyotomideki prizmanın etrafındaki açıkta kalan dokuları 25 gauge bir iğne kullanarak çok ince bir koruyucu elastomer yapıştırıcı ile örtün. Lensin kraniyotomi içinde hareket etmesini önlemek için, elastomer yapıştırıcı sertleştikten sonra, prizma merceğinin camını elastomer yapıştırıcı tabakası üzerindeki bitişik kafatasına yapıştırmak için bir miktar siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak için 25 gauge bir iğne kullanın. Siyanoakrilat yapıştırıcı sertleştikten sonra, lens tutucuyu sökün ve mikroskobu dikkatlice çıkarın.

Ardından, prizma probunu güvenli bir şekilde implante etmek için stereotaksik manipülatör kolunu yavaşça geri çekin. Çevredeki geri çekilmiş kas dokusuna dokunmadan açıkta kalan kafatası yüzeyini kaplamak için implantın etrafına bir diş akrilik veya siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası uygulayın. Bu kafatası kapağı ile kafatasının geniş bir alanını kaplamak, daha sonra taban plakasının takılmasına yardımcı olacaktır.

Daha sonra, katalizör uç tabanını silikon yapışkan bir şırıngadan karıştırın ve herhangi bir hasar ve tozun çökmesini önlemek için prob merceğinin üstünü kaplamak için prizma probu manşetinin içine bir damla elastomer koyun. Prizma probunu implante ettikten bir hafta ila 10 gün sonra, implante edilmiş prizma probu aracılığıyla dokuda virüs ekspresyonunu kontrol edin. Bunun için, implante edilmiş prizma prob merceğinin yüzeyindeki silikon yapışkan kapağı çıkarın.

Prob lens yüzeyini inceleyin ve görüntüleme yüzeyinin temiz olduğundan emin olmak için lens kağıdı ve %70 etanol ile kalıntıları nazikçe temizleyin. Ardından, mikroskoba bir taban plakası takın ve yerinde tutmak için taban plakası ayar vidasını sıkın. Ardından, mikroskobu stereotaksik mikromanipülatör kolundaki mikroskop tutucusuna sabitleyin.

Tutucuyu stereotaksik mikromanipülatör koluna monte edilebilen bir çubuğa takın. Daha sonra, stereotaksik mikromanipülatör kolunu kullanarak mikroskobu prizma prob merceğinin üzerine yerleştirin. Prizma merceğini hayvan sahnesinin yanından ve arkasından görüntüleyerek yönlendirmeyi görsel olarak inceleyin.

Hem mikroskop objektifinin hem de prizma probunun optik ekseni hizalanmalıdır. Bunu takiben, edinme yazılımını başlatın, projeyi seçin ve yazılım aracılığıyla mikroskop LED'ini açın. Stereotax'ın manipülatör kolunu hareket ettirerek, edinim yazılımında implante edilmiş prizma prob merceğinin üst fazına odaklanarak mikroskop hizalamasının kalitesini değerlendirin.

Düzgün bir şekilde hizalandığında, prizma probu merceğinin kenarları keskin görünmelidir. Doku içinde istenen odak düzlemini elde etmek için stereotaksik manipülatör kolunu kullanarak mikroskobun implante edilmiş prizma probu üzerindeki fiziksel mesafesini ayarlayın. Ardından, boşluğu kapatmak için taban plakasını akrilik kapağa kalıcı olarak takmak için diş akrilik veya siyanoakrilik kullanın.

Taban plakasını hayvanın kafasına yapıştırırken mikroskop gövdesinin herhangi bir yerine veya ayar vidasına yapıştırıcı uygulanmaması çok önemlidir. Şimdi, mikroskobu tutucudan serbest bırakın ve tutucuyu mikroskoptan geri çekin. Siyanoakrilik veya başka bir şeffaf yapıştırıcı kullanılmışsa, kafa kapağına ortam ışığı sızmasını önlemek için siyah oje veya siyah diş çimentosu tabakası ile kaplayın, bu da deneyler sırasında elde edilen gelecekteki görüntüleri kirletebilir.

Ardından, implante edilmiş prizma probunu taban plakası kapağı ile koruyun. Bu prosedürde, mikroskobu bilgisayara bağlı veri toplama kutusuna takın ve toplama yazılımını başlatın. Ardından, taban plakası ayar vidasını saat yönünün tersine çevirerek ve taban plakası kapağını kaldırarak taban plakası kapağını çıkarın.

Mikroskobu hayvanın üzerindeki taban plakasına yerleştirin. Mikroskop, taban plakasındaki mıknatısların yardımıyla yerine oturmalıdır. Ardından, taban plakası ayar vidasını hafif bir direnç hissedilene kadar ilerletin.

Bundan sonra, verileri yakalamak için kare hızını içeren verileri toplamak için kullanılacak alma ayarlarını seçin. Sinyal-gürültü oranının iyi olduğundan emin olmak için ayarları seçerken görüntü histogramını kontrol edin. Ardından, verileri almaya başlayın.

Kayıt tamamlandığında, taban plakası ayar vidasını gevşetin ve mikroskobu yavaşça yukarı çekerek mikroskobu taban plakasından ayırın. Ardından, taban plakası kapağını yerine takın ve taban plakası ayar vidasını yavaşça sıkın. İşte mikroskopla monte edilmiş, davranış alanındaki nesnelerle serbestçe etkileşime giren bir hayvanın bir gösterimi.

Sistemle uyanık davranış görüntüleme sırasında, fare üç farklı ortama maruz kaldığında somatosensoriyel kortikal nöronların aktivitesi kaydedildi. Birinci gün açık alan, iki ila dördüncü günlerde nesne tanıma ve beşinci gün yeni nesne. Kalsiyum görüntü veri analiz yazılımı kullanılarak hücre ekstraksiyonunu takiben, hücre konumlarına karşılık gelen uzamsal filtreler, mikroskop kayıt verilerinin ortalama floresan yoğunluğu projeksiyonu üzerine yerleştirildi.

Beyaz kesikli bir çizgi iki, üç ve beşinci katmanları ayırır. Katmanların her birinden beş hücreden karşılık gelen kalsiyum izleri, hücrelerin çiftçilik modelini iki farklı davranışsal bağlamda gösterir: Nesne tanıma ve yeni nesne maruziyeti. İkinci katman, üç hücreler, farenin yeni bir nesneye maruz kaldığı gün beşinci katman hücrelerine kıyasla daha aktifti.

İşte yüzeysel varlık oyuncularından, hayvanın açık alanda, nesne tanıma ve yeni nesne keşfi sırasındaki hücre aktivitelerinin geri kalanı. Bir kez ustalaştıktan sonra, uygun şekilde uygulanırsa her teknik bir saat içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sistem sinirbilimi araştırmacılarının, farklı beyin bölgelerindeki belirli hücre tiplerini keşfetmelerinin yolunu açarken, hastalıkta droning ve diğer nörofizyoloji modellerinde farklı davranış paradigmalarından yararlanır.

Bu protokolden, birden fazla somatosensoriyel korteks katmanının nasıl etiketleneceği, bir prizma probunun nasıl implante edileceği ve başa takılan minyatür bir mikroskobun nasıl takılacağı iyi anlaşılmalıdır.