Çok Katlı Kortikal Ca

Bu prosedürün genel amacı, serbestçe hareket eden bir farede kalsiyum indikatörleri kullanarak kortikal nöronların birden çok tabakası boyunca nöronal aktivitenin eş zamanlı olarak görüntülenmesini sağlamak ve minyatürleştirilmiş, başa monte bir floresan mikroskop kullanarak sinir devresi işleyişini anlamaktır. Bu yöntem, sistem nörobilimi alanındaki "bilgi, korteksin birden fazla tabakası arasında nasıl yayılır" gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, genetik olarak kodlanmış geniş nöron popülasyonlarının birden fazla kortikal tabaka boyunca, serbestçe hareket eden hayvanlarda zaman içinde güvenilir bir şekilde görüntülenmesine olanak tanımasıdır.

Serbestçe hareket eden bir hayvanda, birden fazla kortikal tabakadan genetik olarak kodlanmış nöronları görselleştirmek için aşağıdaki prosedürlerin uygulanması gerekir; bu protokol, prizma prob implantasyonu, taban plakası kurulumu ve serbestçe hareket eden bir farede in vivo görüntülemeyi vurgulamaktadır. Bu prosedüre başlamak için, virüs enjeksiyonundan bir ila iki hafta sonra hayvanı stereotaksik cihaza yerleştirin ve prizma prob implant cerrahisi için probu %70 etanol ile dezenfekte edip lens kağıdıyla temizleyerek hazırlık yapın. Ardından, 0,5 milimetrelik bir freze ucuna sahip mikro matkap kullanarak yuvarlak bir kraniyotomi açın.

Kraniyotomi çapının prizma çapından sadece biraz daha büyük olduğundan emin olun. Ardından, prizma kortekse yerleştirildiğinde düz kenarı virüs enjeksiyon bölgesine bakacak ve 150 ila 200 mikron yarıçapında olacak şekilde kraniyotomiyi konumlandırın. Bundan sonra, durayı ince bir penset yardımıyla kaldırın.

Beyin dokusu açığa çıktıktan sonra, dokuyu her zaman steril salin ile nemli tutun. Bu, aynı zamanda doku üzerindeki basıncın korunmasını sağlayacaktır. Prizma prob yerleşimi sırasında beyin dokusundaki basıncı azaltmak için, stereotaksik cihazın elektrot tutucu koluna düz kenarlı bir disseksiyon bıçağı takarak bir yerleştirme yolu oluşturun.

Bıçak plakasının kafatası kavisin dik açıda ve virüs enjeksiyon kolonuna paralel bir düzlemde olacağı şekilde açılı olarak monte edin. Bıçağı dikkatlice kraniyotominin üzerine, iç medial kenarı boyunca ve virüs enjeksiyon bölgesinin yaklaşık 200 mikron lateraline, kesici kenarı posteriora bakacak şekilde konumlandırın. Bıçak ucu piana değdiğinde Z eksenini sıfırlayın.

Ardından, cihazı prizma probunun yerleştirileceği derinliğe kadar kademeli olarak indirin. Sonrasında, prizmanın ön kenarı için bir yol oluşturmak amacıyla bıçağı bir milimetre posteriora kaydırın. Bıçağı, stereotaksik kol mikromanipülatörünü kullanarak saniyede 10 mikronluk artışlarla yavaşça geri çekin ve insizyonun üzerine steril salin ile ıslatılmış bir parça jel köpük sünger yerleştirin.

Ardından, lens tutucuyu stereotaksik manipülatör koluna, önceki adımdaki bıçakla aynı açıda olacak şekilde sabitleyin. Prizmayı, düz tarafı kesinin üzerinde ve virüs enjeksiyon sütununa paralel olacak şekilde hizalayın. Prizma doğru açıya geldiğinde, bu prob için beyin yüzeyinden 1,1 mm'lik nihai bir Z seviyesine kadar, 10 mikronluk artışlarla kademeli olarak beyne indirin.

Kraniyotomideki prizmanın etrafında açıkta kalan tüm dokuları, 25 gauge bir iğne kullanarak, çok ince bir koruyucu elastomer yapıştırıcı tabakasıyla kapatın. Merceğin kraniyotomi içinde hareket etmesini önlemek için, elastomer yapıştırıcı kürlendikten sonra, prizma merceğinin camını elastomer yapıştırıcı tabakasının üzerindeki bitişik kafatasına sabitlemek amacıyla 25 gauge bir iğne ile biraz siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. Siyanoakrilat yapıştırıcı kürlendiğinde, mercek tutucusunu vidalarından çözün ve mikroskobu dikkatlice çıkarın.

Ardından, prizma probu güvenli bir şekilde implante edilmiş halde bırakmak için stereotaksik manipülatör kolunu yavaşça geri çekin. Çevredeki geri çekilmiş kas dokusuna temas etmeden, açıkta kalan kafatası yüzeyini kapatacak şekilde implantın etrafına diş akriliği veya siyanoakrilat yapıştırıcıdan bir katman uygulayın. Kafatasının geniş bir alanını bu kranial kapakla kapatmak, daha sonra taban plakası bağlantısına yardımcı olacaktır.

Ardından, silikon yapıştırıcı şırıngasındaki katalizör ve baz uçlarını karıştırın ve herhangi bir hasarı önlemek ve toz birikmesini engellemek için prob lensinin üst kısmını kapatacak şekilde prizma prob manşetinin içine elastomerden bir damla damlatın. Prizma probu implante ettikten bir hafta ila 10 gün sonra, implante edilen prizma prob aracılığıyla dokudaki virüs ekspresyonunu kontrol edin. Bunun için, implante edilen prizma prob lensinin yüzeyindeki silikon yapıştırıcı kapağı çıkarın.

Görüntüleme yüzeyinin temiz olduğundan emin olmak için prob lens yüzeyini inceleyin ve varsa kalıntıları lens kağıdı ve %70 etanol ile nazikçe temizleyin. Ardından, mikroskoba bir taban plakası takın ve taban plakasını konumunda tutmak için sabitleme vidasını sıkın. Daha sonra, mikroskobu stereotaksik mikromanipülatör kolundaki mikroskop tutucusuna sabitleyin.

Kavrayıcıyı, stereotaksik mikromanipülatör koluna monte edilebilen bir çubuğa takın. Ardından, stereotaksik mikromanipülatör kolunu kullanarak mikroskobu prizma prob lensinin üzerine konumlandırın. Prizma lensine hayvan tablasının yanından ve arkasından bakarak yönelimi görsel olarak kontrol edin.

Hem mikroskop objektifinin hem de prizma probunun optik ekseni hizalanmalıdır. Ardından, veri toplama yazılımını başlatın, projeyi seçin ve yazılım üzerinden mikroskop LED'ini açın. Stereotaksın manipülatör kolunu hareket ettirerek, veri toplama yazılımında implante edilmiş prizma probu lensinin üst fazına odaklanıp mikroskop hizalamasının kalitesini değerlendirin.

Doğru şekilde hizalandığında, prizma probu lensinin kenarları net görünmelidir. Dokunun içinde istenen odak düzlemini elde etmek için stereotaksik manipülatör kolunu kullanarak mikroskobun implante edilmiş prizma probu üzerindeki fiziksel mesafesini ayarlayın. Ardından, boşluğu kapatmak için taban plakasını akrilik kapağa kalıcı olarak sabitlemek için dental akrilik veya siyanoakrilik kullanın.

Taban plakasını hayvanın kafasına yapıştırırken, mikroskobun gövdesinin herhangi bir parçasına veya set vidasına yapıştırıcı uygulamamak kritik önem taşır. Şimdi, mikroskobu tutucudan serbest bırakın ve tutucuyu mikroskobun üzerinden geri çekin. Eğer siyanoakrilat veya başka bir şeffaf yapıştırıcı kullanıldıysa, deneyler sırasında elde edilecek gelecek görüntüleri kirletebilecek ortam ışığının kafa kapağına sızmasını önlemek için yapıştırıcının üzerini siyah oje veya bir kat siyah dental siman ile kapatın.

Ardından, implante edilmiş prizma probunu taban plakası kapağıyla koruyun. Bu işlemde, mikroskobu bilgisayara bağlı olan veri toplama kutusuna bağlayın ve veri toplama yazılımını başlatın. Daha sonra, taban plakası ayar vidasını saat yönünün tersine çevirip taban plakası kapağını kaldırarak kapağı çıkarın.

Mikroskobu hayvan üzerindeki taban plakasına yerleştirin. Mikroskobun, taban plakasındaki mıknatıslar yardımıyla yerine oturması gerekir. Ardından, hafif bir direnç hissedene kadar taban plakası set vidasını ilerletin.

Ardından, veri toplama için kullanılacak ve veri yakalama kare hızını da içeren veri toplama ayarlarını seçin. İyi bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için ayarları seçerken görüntü histogramını kontrol edin. Daha sonra, verileri toplamaya başlayın.

Kayıt tamamlandığında, taban plakası set vidasını gevşetin ve mikroskobu nazikçe yukarı çekerek taban plakasından ayırın. Ardından, taban plakası kapağını yerine takın ve taban plakası set vidasını nazikçe sıkın. Burada, mikroskobu üzerine monte edilmiş bir hayvanın, davranış arenasındaki nesnelerle serbestçe etkileşime girmesinin bir gösterimi yer almaktadır.

Sistemle yapılan uyanık davranış görüntüleme sırasında, fare üç farklı ortama maruz bırakıldığında somatosensör kortikal nöronların aktivitesi kaydedilmiştir. Birinci gün açık alan, ikinci ila dördüncü günler arası nesne aşinalığı ve beşinci gün yeni nesne uygulamaları yapılmıştır. Kalsiyum görüntü veri analiz yazılımı kullanılarak hücre ekstrasyonu gerçekleştirildikten sonra, hücre konumlarına karşılık gelen uzamsal filtreler, mikroskop kayıt verilerinin ortalama floresan yoğunluk projeksiyonu üzerine yerleştirilmiştir.

Beyaz kesikli bir çizgi; iki, üç ve beşinci katman hücrelerini birbirinden ayırır. Her bir katmandaki beşer hücreden elde edilen karşılık gelen kalsiyum izleri, hücrelerin iki farklı davranışsal bağlamdaki ateşleme modelini göstermektedir: Nesne aşinalığı ve yeni bir nesneye maruz kalma. Fare yeni bir nesneye maruz kaldığı gün, ikinci ve üçüncü katman hücreleri beşinci katman hücrelerine kıyasla daha aktifti.

Hayvan açık alan, nesne aşinalığı ve yeni nesne keşfi aşamalarındayken, yüzeysel varlık oyuncularından gelen hücre aktivitelerinin geri kalan grafikleri burada yer almaktadır. Uzmanlaşıldığında, her bir teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde bir saat içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, sistem nörobilimi araştırmacılarının, droning ve diğer hastalık nörofizyoloji modellerinde farklı davranış paradigmalarından yararlanarak farklı beyin bölgelerindeki spesifik hücre tiplerini keşfetmelerinin önünü açmaktadır.

Bu protokolden sonra, somatosensör korteksin çoklu katmanlarının nasıl etiketleneceği, bir prizma probunun nasıl implante edileceği ve başa monte edilen minyatür bir mikroskobun nasıl takılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olunmalıdır.